王 登，王 娣，曹 青，閆抗抗△

1 西北大學(xué)附屬醫(yī)院/西安市第三醫(yī)院，陜西 西安 710018； 2 陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710016

中醫(yī)藥學(xué)是一個(gè)動態(tài)辨證論治和整體觀念指導(dǎo)的醫(yī)學(xué)體系，抗擊疫病具有上千年的臨床經(jīng)驗(yàn)，在各個(gè)時(shí)期都發(fā)揮著無法替代的積極作用?！爸挝床　笔侵嗅t(yī)藥預(yù)防疫病的特色，新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）疫情發(fā)生后，各地根據(jù)“三因制宜”相繼出臺了多個(gè)中藥預(yù)防方案。本課題組前期通過對各地診療方案用藥規(guī)律進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，發(fā)現(xiàn)各地發(fā)布的預(yù)防類處方中，玉屏風(fēng)散的使用頻次最高［1］?！缎滦凸跔畈《痉窝字嗅t(yī)診療手冊》也提到對于未能明確診斷的輕型患者，時(shí)邪犯表證使用蔥豉湯合玉屏風(fēng)散加味［2］?？梢娪衿溜L(fēng)散對COVID-19具有一定的預(yù)防作用。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）受體在肺組織中主要分布于Ⅱ型肺泡細(xì)胞，嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）可能利用宿主細(xì)胞ACE2受體，使用其刺突蛋白進(jìn)入靶細(xì)胞，從而感染宿主［3］。所以ACE2相關(guān)基因是干預(yù)COVID-19的重要靶點(diǎn)。已有研究證實(shí)，玉屏風(fēng)散的主要成分黃芪，對代謝綜合征大鼠腎臟ACE2 mRNA的表達(dá)具有一定調(diào)節(jié)作用［4］。提示玉屏風(fēng)散可能介導(dǎo)ACE2受體預(yù)防COVID-19，但是鑒于中藥復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多通路等作用特點(diǎn)，目前玉屏風(fēng)散預(yù)防COVID-19的作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，對玉屏風(fēng)散介導(dǎo)ACE2受體預(yù)防COVID-19的有效成分、作用靶點(diǎn)及信號通路進(jìn)行探索，利用GO（gene ontology）和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）信號通路富集分析其潛在作用機(jī)制，以期為其臨床應(yīng)用提供新的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 玉屏風(fēng)散活性成分的篩選及靶點(diǎn)基因預(yù)測玉屏風(fēng)散由黃芪、白術(shù)、防風(fēng)3味中藥組成。利用中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）數(shù)據(jù)庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）檢索3味藥材所有活性成分，并利用口服生物利用度（oral bioavailability，OB）和類藥性（drug likeness，DL）兩個(gè)藥物動力學(xué)參數(shù)對所有活性成分進(jìn)行篩選，設(shè)置條件為OB≥30%和DL≥0.18，將篩選后的化合物作為候選成分。采用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索玉屏風(fēng)散所有活性成分潛在的蛋白靶點(diǎn)，并使用Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org）中的UniprotKB搜索功能，通過輸入查詢到的靶蛋白名稱，并限定物種為“Homo sapiens”，剔除非人源靶點(diǎn)，獲取活性成分靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)基因名稱。

1.2 COVID-19靶點(diǎn)的檢索及相互靶點(diǎn)Venn分析本研究利用WANG等［5］對結(jié)腸上皮細(xì)胞測序結(jié)果識別到的與ACE2共表達(dá)的5556個(gè)基因，與玉屏風(fēng)散活性成分對應(yīng)的基因進(jìn)行Venn分析，得到共同的交集基因。

1.3 構(gòu)建 “中藥-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖將交集基因采用網(wǎng)絡(luò)圖像化軟件Cytoscape 3.7.2構(gòu)建“中藥-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖?！爸兴?活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖的核心架構(gòu)是網(wǎng)絡(luò)，每個(gè)節(jié)點(diǎn)（node）是基因、蛋白質(zhì)或分子等，節(jié)點(diǎn)與節(jié)點(diǎn)之間的連接（edge）代表這些生物分子之間的相互作用［6］。本次網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)（node）表示中藥、活性成分、基因靶點(diǎn)、疾病。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建將交集基因在線導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org），限定物種人，進(jìn)行蛋白相互作用分析，設(shè)置交互作用可信度等級為高可信度（≥0.7），構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖，尋找靶點(diǎn)和靶點(diǎn)間的作用關(guān)系。并將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖優(yōu)化，其中節(jié)點(diǎn)大小和顏色設(shè)置用于反映度值的大小，邊的粗細(xì)和顏色設(shè)置用于反映結(jié)合率評分的大小［6］。使用度值、介數(shù)中心性篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 GO與KEGG通路富集分析使用DAVID生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov）對網(wǎng)絡(luò)合并后獲得的交集基因進(jìn)行GO富集分析和KEGG信號通路富集分析。將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫，Select identifier設(shè)置為OFFICIAL GENE SYMBOL，List Type設(shè)置為GeneList，限定物種為人，對作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）分析和KEGG通路分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。富集分析GO生物學(xué)過程包括：生物過程、分子功能、細(xì)胞組成分3個(gè)模塊繪制條形圖［7］，KEGG分析結(jié)果做氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 玉屏風(fēng)散活性成分的篩選及靶點(diǎn)基因預(yù)測從TCMSP數(shù)據(jù)庫中搜索組成玉屏風(fēng)散的3味中藥的化合物成分，得到結(jié)果：黃芪87個(gè)，白術(shù)55個(gè)，防風(fēng)173個(gè)。根據(jù)OB＞30%及DL≥0.18要求，刪去重復(fù)的化合物，最終選定44個(gè)化合物，其中白術(shù)7個(gè)，黃芪20個(gè)，防風(fēng)18個(gè)，白術(shù)與黃芪有1個(gè)共同成分。通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索得到黃芪對應(yīng)的蛋白靶點(diǎn)218個(gè)，白術(shù)19個(gè)，防風(fēng)70個(gè)，刪去重復(fù)靶點(diǎn)，并在Uniprot數(shù)據(jù)庫檢索其對應(yīng)“人”的基因名稱，最終得到基因靶點(diǎn)197個(gè)。

2.2 COVID-19靶點(diǎn)的搜集及靶點(diǎn)Venn分析通過文獻(xiàn)獲得與ACE2共表達(dá)的5556個(gè)基因，將ACE2相關(guān)靶點(diǎn)基因與活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)基因取交集進(jìn)行韋恩分析，共得到56個(gè)靶點(diǎn)。表明這56個(gè)靶點(diǎn)可能是玉屏風(fēng)散介導(dǎo)ACE2預(yù)防COVID-19的關(guān)鍵靶點(diǎn)?；蚓S恩分析如圖1所示，交集基因靶點(diǎn)如表1所示。

表1 玉屏風(fēng)散介導(dǎo)ACE2預(yù)防COVID-19的關(guān)鍵靶點(diǎn)

圖1 玉屏風(fēng)散成分靶基因與ACE2相關(guān)靶點(diǎn)基因維恩分析圖

2.3 構(gòu)建“中藥-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖將獲得的56個(gè)關(guān)鍵靶基因映射所屬成分，發(fā)現(xiàn)44種有效成分中有26種成分參與對關(guān)鍵靶基因的調(diào)控，構(gòu)建成分靶點(diǎn)關(guān)系對文件，使用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖見圖2。

圖2 玉屏風(fēng)散“中藥-活性成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建采用STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖，見圖3。結(jié)果共涉及65個(gè)節(jié)點(diǎn)，78條邊。選擇度值≥5，介數(shù)中心性≥0.1的節(jié)點(diǎn)作為主要靶點(diǎn)，則相互作用的主要靶點(diǎn)為天冬氨酸特異性酶切半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3，CASP3）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、β型蛋白激酶C（protein kinase C beta type，PRKCB）、雌激素受體（estrogen receptor，ER）、表皮生長因子前體（proepidermal growth factor，EGF）等相互作用。

圖3 玉屏風(fēng)散介導(dǎo)ACE2受體預(yù)防COVID-19靶標(biāo)蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 關(guān)鍵基因靶點(diǎn)Go富集分析對篩選得到的56個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析，設(shè)定閾值P＜0.05，共富集到156條生物學(xué)過程，其中生物過程（biological process，BP）條目105個(gè)，細(xì)胞組成（cellular component，CC）條目20個(gè)，分子功能（molecular function，MF）條目31個(gè)，分別占67.31%、12.82%、19.87%。篩選P值較小的生物學(xué)過程繪圖，見圖4—6。BP主要涉及缺乏配體時(shí)的體外凋亡信號通路、凋亡過程負(fù)調(diào)控、凋亡線粒體的變化、藥物反應(yīng)、氧化還原過程等。CC涉及細(xì)胞外間隙、Bcl-2家族蛋白復(fù)合物、膜筏、線粒體外膜、細(xì)胞外外泌體、胞質(zhì)等。MF涉及蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚化活性、BH3域結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子活性等。

圖4 玉屏風(fēng)散介導(dǎo)ACE2受體預(yù)防COVID-19關(guān)鍵靶點(diǎn)的BP富集分析

2.6 通路KEGG富集分析KEGG富集分析篩選到27條通路，其中18條具有顯著意義（P≤0.05），結(jié)果見表2。KEGG功能注釋富集分析提示，玉屏風(fēng)散可能作用包括癌癥通路、HIF-1信號通路、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、p53信號通路、PI3K-Akt信號通路、細(xì)胞凋亡等通路。這些表明玉屏風(fēng)散可通過多個(gè)通路介導(dǎo)ACE2受體發(fā)揮預(yù)防COVID-19的作用。進(jìn)一步對KEGG富集分析結(jié)果進(jìn)行可視化處理，圖形化結(jié)果見圖7。

表2 玉屏風(fēng)散介導(dǎo)ACE2關(guān)鍵靶點(diǎn)KEGG富集信號通路

圖7 玉屏風(fēng)散介導(dǎo)ACE2預(yù)防COVID-19潛在核心靶點(diǎn)的KEGG富集分析

圖5 玉屏風(fēng)散介導(dǎo)ACE2受體預(yù)防COVID-19關(guān)鍵靶點(diǎn)的CC富集分析

圖6 玉屏風(fēng)散介導(dǎo)ACE2受體預(yù)防COVID-19關(guān)鍵靶點(diǎn)的MF富集分析

3 討論

玉屏風(fēng)散具有益氣固表止汗的功用，用于治療表虛自汗［8］。臨床廣泛用于呼吸道疾病，如反復(fù)上呼吸道感染、流行性感冒、難治性支原體肺炎、支氣管哮喘等［9］。最新研究發(fā)現(xiàn)，玉屏風(fēng)散發(fā)酵多糖具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用，可增強(qiáng)進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖［10］。另外，研究發(fā)現(xiàn)玉屏風(fēng)散具有抑制病毒復(fù)制的作用。動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，加味玉屏風(fēng)散可抑制預(yù)處理小鼠病毒融合受體ICAM-1的表達(dá)，抑制病毒附著、病毒滲透，降低細(xì)胞對病毒入侵的敏感性，可以預(yù)防流感病毒和人呼吸道合胞病毒引起的呼吸道病毒感染［11］。在2003年非典型肺炎流行期間，北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院姜良鐸、周平安教授推薦的預(yù)防處方和上海漢殷藥業(yè)生產(chǎn)的扶正祛邪口服液中均包含玉屏風(fēng)散［12］。本次疫情期間中醫(yī)藥防治方案中也大多推薦玉屏風(fēng)散加減方作為預(yù)防用藥［13］?？梢姡衿溜L(fēng)散對COVID-19具有一定的預(yù)防作用，但其具體作用機(jī)制尚不明確。

研究發(fā)現(xiàn)，ACE2受體蛋白是SARS-Cov-2入侵人體細(xì)胞的關(guān)鍵，SARS-Cov-2表面的S蛋白與人體細(xì)胞表面的ACE2蛋白結(jié)合，再通過細(xì)胞的胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，感染組織。所以，若能阻斷SARSCov-2與ACE2的結(jié)合，便可能阻止病毒感染［13］。黃芪是玉屏風(fēng)散的重要組成藥物，研究發(fā)現(xiàn)黃芪對代謝綜合征大鼠腎臟ACE2 mRNA的表達(dá)具有一定調(diào)節(jié)作用［4］。黃芪的水和甲醇提取物對禽流感H9病毒具有一定的抑制作用［14］。所以，玉屏風(fēng)散可能通過調(diào)控ACE2相關(guān)靶點(diǎn)，而發(fā)揮預(yù)防COVID-19的作用。網(wǎng)絡(luò)分析的結(jié)果顯示，玉屏風(fēng)散的3味藥物共含44種不同的化合物，對應(yīng)197個(gè)靶點(diǎn)，其中56個(gè)靶點(diǎn)為ACE2相關(guān)基因的交集靶點(diǎn)。可見，玉屏風(fēng)散可能對機(jī)體ACE2受體相關(guān)表達(dá)具有一定的調(diào)控作用。

蛋白質(zhì)相互作用結(jié)果顯示玉屏風(fēng)散的有效成分可能是通過CASP3、EGFR、PRKCB、ESR1、EGF等藥物-疾病共有靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)起作用。研究發(fā)現(xiàn)，ACE2與Caspase家族密切相關(guān)，ACE2基因敲除小鼠主動脈血管平滑肌細(xì)胞活性氧和凋亡明顯增加，同時(shí)裂解caspase-3和裂解caspase-8水平升高［15］。病毒感染機(jī)體除引起氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)外，還可誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生凋亡，凋亡信號傳導(dǎo)以Caspase激活開始，其中Caspase-3是Caspase家族中最重要的凋亡執(zhí)行者，是引發(fā)細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶，可降解細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)蛋白及維持基因組穩(wěn)定和對細(xì)胞周期起調(diào)控作用，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡［16］。所以，CASP3可能通過與ACE2相互影響而作用于病毒感染。在呼吸道，EGFR廣泛表達(dá)于上皮細(xì)胞，EGFR活化后能夠募集中性粒細(xì)胞，產(chǎn)生黏蛋白，促進(jìn)分泌抗菌多肽并清除病原微生物等［17］。研究發(fā)現(xiàn)，ACE2表達(dá)與EGFR密切相關(guān)，EGFR突變的原發(fā)性肺腺癌中，ACE2的表達(dá)水平遠(yuǎn)高于正常肺上皮細(xì)胞［18］。所以，EGFR可能是玉屏散介導(dǎo)ACE2預(yù)防COVID-19的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

GO分析結(jié)果顯示，BP分析可見玉屏風(fēng)散的生物過程主要涉及缺乏配體時(shí)的體外凋亡信號通路、凋亡過程負(fù)調(diào)控、凋亡線粒體的變化、藥物反應(yīng)、氧化還原過程等。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪注射液具有明顯的抗流感病毒活性，可以提高被感染細(xì)胞的存活率，同時(shí)提高流感病毒對感染后細(xì)胞周期的阻斷作用［19］。CC分析可見玉屏風(fēng)散靶點(diǎn)主要涉及細(xì)胞外間隙、Bcl-2家族蛋白復(fù)合物、膜筏、線粒體外膜、細(xì)胞外外泌體、胞質(zhì)等。病毒進(jìn)入人體后，最外層的刺突蛋白通過與人的呼吸道上皮細(xì)胞表面特異性受體（ACE2蛋白）結(jié)合，再通過細(xì)胞的胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞，冠狀病毒進(jìn)入細(xì)胞后直接以病毒基因組RNA為翻譯模板，表達(dá)出病毒RNA聚合酶［20］。再利用這個(gè)酶完成負(fù)鏈亞基因組RNA的轉(zhuǎn)錄合成、各種結(jié)構(gòu)蛋白mRNA的合成，以及病毒基因組RNA的復(fù)制，這些都在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)進(jìn)行。MF分析可見玉屏風(fēng)散的靶點(diǎn)主要涉及蛋白結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白質(zhì)同源二聚化活性、BH3域結(jié)合、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子活性等分子功能。SARS-Cov-2是一種單鏈RNA正鏈包膜β冠狀病毒，其基因組編碼結(jié)構(gòu)蛋白刺突糖蛋白，刺突蛋白與ACE2蛋白結(jié)合，再通過細(xì)胞的胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞。另外，冠狀病毒感染細(xì)胞是一個(gè)復(fù)雜的過程，需要ACE2受體結(jié)合和刺突糖蛋白的蛋白水解過程的協(xié)同作用來促進(jìn)病毒-細(xì)胞融合。在宿主細(xì)胞感染病毒之后，宿主的蛋白酶對S蛋白進(jìn)行蛋白水解，產(chǎn)生兩個(gè)功能亞單位，即S1和S2。S1亞單位包括受體結(jié)合區(qū)，S2錨定在病毒膜上促進(jìn)病毒細(xì)胞融合。因此，刺突糖蛋白被認(rèn)為是開發(fā)抗病毒藥物的重要靶標(biāo)［21］。

KEGG通路分析結(jié)果顯示，玉屏風(fēng)散預(yù)防COVID-19主要涉及癌癥通路、HIF-1信號通路、癌癥中的轉(zhuǎn)錄失調(diào)、p53信號通路、PI3K-Akt信號通路、細(xì)胞凋亡等通路。HIF-1α是HIF-1的亞單位組成，是缺氧狀態(tài)下激活的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在缺氧條件下可穩(wěn)定表達(dá)，是維持細(xì)胞內(nèi)氧環(huán)境穩(wěn)定的核心轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α是肺部炎性損傷的關(guān)鍵因子［22］。在缺氧條件下HIF-1α可抑制ACE2的表達(dá)，而ACE催化的ANGⅡ的積累是HIF-1α下調(diào)ACE2的關(guān)鍵中介物［23］。另外PI3K/AKT通路與呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［24］。研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號通路在ACE2促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞eNOS活性中發(fā)揮重要作用［25］。提高的ACE2可通過AT1受體-PI3K/AKT途徑減弱小鼠系膜細(xì)胞血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的膠原生成，改善促纖維化作用［26］。可見，ACE2與PI3K/AKT通路可能存在一定的交互作用，PI3K/AKT通路可能介導(dǎo)ACE2參與玉屏風(fēng)散對COVID-19預(yù)防。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對玉屏風(fēng)散主要有效成分作用于ACE2相關(guān)基因進(jìn)行分析，初步探索其潛在預(yù)防COVID-19的分子機(jī)制，結(jié)果表明，玉屏風(fēng)散是可能通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路介導(dǎo)ACE2來發(fā)揮預(yù)防COVID-19的作用，其中CASP3、EGFR等基因可能為其作用關(guān)鍵靶點(diǎn)，HIF-1信號通路、PI3K-Akt信號通路等通路可能參與其中，但其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。