邱 佳，余 瑛

(重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 重慶 400054)

0 引言

唐氏綜合征細(xì)胞粘附分子(Down syndrome cell adhesion molecule，DSCAM)是免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)超家族中的成員，具有與Ig相類似的結(jié)構(gòu)特征，其典型的結(jié)構(gòu)域通常以Ig-Fibronectin，F(xiàn)N-Ig-FN模式串聯(lián)[1-2]而成。最近的研究表明，無脊椎動(dòng)物的DSCAM在適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中起著與抗體相似的作用[3]。DSCAM可以通過選擇性剪接產(chǎn)生多種異構(gòu)體，與各種病原體特異性結(jié)合。理論上，對(duì)黑腹果蠅Dscam的N端細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域Ig2、Ig3、Ig7和跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行選擇性剪接，可以產(chǎn)生38 000個(gè)異構(gòu)體[4]。DSCAM異構(gòu)體已被證實(shí)在昆蟲免疫保護(hù)方面起關(guān)鍵作用，其功能涉及病原體特異性識(shí)別、細(xì)胞吞噬、免疫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和抗菌肽轉(zhuǎn)錄等多個(gè)途徑[5-6]。在哺乳動(dòng)物中，DSCAM參與人類神經(jīng)元的發(fā)育和軸突生長(zhǎng)[7]。DSCAM缺失可導(dǎo)致脊髓發(fā)育失調(diào)，引發(fā)自閉癥、抑郁癥和精神分裂癥等精神疾病有關(guān)[8]。此外， DSCAM表達(dá)降低與非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌以及骨肉瘤等多種腫瘤形成密切相關(guān)[9-11]。

人們普遍認(rèn)為，無脊椎動(dòng)物缺乏適應(yīng)性免疫，主要依靠先天免疫(包括物理屏障如幾丁質(zhì)外骨骼、細(xì)胞免疫和體液免疫)進(jìn)行機(jī)體防御[12]。DSCAM在無脊椎和脊椎動(dòng)物廣泛存在，且與抗體結(jié)構(gòu)相似，表明它可能與物種進(jìn)化過程中的抗體演化存在關(guān)聯(lián)。然而，人們對(duì)DSCAM選擇性編輯的調(diào)控機(jī)制及其與免疫作用的關(guān)系仍然未知。

最近有研究發(fā)現(xiàn)，受到真菌感染的東亞飛蝗血淋巴細(xì)胞差異表達(dá)DSCAM2，提示其可能參與了細(xì)胞免疫反應(yīng)。本研究以東亞飛蝗為材料，從其血細(xì)胞中克隆了含有DSCAM保守結(jié)構(gòu)域的DSCAM2828-957抗原片段，經(jīng)重組表達(dá)、純化和免疫小鼠獲得了多克隆抗體并對(duì)其特異性和細(xì)胞定位進(jìn)行了檢測(cè)。此外，還對(duì)DSCAM2與影響血淋巴計(jì)數(shù)的關(guān)系進(jìn)行了初步探索，為下一步進(jìn)行DSCAM2的選擇性剪接機(jī)制和免疫相關(guān)功能研究奠定了工作基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1試劑

Taq DNA聚合酶、dNTP、QuickCutTMEcoR Ⅰ、QuickCutTMHind III、10×QuickCut Green Buffer 、DNA 連接酶均購(gòu)自TaKaRa公司，Ultrapure RNA Kit(DNase I)、HiFiScript cDNA Synthesis Kit購(gòu)自康為世紀(jì)公司，質(zhì)粒提取試劑盒、DNA快速純化/回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA試劑公司，BCA試劑盒購(gòu)自碧云天公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

蛋白質(zhì)純化試劑及配方：細(xì)胞裂解液：25 mmol/L磷酸二氫鈉 (pH值為8.0)，0.4 mol/L NaCl， 0.1%tween20，0.1 mmol /L苯甲基磺酰氟(PMSF)。包涵體溶解液：25 mmol/L磷酸二氫鈉(pH值為7.4)，0.1 mol/L NaCl，9 mol/L尿素，0.1 mmol /L PMSF。平衡溶液：25 mmol/L Tris-HCl (pH值為8.0)，0.4 mol/L NaCl，20 mmol/L咪唑。50 mmol/L咪唑洗脫液：25 mmol/L 磷酸氫二鈉(PH值為7.4)，0.1 mol/L NaCl，18 mol/L尿素，50 mmol/L咪唑。400 mmol/L 咪唑洗脫液：25 mmol/L磷酸氫二鈉(pH值為7.4)，0.1 mol/L NaCl，18 mol/L尿素，400 mmol/L咪唑。

1.1.2動(dòng)物、質(zhì)粒及菌株

東亞飛蝗由重慶大學(xué)基因中心提供。BALB/c小鼠購(gòu)自重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。質(zhì)粒pET30a(+)、大腸桿菌 DH5α、BL21(DE3) 細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3DSCAM2序列

該序列數(shù)據(jù)來源于東亞飛蝗血淋巴轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，具體核酸序列在網(wǎng)站NCBI可查詢，編號(hào)為AJF38204.1。

1.2 方法

1.2.1DSCAM2基因的生物信息學(xué)分析

利用NCBI中BLASTp對(duì)DSCAM2序列結(jié)構(gòu)分析；采用軟件BioEdit進(jìn)行本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)出特異性區(qū)段；同時(shí)分析出抗原表位(http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)豐富區(qū)段，以此確定PCR擴(kuò)增區(qū)段。

1.2.2引物設(shè)計(jì)

采用 primer 5.0軟件，根據(jù)選定的抗原區(qū)域設(shè)計(jì)引物序列分別為F primer：5′-GTTGAATTCATCAGTGTACAAGCTCCCCC-3′; R primer：5′-CAGAAGCTTTCACTTGATTGGAGACTTTCCA-3′。F或R primer分別添加了EcoR I和HindIII識(shí)別位點(diǎn)序列。

1.2.3pET30a(+)-DSCAM2828-957重組質(zhì)粒的構(gòu)建

東亞飛蝗血淋巴細(xì)胞提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA第一鏈，DSCAM2828-957PCR的擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

將得到的PCR產(chǎn)物回收純化，純化的PCR產(chǎn)物和pET30a(+)質(zhì)粒分別用EcoR Ⅰ、Hind III雙酶切，再將其進(jìn)行回收純化、連接，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞。用含卡拉霉素的LB平板篩選轉(zhuǎn)化子。挑選幾個(gè)菌落PCR鑒定后的陽性克隆進(jìn)行質(zhì)粒酶切鑒定及質(zhì)粒測(cè)序。

1.2.4重組DSCAM2828-957表達(dá)和純化

將鑒定為正確序列的質(zhì)粒，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，37 ℃、250 r/min培養(yǎng)，待OD600至0.6～0.8時(shí)，加入濃度為1.0mmol/L IPTG誘導(dǎo)，25℃，250 r/min培養(yǎng)。誘導(dǎo)時(shí)間分別為0、6、12、18、24 h。收集不同誘導(dǎo)時(shí)間的菌體，進(jìn)行細(xì)胞超聲破碎，分離裂解上清及沉淀，SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白表達(dá)情況。

采用表達(dá)水平達(dá)到峰值的誘導(dǎo)、培養(yǎng)條件，對(duì)DSCAM2828-957/ BL21(DE3)進(jìn)行1L發(fā)酵液培養(yǎng)，離心收集菌體，細(xì)胞超聲破碎后。16 000 r/min離心收集沉淀，并用包涵體溶解液溶解沉淀。用Ni-NTA進(jìn)行純化，SDS-PAGE考馬斯亮藍(lán)法檢測(cè)目的蛋白純度，BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度。

1.2.5DSCAM2多克隆抗體制備和效價(jià)測(cè)定

將純化的重組抗原進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后凝膠用1 mol/L氯化鉀染色10 min；切下含有目標(biāo)條帶的凝膠塊；凝膠塊用超純水洗滌去除氯化鉀，經(jīng)液氮研磨成細(xì)粉，用PBS重懸備用。取健康BALB/c雌性小鼠(6～8周)，按每次每只100 μg抗原劑量腹腔注射小鼠，間周免疫，總共免疫3～4次。效價(jià)大于5 000時(shí)，眼球采血，收集血清，-80 ℃保存。間接ELISA法測(cè)定效價(jià)。參考文獻(xiàn)[13],將抗血清倍比稀釋至1∶64 000，所有血清標(biāo)本均重復(fù)3孔，同時(shí)設(shè) PBS 作為對(duì)照組，讀取酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處吸光度值。

1.2.6東亞飛蝗血淋巴特異性檢測(cè)及細(xì)胞定位

1) Western blot法檢測(cè)特異性。將東亞飛蝗血淋巴細(xì)胞總蛋白和純化后的重組DSCAM2828-957蛋白分別經(jīng)10% SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)移至用甲醇激活的PVDF膜上，用5%脫脂牛奶的TBST 37 ℃封閉 1 h；以 DSCAM2828-957多抗血清為一抗(1∶1 000 稀釋)，37 ℃作用2 h；TBST洗滌3次，加入二抗Anti-Mouse IgG(1∶10 000稀釋)，37 ℃作用1 h；TBST洗滌 3次，按ECL顯色試劑盒說明書配制顯色液，并進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯示。

2) 瑞氏-吉姆薩染色。制作東亞飛蝗血淋巴細(xì)胞涂片，干燥，依次使用瑞氏和吉姆薩染色，觀察。

3) 免疫熒光法。制作東亞飛蝗血淋巴細(xì)胞涂片，根據(jù)文獻(xiàn)[14]多聚甲醛固定，打孔，以 DSCAM2828-957多抗血清為一抗(1∶1 000 稀釋)，加FITC標(biāo)記的兔抗鼠二抗，在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.7東亞飛蝗總血細(xì)胞計(jì)數(shù)

取羽化一周的東亞飛蝗成蟲，每只經(jīng)腹節(jié)注射500 ng siRNA，以GFP siRNA片段為干擾陰性對(duì)照，干擾48 h后經(jīng)血球計(jì)數(shù)法檢測(cè)血細(xì)胞密度變化。

使用GraphPad Prism 8.0.1 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，為確定統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，采用霍爾姆-西達(dá)克方法校正多重比較，小于0.05的值被認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 DSCAM2基因的生物信息學(xué)分析

經(jīng)NCBI中BLASTp分析，東亞飛蝗DSCAM2蛋白由2 015個(gè)氨基酸殘基組成，其中包含了Dscam c、IgI_4_Dscam、IgI_2_Dscam、IgI_1_Dscam、IgI_7_Dscam、IgI_5_Dscam、IgC2_3_Dscam、IgI_6_Dscam、Ig _DSCAM、FN3、I-set、IGc2、Ig_3、IgI_3_Robo、IG_like、IG、PHA03376、PHA02826等18種結(jié)構(gòu)域，主要集中在58～1 990區(qū)段。與果蠅DSCAM2異構(gòu)體X16(NCBI中ID：XP_039148152.1)或人類DSCAM異構(gòu)體2(NCBI中ID：NP_001258463.1)蛋白結(jié)構(gòu)分析對(duì)比(見圖1)，都具有I-set、Ig_3和FN3保守結(jié)構(gòu)域，但I(xiàn)-set 和Ig_3拷貝數(shù)不同且東亞飛蝗和果蠅比人類的多了一個(gè)Dscam_C結(jié)構(gòu)域，這些差異是否影響其功能目前尚不清楚。

圖1 東亞飛蝗DSCAM2與果蠅DSCAM2異構(gòu)體X16或人類DSCAM異構(gòu)體2結(jié)構(gòu)域比較

2.2 重組pET30a(+)-DSCAM2828-957構(gòu)建

從東亞飛蝗血細(xì)胞中提取總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA 第一鏈，然后用F primer、R primer對(duì)DSCAM2828-957基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，顯示擴(kuò)增產(chǎn)物大小為414 bp，與設(shè)計(jì)的片段長(zhǎng)度符合，如圖2(a)。

A.DSCAM2828-957基因RT-PCR擴(kuò)增。M:DL2000 DNA marker；1:陰性對(duì)照；2-3:DSCAM2828-957PCR產(chǎn)物

將該片段與pET30a(+)質(zhì)粒進(jìn)行酶切，再經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化DH5α得到轉(zhuǎn)化子，提取重組轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒進(jìn)行EcoR I和Hind III雙酶切(圖2(b))檢測(cè)，電泳結(jié)果顯示重組質(zhì)粒插入片段與擴(kuò)增片段大小一致，質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果也顯示插入序列與DSCAM2828-957相同，表明pET30a(+)-DSCAM2828-957重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.3 DSCAM2重組表達(dá)及純化

將pET30a(+)-DSCAM2828-957質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，得到pET30a(+)-DSCAM2828-957/ BL21(DE3)表達(dá)菌株。對(duì)此表達(dá)菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)后收集菌體。采用超聲裂解法破胞，離心后分別收集上清和沉淀，進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖3(a)和圖3(b)，表明IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)6～24 h的裂解液上清及沉淀中均有DSCAM2828-957重組蛋白，沉淀中含量更高。這表明DSCAM2828-957重組蛋白在BL21(DE3)中主要以包涵體形式表達(dá)，其相對(duì)分子質(zhì)量約21.1 KDa。

將包含體蛋白用尿素溶液溶解，用Ni-NTA親和層析純化重組DSCAM2828-957，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)(圖3(c))可知，DSCAM2828-957重組蛋白可用50 mM/L 咪唑溶液洗脫，image J軟件分析顯示該濃度下洗脫得到的DSCAM2828-957純度為75%，蛋白濃度為1.913 g/L。

M:蛋白質(zhì)分子量marker；目標(biāo)條帶黑色箭頭所示。

2.4 DSCAM2多克隆抗體的效價(jià)測(cè)定、特異性鑒定及定位

為了制備高純度DSCAM2828-957以保證免疫后多克隆抗體的特異性，本研究采用切膠免疫法免疫小鼠，獲取的多克隆抗體效價(jià)測(cè)定大于 1∶64 000；采用Western blot檢測(cè)DSCAM2828-957和東亞飛蝗血淋巴細(xì)胞總蛋白均顯示出現(xiàn)單一條帶(見圖4)，表明制備的多克隆抗體具有特異性。

東亞飛蝗具有原血細(xì)胞、粒細(xì)胞、漿細(xì)胞和類卵母細(xì)胞4類血淋巴細(xì)胞，其中原血細(xì)胞和粒細(xì)胞較小，瑞氏-吉姆薩染色原血細(xì)胞為球形紅色，而粒細(xì)胞具有多種形態(tài)且根據(jù)酸堿性質(zhì)顯色[15]。對(duì)東亞飛蝗血淋巴細(xì)胞進(jìn)行了瑞氏-吉姆薩染色(見圖5(a))和免疫熒光檢測(cè)(見圖5(b))，從細(xì)胞形態(tài)、大小和染色特征對(duì)比分析表明，東亞飛蝗嗜堿性粒細(xì)胞高表達(dá)DSCAM2。

A.重組DSCAM2828-957蛋白特異性檢測(cè)。M:蛋白質(zhì)分子量markerB.東亞飛蝗血淋巴細(xì)胞總蛋白特異性檢測(cè)。M:蛋白質(zhì)分子量marker

(a)東亞飛蝗血淋巴細(xì)胞瑞氏-吉姆薩染色，黑色箭頭所示嗜堿性粒細(xì)胞(b)免疫熒光分析DSCAM2在東亞飛蝗血淋巴細(xì)胞中的定位，白色箭頭所示嗜堿性粒細(xì)胞。

2.5 敲低DSCAM2表達(dá)水平引起東亞飛蝗總血細(xì)胞計(jì)數(shù)增加

用siRNA干擾DSCAM2后，進(jìn)行東亞飛蝗血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其血淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著增多(見圖6)，表明DSCAM2可能參與血細(xì)胞增殖調(diào)控，詳細(xì)的機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

*，p<0.05，Mean±SEM(n=3)

3 討論

3.1 DSCAM2抗原片段的選擇與多克隆抗體的特異性

本研究對(duì)DSCAM2蛋白序列進(jìn)行特異性、親水性、抗原性和可及性等生物信息學(xué)分析[16]，選取特異性好、抗原表位豐富、大小約400 bp、含有Dscam_C保守結(jié)構(gòu)域片段作為克隆區(qū)。采用原核系統(tǒng)成功克隆并成功表達(dá)了DSCAM2828-957抗原，經(jīng)Ni親和層析純化目的蛋白免疫小鼠，獲取了高效價(jià)的多克隆抗體。此方法中選取的抗原DNA片段大小易于在原核系統(tǒng)高水平表達(dá)且具有較好的免疫原性，其帶有的His-tag，在純化條件選擇時(shí)，無需考慮蛋白變性與否，降低了純化包涵體蛋白難度[17]。同時(shí)，利用電泳后切膠[18-19]處理，在較短時(shí)間內(nèi)能獲得大量的高純度抗原蛋白，更容易獲得特異性較高的抗體。本實(shí)驗(yàn)使用該方法在3次免疫后，DSCAM2828-957多克隆抗血清效價(jià)達(dá) 1∶64 000，表明該制備方法獲得的抗血清高效，能同時(shí)識(shí)別多個(gè)抗原表位且周期短[20]。采用Western blot 檢測(cè)重組DSCAM2828-957和東亞飛蝗血淋巴細(xì)胞總蛋白中的DSCAM2均只有1個(gè)條帶，表明設(shè)計(jì)的重組抗原及獲得的抗體均具有較好的特異性，可用于后續(xù)采用免疫學(xué)方法檢測(cè)DSCAM2表達(dá)和研究DSCAM2相關(guān)功能[21]。

3.2 DSCAM2異構(gòu)體與抗原識(shí)別

昆蟲DSCAM2有多種異構(gòu)體，如秀麗果蠅(Drosophila elegans)的DSCAM2異構(gòu)體至少包括76種蛋白(數(shù)據(jù)來自NCBI Protein 搜索結(jié)果)，分子量在73.8～282 KDa范圍。本研究制備的抗體檢測(cè)到東亞飛蝗血細(xì)胞DSCAM2分子量?jī)H24.7 KDa。這種小分子DSCAM2，目前報(bào)道較少，其功能尚不明確。越來越多的研究證明，DSCAM基因可以由不同的病原體誘發(fā)產(chǎn)生不同的亞型，增加免疫細(xì)胞吞噬的效率，從而表現(xiàn)出類似適應(yīng)性免疫的功能[22]，不同亞型DSCAM及其異構(gòu)體的作用仍有待闡明。本研究發(fā)現(xiàn)的DSCAM2異構(gòu)體主要在血淋巴嗜堿性粒細(xì)胞高表達(dá)，前期研究已顯示嗜堿性粒細(xì)胞很可能參與病原真菌吞噬過程[23]，提示DSCAM2的功能可能與嗜堿性粒細(xì)胞對(duì)真菌的特異性識(shí)別和吞噬作用有關(guān)。

由于對(duì)昆蟲DSCAM2在各種組織中異構(gòu)體的分布情況報(bào)道很少，本研究制備的抗體對(duì)DSCAM2的特異性檢測(cè)也只針對(duì)東亞飛蝗血淋巴細(xì)胞，因此尚不清楚該抗體在東亞飛蝗其他組織特異性如何，也不能確認(rèn)該方法制備的抗體是否可以用于其他昆蟲血淋巴細(xì)胞的免疫檢測(cè)。但本研究提供的抗原設(shè)計(jì)和抗體制備方法及思路仍能為快速制備高效價(jià)、特異性強(qiáng)的目標(biāo)抗體提供借鑒。

選取抗原表位豐富且特異性強(qiáng)的抗原片段作為重組抗原能較好地保證所制備的多克隆抗體的特異性。本研究制備的抗體對(duì)于探索DSCAM2在東亞飛蝗血淋巴細(xì)胞中的功能或剪接機(jī)制提供了可靠的研究工具。