廖永娥潘 潔陸 苑劉春花孫 佳汪 洋李勇軍*

（1.貴州醫(yī)科大學(xué)，民族藥與中藥開(kāi)發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心／省部共建藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué)，貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng) 550004）

良附滴丸源自傳統(tǒng)名方良附方，由高良姜、香附組成，具有溫胃散寒、理氣止痛之功效，用于治療寒凝氣滯、脘腹脹滿、疼痛吐酸［1］，臨床上應(yīng)用于急慢性胃炎、胃潰瘍等疾病，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、止血、鎮(zhèn)痛等作用［2-5］。前期研究表明，良附滴丸中主要含有揮發(fā)油、黃酮［6］，但對(duì)前者報(bào)道較少，物質(zhì)基礎(chǔ)仍不明確，而且該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅收錄了高良姜中高良姜素的含量測(cè)定項(xiàng)目，無(wú)法全面反映其整體質(zhì)量。因此，考察揮發(fā)性成分對(duì)良附滴丸藥效物質(zhì)基礎(chǔ)闡釋與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升非常重要。

由于揮發(fā)油沸點(diǎn)低，具有揮發(fā)性，目前大多采用氣相色譜（GC）或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GCMS）法進(jìn)行分析，而在無(wú)對(duì)照品的情況下，氣相色譜-三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS／MS）法可實(shí)現(xiàn)對(duì)未知化合物分子離子、碎片離子的分析，用于定性檢測(cè)時(shí)更準(zhǔn)確可靠。因此，本實(shí)驗(yàn)首先采用GC-MS／MS 法對(duì)良附滴丸揮發(fā)性成分組成進(jìn)行分析，通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)合文獻(xiàn)檢索來(lái)推測(cè)結(jié)構(gòu)，并進(jìn)一步利用已知成分的對(duì)照品對(duì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對(duì)，再建立多指標(biāo)成分含量測(cè)定方法，以期為該類成分藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供參考。

1 材料

1.1 儀器 GC-MS-TQ8050 氣相色譜-三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀（日本島津公司）；AE-240 電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；ALLEGRA X-30R 勻速離心機(jī)（美國(guó) Beckman Coulter 公司）；CQ250A-TS 超聲波清洗機(jī)（上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器廠）。

1.2 試劑與藥物 良附滴丸按照標(biāo)準(zhǔn)制備工藝，由課題組自制（批號(hào)分別為S1-20210920、S2-20210924、S3-20210928）。桉葉油醇、芳樟醇、（－）-4-萜品醇、α-松油醇、石竹素、桃金娘烯醇對(duì)照品（批號(hào)分別為AF20032351、AF20072551、AF20081504、AF20081520、AF20112202、AF2108 1005，純度＞98%，成都埃法生物科技有限公司）；D-樟腦對(duì)照品（批號(hào)AF21120651，純度＞95%，成都埃法生物科技有限公司）；苯丙醛、芐基丙酮對(duì)照品（批號(hào)C12861588、C12940513，純度＞95%，上海麥克林生化科技有限公司）；香附烯酮對(duì)照品（批號(hào)20120705，純度＞98%，四川省維克奇生物科技有限公司）；α-香附酮對(duì)照品（批號(hào)S1007AS，純度＞98%，大連生物技術(shù)有限公司）；萘對(duì)照品（批號(hào)21050063，純度＞98%，壇墨質(zhì)檢-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心）。乙酸乙酯為分析純（天津市北辰方正試劑廠）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對(duì)照品溶液 精密稱取桉葉油醇、D-樟腦、芳樟醇、（－）-4-萜品醇、α-松油醇、苯丙醛、桃金娘烯醇、芐基丙酮、石竹素、香附烯酮、α-香附酮對(duì)照品適量，乙酸乙酯制成質(zhì)量濃度分別為1.146、0.968、1.360、1.188、1.040、1.007、1.005、1.046、0.946、1.000、1.001 mg／mL 的貯備液，再用乙酸乙酯逐級(jí)稀釋成系列質(zhì)量濃度，即得。

2.1.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取萘對(duì)照品10 mg，置于10 mL 量瓶中，乙酸乙酯定容至刻度，得質(zhì)量濃度為1 mg／mL 的貯備液，精密吸取0.5 mL 至25 mL 量瓶中，乙酸乙酯稀釋至5 μg／mL，即得。

2.1.3 供試品溶液 取本品適量，研細(xì)，精密稱取100 mg，加入100 μg／mL 內(nèi)標(biāo)溶液0.6 mL，乙酸乙酯定容至100 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理10 min，乙酸乙酯補(bǔ)足減失的質(zhì)量，混勻，吸取5 mL，12 000 r／min 離心10 min，取上清液，即得。

2.2 GC-MS／MS 分析條件

2.2.1 色譜 SH-StabiLwax 毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.32 mm，0.25 μm）；程序升溫（40 ℃保持2 min，10 ℃／min 升至100 ℃，4 ℃／min 升至155 ℃，3 ℃／min 升至180 ℃，10 ℃／min 升 至190 ℃保持1 min，30 ℃／min 升 至230 ℃保 持6 min）；進(jìn)樣口溫度220 ℃；載氣氦氣，體積流量6 mL／min；不分流；進(jìn)樣量1 μL。

2.2.2 質(zhì)譜 電子轟擊離子源；離子源溫度200 ℃；接口溫度230 ℃；檢測(cè)器電壓0.2 kV；溶劑延遲時(shí)間3 min；掃描模式Q3SCAN（用于組成分析）、Q3SIM（用于含量測(cè)定，具體見(jiàn)表1）；掃描范圍m／z30～300。

表1 Q3SIM 模式條件Tab.1 Q3SIM mode conditions

2.3 揮發(fā)性成分組成分析 取樣品（S1）適量，相關(guān)數(shù)據(jù)通過(guò)NINST20 譜圖庫(kù)進(jìn)行檢索，選擇匹配度高于80 的色譜峰，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)推測(cè)結(jié)構(gòu)，結(jié)果見(jiàn)表2。由此可知，共檢測(cè)出76 個(gè)化合物，其相對(duì)峰面積含量占揮發(fā)油總量的83.02%，其中來(lái)源于高良姜的共53 個(gè)，來(lái)源于醋香附的共43個(gè)，兩者共有峰20 個(gè)。再進(jìn)一步與對(duì)照品比對(duì)后確定了11 個(gè)，分別為桉葉油醇、D-樟腦、芳樟醇、（－）-4-萜品醇、α-松油醇、苯丙醛、桃金娘烯醇、芐基丙酮、石竹素、香附烯酮、α-香附酮，以芐基丙酮（26.34%）、苯丙醛（16.85%）、香附烯酮（4.96%）、桉葉油醇（3.45%）、香附子烯（3.17%）、α-松油醇（2.66%）為主。

表2 良附滴丸中揮發(fā)性成分Tab.2 Volatile constituents in Liangfu Dropping Pills

2.4 揮發(fā)性成分含量測(cè)定

2.4.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取供試品、對(duì)照品溶液適量，在“2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1，可知各揮發(fā)性成分的分離度均大于1.5。

圖1 各揮發(fā)性成分GC-MS／MS 總離子流圖Fig.1 GC-MS／MS total ion current chromatograms of various volatile constituents

2.4.2 線性關(guān)系考察 取“2.1.1” 項(xiàng)下系列質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液，在“2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），對(duì)照品、內(nèi)標(biāo)峰面積比值為縱坐標(biāo)（Y），通過(guò)加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸（權(quán)重系數(shù)1／X），并以信噪比S／N ＝3 為檢測(cè)限（LOD），S／N ＝10 為定量限（LOQ），結(jié)果見(jiàn)表3，可知各揮發(fā)性成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 各揮發(fā)性成分線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various volatile constituents

2.4.3 精密度試驗(yàn) 取“2.4.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量，在“2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得桉葉油醇、D-樟腦、芳樟醇、（－）-4-萜品醇、α-松油醇、苯丙醛、桃金娘烯醇、芐基丙酮、石竹素、香附稀 酮、α-香附酮峰面積RSD 分別為1.5%、0.42%、0.67%、0.79%、0.34%、0.15%、0.97%、0.41%、0.39%、0.54%、0.95%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取同一批本品100 mg，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，于0、1、2、4、8、12 h 在“2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得桉葉油醇、D-樟腦、芳樟醇、（－）-4-萜品醇、α-松油醇、苯丙醛、桃金娘烯醇、芐基丙酮、石竹素、香附稀酮、α-香附酮峰面積RSD 分別為2.8%、2.6%、1.8%、2.5%、2.7%、1.7%、2.9%、2.4%、2.2%、2.8%、2.8%，表明溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批本品100 mg，共6 份，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得桉葉油醇、D-樟腦、芳樟醇、（－）-4-萜品醇、α-松油醇、苯丙醛、桃金娘烯醇、芐基丙酮、石竹素、香附稀 酮、α-香附酮峰面積RSD 分別為2.7%、2.3%、2.6%、2.2%、2.5%、2.0%、1.9%、2.0%、2.6%、0.99%、1.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取同一批本品6份，每份50 mg，以重復(fù)性試驗(yàn)中的平均含量為基準(zhǔn)測(cè)定各揮發(fā)性成分含量，按1∶1 比例加入對(duì)照品溶液，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，桉葉油醇、D-樟腦、芳樟醇、（－）-4-萜品醇、α-松油醇、苯丙醛、桃金娘烯醇、芐基丙酮、石竹素、香附稀酮、α-香附酮平均加樣回收率分別為95.24%、100.80%、98.50%、100.88%、99.84%、100.27%、95.93%、104.36%、104.27%、99.73%、96.77%，RSD 分別為2.96%、2.88%、2.97%、2.93%、1.50%、2.66%、2.88%、2.39%、1.66%、2.68%、2.45%。

2.4.7 樣品含量測(cè)定 精密稱取3 批本品，每批3 份，每份100 mg，按“2.1.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2” 項(xiàng)條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 各揮發(fā)性成分含量測(cè)定結(jié)果（%， n＝3）Tab.4 Results of content determination of various volatile constituents（%， n＝3）

3 討論

課題組前期發(fā)現(xiàn)，良附滴丸具有顯著的抗胃潰瘍作用，其機(jī)制與降低炎癥反應(yīng)介質(zhì)MDA、TNFα、IL-6 水平，提高機(jī)體NO、SOD、PGE2 等胃黏膜保護(hù)因子水平有關(guān)［1］。研究表明，良附滴丸中香附子烯［7-8］、α-香附酮、香附烯酮［9-10］、桉葉油醇、α-松油醇、芳樟醇［11-12］、（－ ）-4-萜 品醇［13-14］、桃金娘烯醇［15］、β-石竹烯［16-17］等揮發(fā)油均具有抗炎、抗氧化損傷等藥理活性，故推測(cè)良附滴丸中該類成分也可能是其抗胃潰瘍作用的潛在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)基于GC-MS／MS 法，首先采用Q3SCAN模式對(duì)良附滴丸揮發(fā)性成分進(jìn)行定性分析，結(jié)果共檢測(cè)出酮類、醛類、萜類、醇類、烴類等共76 種，其相對(duì)峰面積含量占揮發(fā)油總量的83.02%，其中芐基丙酮、苯丙醛含量最高，與文獻(xiàn)［18］報(bào)道一致。因此，選擇良附滴丸主要揮發(fā)性成分芐基丙酮、苯丙醛、D-樟腦，以及可能發(fā)揮藥效的成分桉葉油醇、芳樟醇、（－）-4-萜品醇、α-松油醇、桃金娘烯醇、石竹素、香附烯酮、α-香附酮作為指標(biāo)，建立了基于SIM 掃描模式的GC-MS／MS 法測(cè)定其含量，該方法重復(fù)性好，專屬性強(qiáng)，可用于該制劑的質(zhì)量控制。