劉 沛，常金花，薛禾菲，王雨欣，徐 林，張 領(lǐng)，劉翠哲，周劍宇

（承德醫(yī)學院，河北省神經(jīng)損傷與修復重點實驗室，河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，河北 承德 067000）

固體分散體是改善難溶性藥物口服生物利用度的重要策略之一［1-3］，制備工藝是其生產(chǎn)過程中的重要因素，同一藥物制備工藝不同，其固體分散體性質(zhì)也會有所差異。目前，相關(guān)研究大多集中于單一工藝上，故對多種工藝之間的差異，以及各工藝所得固體分散體的性質(zhì)值得深入探討。

薯蕷皂苷元廣泛存在于豆科、薯蕷科植物中，難溶于水，可溶于甲醇、石油醚等有機溶劑［4］，具有抗癌、免疫調(diào)節(jié)、心血管保護、降血脂等多種藥理作用［5］，但該成分具有強疏水性和低水溶性，導致生物利用度較低。Soluplus 具有兩親性，有著玻璃轉(zhuǎn)化溫度低、毒性小、熱穩(wěn)定性好的特點［6］，是德國巴斯夫公司在2010 年專門設(shè)計用于通過熱熔擠出技術(shù)生成難溶性藥物固體分散體的載體［7］。為了提高薯蕷皂苷元溶解性和生物利用度，本實驗以Soluplus 為載體，分別采用共沉淀法、微波淬冷法、冷凍干燥法制備固體分散體，對其溶出行為、物相特征進行考察，再通過測定接觸角擬合曲線方程來揭示該劑型溶解機理，并對其進行藥動學研究，以期為其他難溶性藥物固體分散體的制備提供新思路。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Waters ACQUITY UPLC H-Class 超高效液相色譜儀［沃特世科技（上海）有限公司］；Triple Quad 5500 系統(tǒng)質(zhì)譜儀（美國SCIEX 公司）；AG-245 電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；RC806 溶出試驗儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）；DSC-250 差示掃描量熱分析儀（美國TA 儀器公司）；Tensor 27 傅里葉變換紅外光譜儀（德國Bruker 公司）；Jeol-JSM-7500F 掃描電鏡（日本電子株式會社）；PW3040／60 X-射線粉末衍射儀（荷蘭帕納科公司）。

1.2 試劑與藥物 薯蕷皂苷元對照品（批號111539-200001，中國食品藥品檢定研究院）；薯蕷皂苷元原料藥（批號C27H4203，南京春秋生物工程有限公司）。Soluplus（德國巴斯夫公司）；十二烷基硫酸鈉（SDS，天津市福晨化學試劑廠）。色譜純乙腈、甲醇（美國 Meridian Medical Technologies 公司）；質(zhì)譜純乙腈、甲醇（美國賽默飛公司）；其他試劑均為分析純；水為娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團有限公司）或屈臣氏蒸餾水［屈臣氏集團（香港）有限公司］。

1.3 動物 健康SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量180～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2016-0006，實驗前在實驗室條件下適應10 d，自由喂養(yǎng)標準鼠糧和無菌水，實驗開始時禁食12 h。所有動物相關(guān)方案均經(jīng)承德醫(yī)學院動物倫理實驗委員會批準，并符合《國家實驗動物使用法》 要求（倫理批準號CDMULAC-20180410016）。

2 方法與結(jié)果

2.1 固體分散體制備

2.1.1 色譜條件和方法學考察 Diamonsil Plus C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈-水（84∶16）；體積流量1 mL／min；柱溫30 ℃；檢測波長203 nm。在此條件下進行線性關(guān)系、專屬性考察及精密度、重復性、穩(wěn)定性、加樣回收率試驗，結(jié)果顯示該方法簡便靈敏，穩(wěn)定可靠。

2.1.2 溶解度測定 在EP 管中加入4 mL 水、過量固體分散體，置于恒溫氣浴振蕩器中，在25 ℃下振蕩24 h 后取出，15 000 r／min 離心10 min，取上清液，過0.45 μm 微孔濾膜，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定。

2.1.3 溶出度測定 在漏槽條件下，取原料藥、物理混合物、固體分散體適量（相當于5 mg 薯蕷皂苷元），按照2020 年版《中國藥典》 二部附錄XC 第二法，以900 mL 0.1% SDS 溶液為介質(zhì)，在37 ℃、100 r／min 下 于5、15、30、45、60、90、120 min 各取樣5 mL，0.45 μm 微孔濾膜過濾，在“2.1.1” 項色譜條件下進樣測定，同時補充等量同溫介質(zhì)。

2.1.4 制備方法

2.1.4.1 共沉淀法 將原料藥與Soluplus 分別按1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12 比例精密稱定質(zhì)量，無水乙醇超聲至完全溶解，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上揮干溶劑后冷凍30 min，置于50 ℃烘箱中干燥過夜后取出，粉碎，過80 目篩，即得，按“2.1.3” 項下方法測定溶出度，繪制體外溶出曲線，見圖1A。

2.1.4.2 微波淬冷法 參考文獻［8］報道，將原料藥與Soluplus 分別按1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12 比例精密稱定質(zhì)量，裝到真空袋中搖勻5 min 以盡量使兩者混勻，置于坩堝中，放入微波爐中，高火（功率700 W）加熱10 min 后趁熱取出，－196 ℃液氮淬冷使其固化，轉(zhuǎn)移至真空干燥箱中，取出，研細，過80 目篩，即得，按“2.1.3” 項下方法測定溶出度，繪制體外溶出曲線，見圖1B。

2.1.4.3 冷凍干燥法 將原料藥與Soluplus 分別按1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12 比例精密稱定質(zhì)量，溶于2%乙醇中，攪拌均勻后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，保鮮膜封口，用針頭扎出密集細小的孔，置于冷凍干燥機中48 h 后取出，混勻，研細，過80 目篩，即得，按“2.1.3” 項下方法測定溶出度，繪制體外溶出曲線，見圖1C。

圖1 不同藥載比下薯蕷皂苷元體外溶出曲線（±s， n＝3）Fig.1 In vitro dissolution curves for diosgenin under different drug-carrier ratios（±s， n＝3）

2.1.4.4 結(jié)果分析 由圖1 可知，藥載比為1∶10 時溶出度最高，故以此比例制備固體分散體。

2.1.5 驗證試驗 按一定比例精密稱取已過80 目篩的原料藥和Soluplus，研磨后裝到真空袋中，混勻，即得物理混合物。按“2.1.4.4” 項下最優(yōu)藥載比制備固體分散體、物理混合物各3 批，測定溶解度、累積溶出度，結(jié)果見圖2。

圖2 薯蕷皂苷元固體分散體溶解度（A）、累積溶出度（B）（±s， n＝3）Fig.2 Solubilities（A）and accumulative dissolution rates（B）of diosgenin solid dispersions（±s，n＝3）

由圖2A 可知，原料藥、物理混合物溶解度幾乎檢測不到，而在固體分散體中前者溶解度明顯提高，依次為共沉淀法所得＞微波淬冷法所得＞冷凍干燥法所得。由圖2B 可知，在0.1% SDS 溶液中固體分散體溶出度明顯高于原料藥、物理混合物，其原因可能是藥物在溶出介質(zhì)中的潤濕性的改善［9］及藥物從結(jié)晶狀態(tài)到無定形態(tài)的轉(zhuǎn)變［10］。Shi等［11］報道，Soluplus 可通過自膠束化作用，在過飽和溶液中溶解藥物并抑制其結(jié)晶。本研究發(fā)現(xiàn)，固體分散體中Soluplus 質(zhì)量濃度為61 mg／L，高于其臨界膠束濃度，從而也可能通過膠束形成來穩(wěn)定地提高薯蕷皂苷元溶出。

2.2 物相特征研究

2.2.1 差示掃描量熱分析（DSC）取原料藥、Soluplus、物理混合物、固體分散體各約5 mg，精密稱定，裝入鋁坩堝中，以空坩堝為參比進行DSC分析。設(shè)定工作條件為掃描速度10 ℃／min；N2吹掃氣體積流量40 mL／min；N2保護氣體積流量60 mL／min；掃描范圍25～300 ℃，結(jié)果見圖3。

圖3 各樣品DSC 曲線Fig.3 DSC curves for various samples

由此可知，在213.67 ℃時原料藥出現(xiàn)1 個明顯的吸熱峰，表明它為晶體結(jié)構(gòu)；共沉淀法、微波淬冷法所得固體分散體中原料藥吸熱峰消失，推測它可能與載體混溶而形成無定形態(tài)，并且與Soluplus 的相溶性降低了其分子流動性，從而改善了物理穩(wěn)定性；冷凍干燥法所得固體分散體中存在2 個以上吸熱峰，可通過吸熱過程失去溶劑，從而達到穩(wěn)定的晶體形式，可能是因為制備時將原料藥溶于含2%乙醇的水中而發(fā)生重結(jié)晶，導致表現(xiàn)出熔融介導的多態(tài)性，并且在158.6 ℃下熔融吸熱后在160.8 ℃左右出現(xiàn)小放熱，此時原料藥再結(jié)晶成更穩(wěn)定的形式，而168.7 ℃的第2 次吸熱對應穩(wěn)定形態(tài)的熔化；理論上，物理混合物應在213 ℃左右呈現(xiàn)原料藥結(jié)晶熔化過程的吸熱峰，但本實驗并未發(fā)現(xiàn)這一點，可能是由于它在DSC 程序升溫時先熔融的載體成為原料藥良好的溶劑，使其到達熔點前就已逐漸溶解在熔融載體中（類似于采用熔融法制備固體分散體，原料藥以分子狀態(tài)溶解在Soluplus 中），或者只是藥物結(jié)晶性受到Soluplus 的抑制而使原料藥特征吸熱峰消失，從而導致物理混合物、固體分散體DSC 曲線相似［12］。

2.2.2 粉末X 射線衍射（PXRD）取原料藥、Soluplus、物理混合物、固體分散體適量，設(shè)定分析條件為Cu 靶；波長0.154 0 nm；管流強度40 mA；管電壓40 kV；掃描角度10°～60°；步長0.02°；掃描頻率8°／min，結(jié)果見圖4。

圖4 各樣品PXRD 圖Fig.4 PXRD spectra for various samples

由此可知，原料藥在5°～20°范圍內(nèi)有特征的晶體衍射峰，分別位于7.14°、14.22°、14.90°、16.08°、16.98°、17.78°、18.64°；物理混合物中可清楚觀察到原料藥所有主要特征晶體峰；共沉淀法、微波淬冷法所得固體分散體中原料藥晶體特征峰消失，表明載體與原料藥之間的相互作用可有效將藥物晶體狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)闊o定形態(tài)，但兩者衍射峰光暈不同，說明制備工藝的差異會導致整個體系的分子結(jié)構(gòu)不同；冷凍干燥法所得固體分散體中仍存在部分原料藥晶體衍射峰，表明它在冷凍過程中發(fā)生重結(jié)晶，與“2.2.1” 項下結(jié)果一致。

2.2.3 掃描電鏡（SEM）取原料藥、Soluplus、物理混合物、固體分散體適量，涂于干凈的銅片上，噴金后觀察其表面形態(tài)，結(jié)果見圖5。由此可知，原料藥呈棒狀或粒狀結(jié)晶結(jié)構(gòu)；Soluplus 以無定形態(tài)存在；物理混合物中可觀察到原料藥晶體出現(xiàn)在載體中，而固體分散體中未發(fā)現(xiàn)，表明它以無定形態(tài)存在于固體分散體中。

2.2.4 傅里葉紅外光譜（FTIR）取原料藥、Soluplus、物理混合物、固體分散體適量，KBr 壓片，在4 000～400 cm－1波數(shù)范圍內(nèi)進行FTIR 分析，結(jié)果見圖6。

圖6 各樣品FTIR 圖Fig.6 FTIR spectra for various samples

由此可知，原料藥特征峰（cm－1）存在3 452.2（-OH）、1 241.5、1 053.1（3β-OH，Δ5）、980.4、918.7 ＜897.4、866.3（25R螺甾烷）；Soluplus 存在-OH、O ＝C-S-、O ＝C-C ＝C-羰基的伸縮振動特征峰，分別位于3 465.3、1 739.2、1 637.7 cm－1；物理混合物紅外光譜圖與原料藥基本相似，后者特征峰基本都存在，表明藥物與載體之間只是簡單混合，并沒有發(fā)生相互作用；在固體分散體中原料藥羥基峰發(fā)生了位移，提示藥物與載體之間可能存在氫鍵，并且原料藥特征峰3 452.2（-OH）的小尖峰消失，與Soluplus 的羥基峰合并為1 個寬鈍的吸收峰，位于3 459.8 cm－1，-OH 的消失表明原料藥羥基與Soluplus 羰基（氫鍵受體）之間存在分子間氫鍵。值得注意的是，藥物與載體之間的相互作用有利于固體分散，因為它不僅可抑制藥物結(jié)晶，還能增強藥物在親水性輔料中的固溶度［13］。

2.2.5 水接觸角測定 取原料藥、Soluplus、物理混合物、固體分散體適量，在2 000 psi（1 psi ＝6.895 kPa）壓力下壓片，采用Theta Flex 接觸角分析儀，以純化水為媒介，采用躺滴法對潤濕性進行分析，設(shè)定測試條件為3 μL 純化水；平衡時間0.8 s；采樣時間間隔0.008 4 s，結(jié)果見圖7。

圖7 各樣品水接觸角Fig.7 Water contact angles of various samples

由此可知，水接觸角隨著時間延長逐漸變?。慌c載體比較，原料藥水接觸角明顯增大，說明水不易潤濕水溶性較差的分子；物理混合物水接觸角小于原料藥，但大于載體，表明載體加入增加了原料藥在物理混合物中的潤濕性；共沉淀法、微波淬冷法所得固體分散體水接觸角低于物理混合物、原料藥，表明原料藥無定形態(tài)的潤濕性高于晶態(tài)，并且前者水接觸角小于后者，即兩者雖然均是無定形態(tài)，但前者具有更好的潤濕性；冷凍干燥法所得固體分散體水接觸角小于原料藥、物理混合物，但原料藥在冷凍過程中發(fā)生了重結(jié)晶，表明其潤濕性仍明顯弱于其他2 種制備工藝所得固體分散體。

再進一步擬合水接觸角曲線，結(jié)果見圖8。由此可知，固體分散體R2降低，表明原料藥與載體的分子間相互作用對其潤濕性有一定影響。

當系數(shù)、指數(shù)均接近純載體方程中的圖形時，溶出過程由載體控制；當兩者均接近藥物方程中的圖形時，溶出過程由藥物控制；在兩者分別接近不同的條件下時，可得到藥物、載體控制擴散的溶出過程［14］。圖8 顯示，共沉淀法、微波淬冷法所得固體分散體系數(shù)、指數(shù)更接近載體Soluplus 擬合方程，表明它們屬于載體控制擴散；冷凍干燥法所得固體分散體兩者均更接近原料藥擬合方程，表明它屬于藥物控制擴散。

圖8 薯蕷皂苷元固體分散體水接觸角曲線Fig.8 Curves for water contact angles of diosgenin solid dispersions

2.3 體內(nèi)藥動學研究

2.3.1 分組、給藥與采血 30 只大鼠隨機分為5組，每組6 只，分別灌胃給予薯蕷皂苷元、物理混合物、3 種制備工藝所得固體分散體（均用含0.5% CMC-Na 的生理鹽水攪拌均勻，配制成混懸液，給藥劑量均為100 mg／kg），于0、0.083、0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、6、8、12、24、36、48、72 h 眼眶取血，置于肝素處理的EP 管中，10 000 r／min 離心10 min 得血漿，保存于－80 ℃冰箱中。

2.3.2 UPLC-MS／MS 分析

2.3.2.1 色譜條件 Waters ACQUITYUPLC?BEH C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流動相乙腈-水（含0.03% 甲酸）（80∶20）；體積流量0.3 mL／min；柱溫35 ℃；樣品溫度4 ℃；進樣量2 μL。

2.3.2.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源（ESI）；正離子掃描；薯蕷皂苷元去簇電壓71.96 V，碰撞電壓23.03 eV；丹參酮ⅡA 去簇電壓120 V，碰撞電壓25.92 eV；離子對m／z415.2～271.2（薯蕷皂苷元）、m／z295.2～277.1（丹參酮ⅡA）。

2.3.3 方法學考察 參照2020 年版《中國藥典》附錄生物樣品定量分析方法驗證指導原則，對專屬性、線性范圍、精密度與準確度、提取回收率與基質(zhì)效應、穩(wěn)定性進行方法學考察，發(fā)現(xiàn)均符合相關(guān)規(guī)定。

2.3.4 結(jié)果分析 精密量取50 μL 大鼠血漿，加入50 μL 內(nèi)標溶液（41.85 ng／mL）渦旋30 s，再加入250 μL 甲醇-乙腈（1∶1）渦旋2 min，13 000 r／min 離心15 min，取上清液，在“2.3.2”項條件下進樣測定，血藥濃度-時間曲線見圖9，主要藥動學參數(shù)見表1。

圖9 薯蕷皂苷元血藥濃度-時間曲線（±s， n＝6）Fig.9 Plasma concentration-time curves for diosgenin solid dispersions（±s， n＝6）

表1 薯蕷皂苷元主要藥動學參數(shù)（±s， n＝6）Tab.1 Main pharmacokinetic parameters for diosgenin（±s， n＝6）

表1 薯蕷皂苷元主要藥動學參數(shù)（±s， n＝6）Tab.1 Main pharmacokinetic parameters for diosgenin（±s， n＝6）

注：與薯蕷皂苷元比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

由此可知，共沉淀法、微波淬冷法所得固體分散 體AUC0～t、AUC0～∞、Cmax高于原料藥（P＜0.05，P＜0.01），以前者更明顯（P＜0.01）；固體分散體Tmax較原料藥均有所延長，但僅冷凍干燥法所得有顯著差異（P＜0.05），推測Soluplus 可能延緩薯蕷皂苷元吸收，但效果不明顯；固體分散體CLz／F均低于原料藥（P＜0.05，P＜0.01），以共沉淀法、微波淬冷法所得更明顯（P＜0.01）。再計算相對生物利用度F，公式為F＝（AUC0～∞固體分散體／AUC0～∞原料藥）×100%，測得共沉淀法、微波淬冷法、冷凍干燥法所得固體分散體分別為576.69%、447.80%、161.37%，即前2 種制備工藝可大大提高原料藥生物利用度。

3 討論

本實驗發(fā)現(xiàn)，共沉淀法、微波淬冷法所得固體分散體中原料藥以無定形態(tài)存在，藥物與載體之間存在相互作用，潤濕性提高，而藥物潤濕性的改善、從結(jié)晶狀態(tài)到無定形的轉(zhuǎn)變［10］、藥物與載體分子間的氫鍵效應都有利于增強原料藥溶出，進而提高其生物利用度。Karmwar 等［15］報道，雖然上述2 種制備工藝所得固體分散體中藥物均為無定形態(tài)，但由于整個體系分子結(jié)構(gòu)不同，故其溶出率也有所差異，與本實驗結(jié)果一致。與原料藥比較，冷凍干燥法所得固體分散體溶解度提高程度不明顯，雖然采用0.1% SDS 作為溶出介質(zhì)可增加其溶出度，但原料藥在冷凍干燥過程中發(fā)生了重結(jié)晶，最終仍有一部分以結(jié)晶狀態(tài)存在，這可能是其生物利用度較低、體內(nèi)外不相關(guān)的原因。綜上所述，共沉淀法所得固體分散體的性能優(yōu)于其他制備工藝所得。

潤濕性對藥物的釋放和吸收起到至關(guān)重要的作用，潤濕程度或范圍與在液體、固體之間界面形成的平衡接觸角和潤濕速度有關(guān)［16］。本實驗采用動態(tài)模型擬合了水在壓塊上的接觸角曲線，發(fā)現(xiàn)所有分布圖均與冪函數(shù)方程擬合良好。水的滲透速率或擴散速率與擬合方程中指數(shù)的絕對值呈正相關(guān)，故可對薯蕷皂苷元固體分散體的溶解機理進行初步預測［17］。本實驗發(fā)現(xiàn)，薯蕷皂苷元固體分散體冪方程指數(shù)的絕對值高于薯蕷皂苷元冪方程指數(shù)，表明Soluplus 的加入提高了水滲透性，同時在潤濕過程中固液界面通過重排存在更多親水基團，從而提高潤濕速率。

不同方法所制備固體分散體的溶出速率、穩(wěn)定性、形貌、粒徑往往不同，因此有必要合理選擇相關(guān)工藝。微波淬冷法是通過微波能源快速改變藥物晶體狀態(tài)，實現(xiàn)其快速無定形化，而且微波熔融物經(jīng)過極速淬冷來保持無序化程度，這是它可增加藥物溶出的重要原因［18-19］，但在制備過程中沒有實時攪拌等混合功能，可能會造成樣品受熱不均，進而導致藥物和載體熔融不均勻，可能影響成品效果，同時微波加熱溫度會很高，可能使得藥物不穩(wěn)定，上述因素都會影響藥物最終的溶出效果；冷凍干燥法所用溶劑為水，雖可溶解載體，但并不能使藥物完全溶解，而是形成混懸液，在冷凍、升華過程中一部分可形成無定形態(tài)，但另一部分仍以晶體形式存在，故會影響藥物溶出；共沉淀法采用有機溶劑將藥物和載體混合均勻后呈現(xiàn)溶解狀態(tài)，在溶劑揮發(fā)過程中形成均一的無定形態(tài)，而且經(jīng)冷凍固化后保持了無定形態(tài)。薯蕷皂苷元由于脂溶性強，可能更適宜將其溶解成分子后再形成無定形態(tài)，本實驗發(fā)現(xiàn)，共沉淀法對該成分溶出度、生物利用度的提高程度更明顯。