呂志陽，陳 靜，薛 原，張曉蝶，楊佳雯，湯春艷，陳 璟，顧雪梅，楊雨微

（南京中醫(yī)藥大學翰林學院，江蘇 泰州 225300）

祖師麻為瑞香科植物黃瑞香、陜甘瑞香、凹葉瑞香的莖皮和根皮，是西北民間常用藥，用于治療風濕痹痛、活血止痛、四肢麻木、跌打損傷、風濕性關節(jié)炎等［1-2］，瑞香素是其發(fā)揮鎮(zhèn)痛、抗炎功效的主要成分。由于祖師麻有小毒，故大多外用，上市制劑主要為貼劑和軟膏，但在應用過程中會有皮膚刺激性，常表現(xiàn)為丘疹等不良反應。有研究采用甘草配伍，可緩解祖師麻毒性和刺激性；課題組前期也發(fā)現(xiàn)，甘草配伍祖師麻后，后者抗炎、鎮(zhèn)痛效果更好［3］。

復方祖師麻制劑由祖師麻、石菖蒲、梔子、甘草4 味中藥組成，其中軟膏劑型外用效果較好，但存在劑量不易控制、使用不便等問題。本實驗以方中君藥祖師麻主要成分瑞香素為評價指標，采用Box-Behnken 響應面法優(yōu)化提取工藝，并選擇高分子材料聚丙烯酸鈉NP-700 作為骨架結構，正交試驗優(yōu)化基質處方，再篩選透皮吸收促進劑，最終制得性質優(yōu)良的復方祖師麻凝膠貼劑，可為后續(xù)相關開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀（型號Agilent 1260，美國安捷倫公司）；電子天平（型號Yiii407102，上海菁海儀器有限公司）；旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器有限公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（型號HHS，金壇市醫(yī)療儀器廠）；超聲波清洗儀（型號KH-500B，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；電子分析天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；藥物透皮擴散試驗儀（型號RYJ-12B，上海黃海藥檢儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 祖師麻（甘肅泰康制藥有限責任公司，批號 110900-201006）；甘草（批號200305）、石菖蒲（批號200915）、梔子（批號200822），均購自南通三越中藥飲片有限公司，均經(jīng)南京中醫(yī)藥大學藥學院陳建偉教授鑒定為正品。瑞香素對照品（成都鈉鈳鋰生物科技有限公司，批號nkl20090207）；瑞香素原料藥（上海源葉生物科技有限公司，批號B21084）。

無水乙醇（批號10009218，國藥集團化學試劑有限公司）；生理鹽水（批號191227-10C，江蘇淮安雙鶴藥業(yè)有限責任公司）；氮酮［批號59227-89-3，阿拉丁試劑（上海）有限公司］；聚丙烯酸鈉NP-700（批號9Z1470A，廣州佳樹化工有限公司）；丙三醇（批號20141201，廣東光華科技股份有限公司）；甘氨酸鋁（批號13682-92-3，上海麥克林生化科技有限公司）；酒石酸（批號526-83-0，上海麥克林生化科技有限公司）。無紡布膏藥貼布（批號20210317X，河北省榮軒浩宇有限公司）。

1.3 動物 ICR 小鼠，雄性，體質量（20±2）g，購自南京市江寧區(qū)青龍山動物繁殖場，動物使用許可證號SYXK（浙）2014-001。

2 方法與結果

2.1 瑞香素含量測定

2.1.1 色譜條件 Agilent C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相甲醇-0.5% 磷酸（48∶52）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長327 nm；進樣量10 μL。理論塔板數(shù)按瑞香素計算，應不低于3 000。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取干燥至恒重的瑞香素對照品5.14 mg，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 稱取祖師麻30 g、甘草20 g，置于圓底燒瓶中，加入8 倍量75%乙醇回流提取2 h，濾過，旋蒸，真空干燥，超聲溶解20 min，過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.1.4 方法學考察

2.1.4.1 線性關系考察 精密吸取對照品溶液2.5 mL，甲醇制成系列質量濃度，分別精密吸取10 μL，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，得方程為Y＝23.608X－38.554（R2＝0.999 9），在32.18～514 μg／mL 范圍內線性關系良好。

2.1.4.2 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10 μL，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得瑞香素峰面積RSD 為3.96%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.3 重復性試驗 精密稱取祖師麻、甘草各6 份，按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取10 μL，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得瑞香素峰面積RSD 為4.29%，表明該方法重復性良好。

2.1.4.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液適量，于0、1、2、4、8 h 在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，測得瑞香素峰面積RSD 為0.25%，表明溶液在8 h 內穩(wěn)定性良好。

2.1.4.5 加樣回收率試驗 精密稱取祖師麻、甘草各6 份，加入約20 mg 瑞香素對照品，按“2.1.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，瑞香素平均加樣回收率為98.21%，RSD 為4.66%。

2.2 出膏率測定 取供試品溶液35 mL 至已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，在60 ℃下干燥45 min后置于干燥器中，冷卻30 min，精密稱定質量，計算出膏率，公式為出膏率＝（干膏質量／藥材總質量）×100%。

2.3 提取工藝優(yōu)化 參考預實驗結果，選擇乙醇體積分數(shù)（A，60%～80%）、乙醇用量（B，6～8倍）、提取時間（C，1～2 h）作為影響因素，瑞香素含量、浸膏得率綜合評分Y（Y＝瑞香素含量×0.5＋浸膏得率×0.5）作為評價指標，采用Design-Expert 8.06 軟件進行Box-Behnken 響應面設計，優(yōu)化提取工藝，因素水平見表1，結果見表2。

表1 Box-Behnken 響應面法因素水平Tab.1 Factors and levels for Box-Behnken response surface method

表2 Box-Behnken 響應面法設計與結果Tab.2 Design and results of Box-Behnken response surface method

再采用Design-Expert 8.06 軟件對表2 數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合，得方程為Y＝7.04－0.093A＋0.28B＋0.28C－ 0.054AB－ 0.19AC＋0.015BC－0.29A2－0.29B2＋0.12C2，方差分析見表3。由此可知，模型F＝5.18，P＜0.05，表明具有高度顯著性；失擬項P＝0.198 6＞0.05，表明未知因素對結果影響較小，擬合度良好；一次項A、B無顯著影響（P＞0.05），C有顯著影響（P＜0.05），影響程度依次為C＞B＞A；各交互項、二次項均無顯著影響（P＞0.05）；模型R2＝0.869 4，表明含量測定值與預測值之間的一致性良好；變異系數(shù)（CV）＝3.17%＜5%，校正系數(shù)，表明模型可靠，可用于分析預測［4］。

表3 Box-Behnken 響應面法方差分析Tab.3 Analysis of variance for Box-Behnken response surface method

響應面分析見圖1。由此可知，固定提取時間不變時，乙醇體積分數(shù)曲線變化趨勢比乙醇用量更明顯，但前者超過70% 后開始下降，可能原因為其過高時會導致部分瑞香素被破壞，使得含量降低，同時溶出其他成分，出膏率隨之減少；固定乙醇用量不變時，乙醇體積分數(shù)越低，提取時間越長，綜合評分越高，并且提取2 h 時最高；各因素影響程度依次為C＞A＞B。

圖1 各因素響應面圖Fig.1 Response surface plots for various factors

最終確定，最優(yōu)提取工藝為乙醇體積分數(shù)65%，乙醇用量8 倍，提取時間2 h，綜合評分為7.489。按上述優(yōu)化工藝進行3 批驗證試驗，測得綜合評分為7.851，與預測值7.489 接近（偏差小于5%），表明模型擬合效果良好。

2.4 基質處方優(yōu)化

2.4.1 凝膠貼制備 取2.5 g 聚丙烯酸鈉、17.5 g丙三醇，置于同一燒杯中，室溫溶脹2 h，作為A相；取提取物粗粉2 g，加入A 相混勻溶解，作為B 相；取0.1 g 酒石酸加水溶解，再加入0.1 g 甘氨酸鋁，混合均勻［5］，作為C 相，將C 相倒入B相中，在磁力攪拌器上300 r／min 攪拌3 min，隨后迅速均勻涂在無紡布上，厚度約1.5 mm，室溫固化24 h，蓋上背襯層，即得［6］。

2.4.2 評價指標測定 以綜合感官得分（涂展性、均勻性、皮膚追隨性、殘留性）及初黏力的總分為評價指標，其中綜合感官每項指標最高15分，初黏力40 分，滿分100 分，評分標準［7-9］見表4。采用2020 年版《中國藥典》 四部通則0952 項黏附力測定法（第一法，即滾球斜坡停止法）測定初黏力，將凝膠貼在溫度18～25 ℃、相對濕度40%～70%下靜置2 h 后固定于傾斜板上，上端位于傾斜板水平線的下線位置，黏性面向上，沿斜面方向的貼劑長度不超過5 cm，需完整貼合，鋼球放在水平線的上線位置，沿斜面自由滾下，重復3次，要求鋼球全部粘附，記錄可粘住的最大鋼球號。

表4 評分標準Tab.4 Scoring standards

2.4.3 正交試驗 預實驗發(fā)現(xiàn)，丙三醇用量在15～20 g 范圍內具有較好的保濕性；聚丙烯酸鈉NP-700 用量在1.5～3.5 g 范圍內較易涂布，而且具有較好的內聚力；甘氨酸鋁用量在0.05～0.15 g范圍內較易涂布；酒石酸用量在0.05～0.15 g 范圍內具有較好的黏性。因此，本實驗選擇丙三醇用量（A）、聚丙烯酸鈉NP-700 用量（B）、甘氨酸鋁用量（C）、酒石酸用量（D）作為影響因素，正交試驗優(yōu)化基質處方，因素水平見表5，結果見表6～7。由此可知，各因素均有顯著影響。

表5 正交試驗因素水平Tab.5 Factors and levels for orthogonal test

表6 正交試驗設計與結果Tab.6 Design and results of orthogonal test

最終確定，最優(yōu)基質處方為A2B1C2D1，即丙三醇用量17.5 g，聚丙烯酸鈉NP-700 用量1.5 g，甘氨酸鋁用量0.10 g，酒石酸用量0.05 g。

2.4.4 驗證試驗 按“2.4.3” 項下優(yōu)化基質處方制備3 批樣品，計算總分［10］，結果見表8。由此可知，該工藝穩(wěn)定可行，并且所得凝膠貼外觀光滑平整，無顆粒和氣泡，黏性較好。

表8 驗證試驗結果（n＝3）Tab.8 Results of verification tests（n＝3）

表7 正交試驗方差分析Tab.7 Analysis of variance for orthogonal test

2.5 促滲劑篩選 凝膠貼需加入透皮吸收促進劑以提高藥物透皮吸收效果，本實驗以瑞香素累積滲透量為指標，選擇經(jīng)典輔料氮酮作為促滲劑，考察其用量在5%、3%、1%時的促滲效果［11］。

2.5.1 離體皮膚制備 將小鼠脫頸椎處死，刮凈腹部毛發(fā)后取下皮膚，去除皮下脂肪和血管，生理鹽水清洗干凈，置于－20 ℃冰箱中冷藏。透皮實驗前取出，放到37 ℃生理鹽水中自然解凍，浸泡30 min，再用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干備用［12］。

2.5.2 操作步驟 采用RYJ-12B 型藥物透皮擴散試驗儀、Franz 擴散池，設置溫度為（37±0.2）℃，透皮面積為2.2 cm2，接受池體積為6.5 mL，接受液為生理鹽水-無水乙醇（50∶50）。將小鼠離體皮膚固定于接受池上，取凝膠貼1.7 g（有效透皮面積2.2 cm2），平行6 份，在滲透擴散裝置的擴散室與接受室之間固定皮膚，外側朝向擴散室，將凝膠貼固定［13］，接收室中注入接收液，使液面完全與皮膚內層接觸，在恒溫（37 ℃）、300 r／min 下磁力攪拌，于1、2、4、6、8、12 h 各吸取2 mL透皮接收液，并補加同體積新鮮接收液，濾過，重復6 次，接受液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。以單位面積累積滲透量為縱坐標，時間為橫坐標繪制累積滲透曲線，見圖2。

圖2 瑞香素累積滲透曲線（n＝6）Fig.2 Accumulative permeability curves for daphnetin（n＝6）

2.5.3 結果分析 由圖2 可知，加入氮酮后瑞香素累積滲透量明顯升高，不同用量下其促滲效果依次5%＞3%＞1%，即5%氮酮累積滲透量最高，達66.8%，與不加氮酮相比提高近3 倍，故選擇其作為透皮吸收促進劑。

3 討論

復方祖師麻制劑包含祖師麻、石菖蒲、梔子、甘草4 味藥材，本實驗在優(yōu)化其提取工藝過程中選擇君藥祖師麻有效成分瑞香素作為評價指標，主要是因為石菖蒲中細辛醚類成分為揮發(fā)油，常需單獨提取后采用氣相色譜檢測；梔子中梔子苷醇得率較高；甘草酸銨在不同提取條件下含量變化不明顯。再采用Box-Behnken 法優(yōu)化提取工藝，可準確預測提取結果，并且浸提效率高，提取完全。

凝膠貼劑因其使用方便、藥物吸收良好等優(yōu)點，已成為經(jīng)皮給藥制劑的研發(fā)熱點，但在制備過程中常出現(xiàn)黏附力及彈性不夠、貼敷易滑落等問題。本實驗選擇丙三醇、聚丙烯酸鈉NP-700、甘氨酸鋁、酒石酸等輔料制備復方祖師麻凝膠貼，其配比及加入順序均會影響制劑成形性，結果發(fā)現(xiàn)攪拌時間、速度、溫度對其性狀影響最大，故把握好攪拌方法是關鍵所在［14-16］。

復方祖師麻凝膠貼作為經(jīng)皮給藥系統(tǒng)，藥物釋放、透皮行為是其吸收的前提條件。本實驗選擇離體動物皮膚作為對象，氮酮作為透皮吸收促進劑，發(fā)現(xiàn)其加入量為凝膠貼質量的5%時，12 h 內累積釋放率達66.8%。但中藥復方中氮酮用量一般不超過5%，故后續(xù)考慮采用多元促滲體系，可減少促透劑用量，也能起到更好的透皮吸收效果。同時，也可采用薄荷腦［17］、冰片［18］等中藥揮發(fā)性成分作為透皮吸收促進劑，既可體現(xiàn)中藥制劑“藥輔合一” 理念，也可減少輔料用量，提高安全性。