谷志鵬，向夢玲，凌洪權(quán)，駱 璐，吳勝昔，董春霞，冉 皚，郭 宇

(1.重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 重慶 400054；2.重慶市動物疫病預(yù)防控制中心， 重慶 401120)

0 引言

狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(rabies virus，RV)引起的人獸共患致死性傳染病，發(fā)病后病死率幾乎100%[1]。目前患者尚無有效的治療方法，是世界上傳播最廣、影響和危害最為慘重的烈性疾病，會在發(fā)病3～6 d后出現(xiàn)呼吸功能和循環(huán)功能衰竭而死亡[2-3]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織報告，1986—2020年中，每年約6萬多人死于狂犬病[4]，主要在亞洲和非洲等一些不發(fā)達(dá)國家流行，特別是在 20 世紀(jì)中葉，狂犬病在世界各地爆發(fā)并造成了許多人死亡[5-6]。近年來，隨著狗、貓以及城市和農(nóng)村地區(qū)飼養(yǎng)寵物的家庭快速增加，野生犬和貓的數(shù)量明顯增多，使狂犬病的發(fā)病率明顯上升，給人類和動物生命安全造成了威脅。

RV 屬彈狀病毒科、狂犬病毒屬，呈典型的子彈狀，表面具有包膜[7]，基因組為大約12 000 bp 的單鏈RNA[8]。編碼5種結(jié)構(gòu)蛋白，依次為核蛋白(nucleoprotein,N)、衣殼蛋白(Phosphoprotein PP)、膜蛋白(M atrix protein MP)、糖蛋白(Glycoprotein GP)和聚合酶蛋白(Large protein LP)[9]。與其他蛋白相比，N蛋白比較穩(wěn)定，堿基易位、缺失較少，是 RV 基因分型判斷的檢測標(biāo)準(zhǔn)。N蛋白作為主要抗原，在刺激機體產(chǎn)生抗體的同時，對疫苗的研制、診斷、流行病學(xué)有重要價值[10]。

本次研究在不改變RV N蛋白基因序列下，對密碼子優(yōu)化，通過化學(xué)合成RV N基因，并將其克隆至pET28a(+)原核表達(dá)載體，構(gòu)建pET28a-RV N重組質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)化至 BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，利用His-tag鎳柱純化出了RV N蛋白，并對其進(jìn)行生物特性鑒定，為后續(xù)疫苗的研制與狂犬病的診斷奠定了基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 菌株和質(zhì)粒

原核表達(dá)載體pET28a(+)，由重慶理工大學(xué)基因工程實驗室贈予，pET28a-RV N/BL21(DE3) 由上海生工生物工程有限公司構(gòu)建。

1.2 主要試劑及儀器

Tris、Imidazole購自Genview公司；Glycine購自Beyotime公司；10×QuickCut Green buffer、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ購自TaKaRa公司；NGCTM層析系統(tǒng)、His-tag鎳柱購自購美國Bio-Rad公司。

2 方法

2.1 RV N基因合成

根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫對應(yīng)的RV N 基因序列(1489853)，將此序列委托上海生物生工有限公司進(jìn)行密碼子優(yōu)化，并在上下游引物中引入酶切位點NdeI和XhoI，插入His標(biāo)簽進(jìn)行合成。

2.2 pET28a-RV N重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定與測序

將公司合成的甘油菌進(jìn)行平板劃線培養(yǎng)，選取單菌落到試管中活化過夜，錐形瓶擴大培養(yǎng)，得到大量菌株。將得到的菌液取3～4 mL用小型質(zhì)粒試劑盒提取RV N蛋白基因的質(zhì)粒。用NdeI、XhoI、酶切緩沖液、質(zhì)粒、超純水配制雙酶切體系，將制備的體系置于37 ℃水浴鍋中進(jìn)行 0.5～1 h雙酶切，經(jīng)電泳鑒定正確后，送上海生工進(jìn)行測序鑒定。

2.3 RV N重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

從-80 ℃冰箱中取出甘油菌，進(jìn)行平板劃線培養(yǎng)，選取單菌落到試管中活化過夜，通過錐形瓶進(jìn)行擴大培養(yǎng)，當(dāng)菌液OD600nm 值在 0.6～0.8 時，加入一定量的 IPTG，30 ℃下誘導(dǎo)8 h。4 500 r/min 離心13 min，離心后倒掉上清,按照菌重的1∶20或1∶30加入裂解液，超聲破碎35 min后，11 000 r/min離心13 min后，進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。

2.4 RV N重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

將pET28a-RV N/BL21(DE3)重組菌平板劃線在含卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基，次日選取單菌落接種于試管中37 ℃培養(yǎng)過夜，用移液槍從試管中取1～2 mL菌液于錐形瓶中37 ℃、180 r/min 搖床震蕩培養(yǎng)至OD600nm值達(dá)到0.6～0.8。分別進(jìn)行誘導(dǎo)溫度(20、25、30、37 ℃)、誘導(dǎo)劑IPTG終濃度(0.1 、0.5 、1 、1.4 mmol/L)、誘導(dǎo)時間(2、4、6、8、10 h)的篩選。將菌液5 500 r/min離心14 min后，加入裂解液和1%菌重的PMSF 用35 W的功率超聲破碎，12 000 r/min離心11 min，沉淀按菌重1∶20的體積加入PBS，用渦旋振蕩器進(jìn)行混勻，取20 μL 混懸液和上清，進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定。

2.5 RV N重組蛋白的純化

根據(jù)2.4篩選得到的最佳條件，對pET28a-RV N/BL21菌液擴大培養(yǎng)，將菌液配平8 000 r/min離心12 min后，倒掉上清按照菌重1∶30加入PBS重懸后，再按照之前步驟重復(fù)一次后，加入裂解液超聲破碎30 min，倒掉上清加入溶解液和1%菌重的PMSF后，放入4 ℃冰柜攪拌過夜。11 000 r/min離心13 min，收集上清液，用0.22 μm濾頭過濾，打開電腦、啟動蛋白純化儀、收集器，濾液上樣于His-tag鎳柱，用NGCTM層析系統(tǒng)對RV N 重組蛋白進(jìn)行純化，具體操作步驟見文獻(xiàn)[11]，并收集280 nm紫外吸收峰下的洗脫液。

2.6 RV N重組蛋白的SDS-PAGE鑒定

將原液上清、沉淀、空載體、流穿液不同濃度咪唑液在280 nm紫外吸收峰下的洗脫液各取 20 μL，加入上樣緩沖液5 μL，混勻，100 ℃煮沸10 min，使其變性，進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定，取出凝膠倒入考馬斯亮藍(lán)染色液，放在搖床震蕩30 min，倒入脫色液脫色過夜，次日進(jìn)行成像。

2.7 RV N重組蛋白的Western Blot 鑒定

將純化后得到的RV N 蛋白樣品進(jìn)行 SDS-PAGE電泳，待電泳完畢后，將電泳凝膠進(jìn)行只留mark和目的條帶的切膠處理，將切好的電泳凝膠轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，待轉(zhuǎn)膜完成后，將膜用含5%脫脂奶粉的TBST在水平搖床上室溫封閉1 h。以RV N蛋白標(biāo)準(zhǔn)抗體作為一抗(1∶5 000稀釋)放在4 ℃冰箱中過夜，次日取出膜放在盒子里用TBST洗3次。以羊抗鼠IgG抗體為二抗(1∶4 000)，水平搖床孵育1 h。加入按照等量A液和B液混合的顯色液，靜置3 min，將膜的正面放在成像儀中進(jìn)行顯影。

3 結(jié)果與分析

3.1 pET28a(+)-RV N重組質(zhì)粒酶切鑒定及測序

將重組質(zhì)粒pET28a( + )RV-N雙酶切凝膠電泳，在1 359 bp目的基因與5 369 bp處有明顯條帶，與預(yù)期目的片段及空載體大小基本一致(見圖1)。將狂犬病重組N蛋白進(jìn)行測序，顯示連接位點均正確。

M:標(biāo)準(zhǔn)酶切MARKER； 1;狂犬病雙酶切鑒定

3.2 RV N重組N蛋白表達(dá)鑒定

將公司合成的pET28a(+)-RV N菌株和BL21空載體在相同條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)后進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳鑒定。結(jié)果顯示:BL21空載體不表達(dá)目的蛋白，重組菌株經(jīng)在一定條件下，沉淀在51KD處表達(dá)出大量的目的蛋白，而超聲破碎后的上清中沒有(見圖2)。這與預(yù)期分子量大小相符，說明pET28a( + )RV -N重組菌株構(gòu)建成功。

M:蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1:pET28a(+)上清2：pET28a(+)沉淀；3-4：經(jīng)誘導(dǎo)pET28a(+)-RV N沉淀，5-6:經(jīng)誘導(dǎo)pET28a(+)-RV N上清

3.3 RV N重組N蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化

為探究RV N重組蛋白表達(dá)的影響因素，選取溫度(20、25、30、37 ℃)、IPTG濃度(0.1、0.5、1.0、1.5 mmol/L)、時間(2、4、6、8、10 h)3個因素對蛋白表達(dá)進(jìn)行優(yōu)化，經(jīng)過SDS-PAGE電泳鑒定。結(jié)果見圖3—5。在誘導(dǎo)溫度為30 ℃、IPTG終濃度為0.1 mmol /L、誘導(dǎo)時間為8 h時，51 kD處出現(xiàn)最大蛋白表達(dá)量。

M:蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.pET28a(+)沉淀；3、5、7、9：20、25、30、37 ℃(0.5 mmol·L-1 IPTG，7 h)誘導(dǎo)條件下RV N重組蛋白超聲破碎后沉淀；2、4、6、8：20、25、30、37 ℃(0.5 mmol·L-1 IPTG，7 h)誘導(dǎo)條件下RV N重組蛋白超聲破碎后上清

M:蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.pET28a(+)沉淀；3、5、7、9：0.1、0.5、1、1.5 mmol/L IPTG(30 ℃，7 h)誘導(dǎo)條件下 RV N重組蛋白超聲破碎后沉淀 2、4、6、8：0.1、0.5、1、1.5 mmol/L IPTG(30 ℃，7 h)誘導(dǎo)條件下 RV N重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)上清

M:蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 1：pET28a(+)空載體沉淀；2-6：狂犬病時間分別在2、4、6、8、10 h (0.1 mmol·L-1 IPTG，30 ℃)RV N重組蛋白超聲破碎后沉淀

3.4 RV N重組N蛋白的純化

將pET28a(+)-RV N重組菌株平板劃線培養(yǎng)，在最佳條件下進(jìn)行大量培養(yǎng)，菌液離心超聲破碎溶解過夜，使用蛋白純化儀進(jìn)行純化，設(shè)置了不同濃度的咪唑?qū)?RV N 蛋白進(jìn)行洗脫。結(jié)果顯示:RV N 蛋白在300 mM咪唑濃度下有280 nm 紫外吸收峰，結(jié)果如圖6所示。

圖6 NGCTM層析系統(tǒng)純化RV N重組蛋白圖譜

3.5 RV N重組蛋白的SDS-PAGE鑒定

取超聲破碎后蛋白溶解原液、流穿液、不同濃度咪唑洗脫下的280 nm紫外吸收峰進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定，結(jié)果(見圖7)表明，300 mM洗脫下來的蛋白液即為純化后的RV N重組蛋白，且純度較高，雜蛋白較少。

M：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1：包涵體提取液；2:流穿液；3-4：5%洗下雜蛋白；5-8：純化后N蛋白

3.6 RV N重組蛋白的Western Blot 鑒定

Western Blot鑒定結(jié)果表明(圖8)，在51 kD處出現(xiàn)明顯特異性蛋白印跡條帶，而空載體轉(zhuǎn)化的DE3菌液對照沒有任何條帶，與預(yù)期結(jié)果相同。說明表達(dá)已成功表達(dá) RV N蛋白。

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1:RV N 重組蛋白 2：pET28a(+)空載體轉(zhuǎn)化的DE3菌液

4 討論

狂犬病是一種致死性疾病，在中國2000多年前就有人被感染，一旦發(fā)病，死亡率幾乎 100%[12-13]。在狂犬病的預(yù)防與控制中，狂犬病的檢測尤為重要，目前在臨床實踐中對狂犬病的診斷方法主要是通過流行病學(xué)和臨床癥狀,缺乏對狂犬病特異性診斷[14],而狂犬病N蛋白基因序列相對穩(wěn)定，點突變少，常用作于病毒的分型與診斷,隨著對N蛋白基因序列的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)現(xiàn)病毒菌株的來源和遺傳聯(lián)系以及致病力的變化方面有著重要意義[15]。

RV N是機體防止病毒感染的關(guān)鍵蛋白，它是一種T細(xì)胞(Th)調(diào)節(jié)抗原能誘導(dǎo)不同基因型RV 產(chǎn)生特異性保護，在開發(fā)新型狂犬病疫苗發(fā)揮著決定作用[16]。

本研究在RV N蛋白基因序列起始密碼子N端與C端分別加入His-tag，并選擇pET28a(+)作為表達(dá)載體進(jìn)行RV N重組蛋白的表達(dá)，在篩選溫度、IPTG濃度、時間這3個因素對RV核蛋白表達(dá)影響中，發(fā)現(xiàn)IPTG濃度 0.1 mmol/L，6 h，30 ℃時 RV 重組蛋白表達(dá)量最高。本研究前幾次蛋白純化中沒能洗脫出目的蛋白，在后續(xù)數(shù)次實驗中，添加了不同濃度的咪唑并延長了洗脫時間，發(fā)現(xiàn)在300 mM 咪唑濃度下洗脫出目的蛋白。在純化中發(fā)現(xiàn)蛋白不易溶解且與鎳柱結(jié)合難度高，不易洗脫，之后加入一定量脫氧膽酸鈉、DTT、提高溶解液pH值至8.0，增加蛋白溶解時間來提高蛋白的可溶性，經(jīng)過電泳發(fā)現(xiàn)溶解度增加。經(jīng)SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)，RV N 重組蛋白在菌體內(nèi)形成包涵體，這可能是因為蛋白聚合酶的功能太強，蛋白沒有時間折疊致使過多的蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合[17]。其次，在大腸桿菌原核表達(dá)載體沒有糖基化功能，導(dǎo)致中間體的大量積累和不溶性包涵體蛋白形成。本次研究成功制備出RV N蛋白，純度濃度較高，具有良好的生物活性，為后續(xù)單克隆抗體以及疫苗的制備奠定了基礎(chǔ)。