李金哲,湯亞飛,莫翠萍,羅婉笛,陳錦清,蔡健和,鄧清超,章松柏,李戰(zhàn)彪

(1.農(nóng)林病蟲害預(yù)警與調(diào)控湖北省工程技術(shù)研究中心/長江大學(xué),湖北 荊州 434025;2.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南果蔬綠色防控重點實驗室/廣西作物病蟲害生物學(xué)重點實驗室,南寧 530007;3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所/廣東省植物保護新技術(shù)重點實驗室,廣州 510640)

【研究意義】辣椒(CapsicumannuumL.)是重要的蔬菜作物,年播種面積在1.5×106～2.0×106hm2,辣椒產(chǎn)業(yè)已成為蔬菜的第一大產(chǎn)業(yè)[1-2]。隨著辣椒種植面積和種植區(qū)域的逐步擴大,辣椒病毒病日益嚴重。因此,明確侵染辣椒的病毒種類及病毒分離物間的遺傳進化關(guān)系有助于辣椒病毒病的防控,同時為辣椒抗病毒育種提供理論指導(dǎo)?！厩叭搜芯窟M展】世界上已報道侵染辣椒的病毒有70種以上[3-5],國內(nèi)報道33種[6-9]。由于氣候、環(huán)境等因素影響,不同地區(qū)辣椒感染的病毒種類也有差異,王少立等[10]發(fā)現(xiàn)侵染山東辣椒的主要病毒為黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)和辣椒輕斑駁病毒(Pepper mild mottle virus,PMMoV),湯亞飛等[11]通過對廣東省辣椒病毒種類進行檢測發(fā)現(xiàn),侵染廣東辣椒的優(yōu)勢病毒為辣椒輕斑駁病毒(PMMoV)、甜椒脈斑駁病毒(Pepper veinal mottle virus,PVMV)和辣椒脈斑駁病毒(Chilli veinal mottle virus,ChiVMV)。付尚松[12]對貴州辣椒病毒病調(diào)查檢測中發(fā)現(xiàn),黃瓜花葉病毒(CMV)、煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)和辣椒輕斑駁病毒(PMMoV)為侵染辣椒的主要病毒。嚴婉榮等[13]在對侵染海南省辣椒的病毒種類進行調(diào)查檢測時發(fā)現(xiàn),侵染海南辣椒的優(yōu)勢病毒為黃瓜花葉病毒(CMV)和煙草花葉病毒(TMV)。龔明霞等[14]則證實侵染廣西辣椒的優(yōu)勢病毒為小米椒內(nèi)源 RNA 病毒 1(Capsicumfrutescens endornavirus 1,CFEV 1)、辣椒脈斑駁病毒(ChiVMV)、黃瓜花葉病毒(CMV)和甜椒脈斑駁病毒(PVMV)。近年來,雙生病毒侵染辣椒的現(xiàn)象也日益嚴重,范曉堃[15]在西南地區(qū)采集辣椒樣品進行檢測,發(fā)現(xiàn)樣品中存在番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)。劉晨等[16]在對陜西不同地區(qū)辣椒病毒進行調(diào)查檢測時發(fā)現(xiàn),各地區(qū)辣椒均攜帶TYLCV,胡明鑫等[17]在天津辣椒樣品中鑒定出TYLCV。迄今為止,尚未有雙生病毒侵染廣西辣椒的相關(guān)報道。【本研究切入點】近年來,廣西農(nóng)科院植保所植物病毒課題組持續(xù)關(guān)注茄科作物病毒病的發(fā)生情況,2022年3月,該課題組在調(diào)查中發(fā)現(xiàn),廣西百色市的辣椒葉片呈現(xiàn)皺縮、黃化、葉片上卷等癥狀,疑似受到雙生病毒侵染,但具體病原種類尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】擬通過分子生物學(xué)手段,利用PCR、分段克隆、序列比對和進化樹構(gòu)建等方法對疑似感染雙生病毒的辣椒樣品進行鑒定,并對各病毒分離物進行遺傳進化分析,研究結(jié)果將為辣椒病毒病的高效防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來源

毒源:2022年采自廣西百色田間出現(xiàn)黃化、皺縮、上卷等癥狀的辣椒葉片樣品(圖1),編號為BS64、BS65、BS66、BS67,樣品于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 辣椒總DNA提取

取100 mg辣椒葉片樣品,選擇上海生工生物工程股份有限公司的Ezup 柱式植物基因組 DNA 提取試劑盒進行總DNA提取,具體操作按試劑說明書進行,最終加入50 μL去離子水溶解DNA沉淀,將得到的DNA溶液置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 廣西辣椒樣品中菜豆金色花葉病毒屬病毒的PCR檢測

利用菜豆金色花葉病毒屬病毒通用簡并引物AV494:GCCYATRTAYAGRAAGC,CMAG/CoPR:GA NGSATGHTRCADGCCATATA[18-19]對采集到的辣椒葉片總DNA進行PCR檢測,以辣椒葉片總DNA為模板,對4份疑似病樣進行PCR檢測。反應(yīng)體系(25 μL):2×DreamTaqPCR Master Mix[生工生物工程(上海)股份有限公司]12.5 μL,10 μmol/L AV494和CoPR 引物各 0.5 μL,辣椒葉片總DNA 1 μL,滅菌水10.5 μL。反應(yīng)程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s;52 ℃ 45 s;72 ℃ 30 s,35 個循環(huán);72 ℃ 10 min。所得的PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測,檢測為陽性的辣椒樣品保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 廣西辣椒樣品中菜豆金色花葉病毒屬病毒全基因組序列擴增

為獲得侵染辣椒的雙生病毒的全基因序列,參考已登錄GenBank的TYLCV(GenBank登錄號:MG904859和KY783940)、中國番木瓜曲葉病毒(Papaya leaf curl China virus, PaLCuCNV)(GenBank登錄號:KU892661和MW779523)設(shè)計2對背靠背引物,TYLCV-F:TTGGTGGGCCCTCTGGAATG/TYLCV-R:TAACTGTAGCATGAAATTTCCTCATC,PaLCuCNV-F:ACTGTTACTGGTGGTCAGTATGCTAGT/Pa LCuCNV-R:GCGTTTCTTAAGAGTATTTAGGG。以辣椒葉片總DNA為模板進行PCR擴增,PCR 反應(yīng)程序:95 ℃ 3 min;95 ℃ 15 s,52 ℃ 45 s,72 ℃ 3 min,35 個循環(huán);72 ℃ 10 min。反應(yīng)體系(50 μL):DNA模板2 μL,正反向引物(10 μmol/L)各0.5 μL,2×Phata Max Master Mix 25 μL,ddH2O 22 μL。

將PCR擴增獲得的靶標(biāo)條帶利用DNA凝膠回收試劑盒[生工生物工程(上海)股份有限公司]進行分離純化。純化后的PCR產(chǎn)物克隆至pMD18T載體得到連接產(chǎn)物,將得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α,獲得的菌液涂布含有Amp抗生素的LB培養(yǎng)基平板,平板倒置培養(yǎng)過夜。委托生工生物工程(上海)股份有限公司對確定為陽性克隆的菌落進行測序。

1.5 廣西辣椒樣品中菜豆金色花葉病毒屬病毒的序列分析及進化樹構(gòu)建

利用SeqMan軟件對從辣椒樣品中擴增獲得的序列進行拼接,獲得病毒基因組全長序列,將獲得的病毒全基因序列在NCBI中利用在線軟件ORF finder 和blastn分別進行ORF預(yù)測和序列比對分析。進一步利用SDT軟件對獲得的病毒基因組全長序列進行核苷酸相似性比對分析;通過MEGA 7.0軟件進行進化樹的構(gòu)建,選擇最大似然法為最優(yōu)樹,步值設(shè)置為1000。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒葉片樣品的 PCR 檢測結(jié)果

采用菜豆金色花葉病毒屬病毒的簡并引物 AV494/CoPR對辣椒葉片樣品的總 DNA進行PCR檢測, 健康的辣椒葉片樣品為陰性對照,確定感染TYLCV的番茄葉片樣品為陽性對照。PCR檢測結(jié)果顯示,4份樣品均可擴增出長度為570 bp的特異目的片段,而健康的辣椒葉片未擴增出任何條帶。

圖1 田間被雙生病毒侵染的辣椒葉片癥狀Fig.1 Symptoms of the leaves of pepper infected by begomoviruses in filed

將所得的PCR產(chǎn)物直接進行測序,所得序列在GenBank中進行blastn分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),所得序列分別與TYLCV、PaLCuCNV等病毒分離物具有較高的核苷酸相似性。以上結(jié)果證實4份辣椒樣品中均存在菜豆金色花葉病毒屬病毒。

2.2 廣西辣椒樣品中菜豆金色花葉病毒屬病毒分離物基因組克隆及序列分析

為獲得辣椒中菜豆金色花葉病毒屬病毒全長基因組,從檢測為陽性的辣椒總DNA中挑選2個樣品(編號:BS66、BS67)分別進行PCR擴增,以辣椒葉片總DNA為模板,參考已登錄GenBank的TYLCV(GenBank登錄號:MG904859和KY783940)、PaLCuCNV(GenBank登錄號:KU892661和MW779523)設(shè)計2對背靠背引物:TYLCV-F/TYLCV-R、PaLCuCNV-F/PaLCuCNV-R。對檢測為陽性的2個辣椒樣品分別擴增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析(圖2)發(fā)現(xiàn),BS66利用2對引物均可擴增出約2.7 kb的PCR條帶,而BS67僅TYLCV-F/R可以擴增出約2.7 kb的PCR條帶。切取PCR擴增獲得的靶標(biāo)條帶進行分離純化、連接、轉(zhuǎn)化等,經(jīng)菌落PCR檢測后,挑選陽性克隆進行測序。經(jīng)克隆、序列測定和BLAST比對分析發(fā)現(xiàn),從辣椒樣品BS66、BS67中共獲得3條全基因序列,分別為BS66-1、BS67-1、BS66-2。其中,BS66-1與TYLCV分離物的核苷酸相似性均在91%以上,BS67-1與大部分用于分析TYLCV分離物的核苷酸相似性均在91%以上,但與TYLCV韓國、伊拉克、西班牙分離物(GenBank登錄號:ON982201、MT583814、AF071228)則在90%以上。BS66-1與番茄黃化曲葉病毒中國分離物(GenBank登錄號:MT969010)相似性最高在99.67%,與TYLCV中國北京、廣東、福建等地分離物(GenBank登錄號:KT338296、MW779534、MN842311)的相似性為92.69%、92.86%、92.79%,與TYLCV墨西哥分離物(GenBank登錄號:EF523478)相似性也在92%以上。BS67-1與TYLCV廣西分離物(GenBank登錄號:MW389934)相似性最高達98%,與TYLCV中國山西、廣東、遼寧等地的分離物(GenBank登錄號:OM677619、MW735449、KJ754191)相似性達93.98%、91.84%、91.88%。序列BS66-2與PaLCuCNV廣西分離物(GenBank登錄號:MW779523、JX12 8102)相似性最高達99.67%,其中與中國重慶、河南分離物(GenBank登錄號:OL310479、EU8 74386)相似性達92.49%、95.68%,與越南分離物(GenBank登錄號:KC878474)相似性達92.06%。

M.DL 2000 DNA標(biāo)記;1.陽性對照;2～5.樣品BS64-67;6.CK(健康對照樣品)。M.DL 2000 DNA Marker(TaKaRa);1.Tomato leaf sample infected by TYCD(CK+);2-5.Diseased pepper leaf samples;6.CK(Control sample).

使用SDT軟件對獲得的3條全基因序列進行核苷酸相似性分析,發(fā)現(xiàn)TYLCV廣西辣椒分離物BS66-1、BS67-1與本研究用于分析的其他TYLCV各分離物的核苷酸相似性大部分在91%以上(圖3)。PaLCuCNV廣西辣椒分離物BS66-2與本研究用于分析的其他PaLCuCNV各分離物核苷酸相似性達到91%以上(圖4)。依據(jù)目前國際雙生病毒分類標(biāo)準(zhǔn),侵染廣西辣椒的雙生病毒分別屬于TYLCV和PaLCuCNV的分離物,各序列在GenBank的登錄號為:BS66-1(GenBank登錄號:OQ190458)、BS67-1(GenBank登錄號:OQ383543)、BS66-2(GenBank登錄號:OQ383309)。

圖3 TYLCV廣西辣椒分離物BS66-1、BS67-1與其他19個TYLCV分離物相似性比對Fig.3 Sequence identity comparison of TYLCV Guangxi pepper BS66-1,BS67-1 isolates and other 19 isolates of TYLCV

圖4 PaLCuCNV廣西辣椒分離物BS66-2與其他16個PaLCuCNV分離物相似性比對Fig.4 Sequence identity comparison of PaLCuCNV Guangxi pepper BS66-2 isolates and other 16 isolates of PaLCuCNV

2.3 TYLCV廣西辣椒分離物的遺傳進化分析

為了解本研究中得到的2個TYLCV廣西辣椒分離物與已登錄Genkbank的19個TYLCV分離物的進化關(guān)系,利用MEGA 7.0軟件進行進化樹的構(gòu)建,最大似然法構(gòu)建進化樹為最優(yōu)樹(圖5)。本研究獲得的2個序列處于不同分支,其中BS66-1與TYLCV中國SG1分離物(GenBank登錄號:MT969010,寄主:番茄)處于同一個小分支,說明兩者具有較近的親緣關(guān)系;而BS67-1則與中國廣西的GX分離物(GenBank登錄號:MW389934,寄主:番茄)和BS3分離物(GenBank登錄號:MT375610,寄主:番茄)處于相同分支,說明三者具有較近的親緣關(guān)系,但BS67-1又處于1個獨立的分支,可能又具有相對獨立的進化。

圖5 TYLCV廣西辣椒分離物BS66-1、BS67-1與其他19個分離物的全長核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of TYLCV Guangxi pepper BS66-1,BS67-1 and other 19 isolates based on full-length sequence

2.4 PaLCuCNV 廣西辣椒分離物的遺傳進化分析

將PaLCuCNV廣西辣椒分離物和已登錄GenBank的16個PaLCuCNV分離物用MEGA 7.0軟件中的最大似然法進行進化樹構(gòu)建(圖6),了解本研究中得到的1個PaLCuCNV廣西辣椒分離物與已報道的PaLCuCNV分離物的進化關(guān)系。PaLCuCNV廣西辣椒分離物BS66-2與PaLCuCNV中國廣西3個分離物處于同一個大分支,并且PaLCuCNV廣西辣椒分離物BS66-2與PaLCuCNV GX01(GenBank登錄號:MW779523,寄主:番茄)處于同一個小分支,說明三者親緣關(guān)系較近,但廣西辣椒分離物與PaLCuCNV GX01具有更近的親緣關(guān)系。

圖6 PaLCuCNV廣西辣椒分離物BS66-2與其他16個分離物的全長核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of PaLCuCNV Guangxi pepper BS66-2 and other 16 isolates based on full-length sequence

3 討 論

本研究對廣西百色市葉片表現(xiàn)出黃化、皺縮、葉片上卷等癥狀的辣椒進行鑒定后證實,辣椒受到雙生病毒的侵染,進一步利用分段克隆、核苷酸序列比對分析、進化樹構(gòu)建等方法,從2個辣椒陽性樣品中共獲得3條雙生病毒的全基因序列,這3條序列分別與番茄黃化曲葉病毒不同分離物的序列和中國番木瓜曲葉病毒不同分離物序列的核苷酸相似性均在91%以上,根據(jù)國際病毒分類委員會對菜豆金色黃花葉病毒的分類標(biāo)準(zhǔn)[20],病毒DNA-A的核苷酸相似性大于91%則認為是同種病毒的不同分離物。因此,侵染廣西辣椒的病毒分別屬于TYLCV和PaLCuCNV分離物。本研究是TYLCV和PaLCuCNV侵染廣西辣椒的首次報道。

通過構(gòu)建進化樹的方式對本研究中獲得的3條序列進行遺傳進化分析發(fā)現(xiàn),本研究獲得的TYLCV BS66-1與TYLCV中國分離物SG1(GenBank登錄號:MT969010)處于同一個小分支,說明其親緣關(guān)系較近;而TYLCV BS67-1則與TYLCV中國廣西分離物GX(GenBank登錄號:MW389934)處于同一個小分支,說明其親緣關(guān)系較近。PaLCuCNVBS66-2則與PaLCuCNV中國河南、廣西分離物處于相同大分支,親緣關(guān)系較近。

TYLCV和PaLCuCNV均屬于雙生病毒科的菜豆金色花葉病毒屬病毒,TYLCV最早于1934—1946年在以色列被發(fā)現(xiàn),1964年被正式命名[21-22]。在中國,TYLCV自2006年在浙江、上海等地發(fā)現(xiàn)以來,快速蔓延至山東、河南、北京、廣東等地[23-24]。TYLCV于2019年傳入廣西,在番茄上得到鑒定[25],2年后又被再次確認侵染廣西的辣椒,證實該病毒正在廣西區(qū)內(nèi)擴散蔓延。PaLCuCNV以番木瓜為自然寄主,首次在廣西被Wang等[26]發(fā)現(xiàn),主要分布在云南、廣西、廣州等地[27-29],本研究則證實辣椒是PaLCuCNV的自然寄主。

廣西是我國重要的冬種蔬菜生產(chǎn)基地,承擔(dān)著南菜北運的重要使命。辣椒是廣西蔬菜生產(chǎn)中重要的品種,辣椒產(chǎn)業(yè)也是廣西部分地區(qū)收入增長的主要來源[30]。本研究在百色市田陽區(qū)的調(diào)查中發(fā)現(xiàn),番茄與辣椒混合種植較為普遍,栽種模式增加了不同作物間病毒互相傳染的概率。而田陽種植的番茄種苗大多為本地生產(chǎn),但也存在從福建、云南、四川等多地調(diào)苗的現(xiàn)象,番茄種苗區(qū)外調(diào)運的現(xiàn)象則加劇了區(qū)域間蟲媒病毒的傳播,適宜的傳播環(huán)境更易造成病毒病害的擴散蔓延。因此,應(yīng)加強檢疫,防止病毒通過種苗傳播蔓延,另外,也應(yīng)加強對該類病毒的監(jiān)測,及時了解病毒種類動態(tài)變化。同時,生產(chǎn)中應(yīng)種植抗病品種,控制煙粉虱的數(shù)量,以此達到控制病毒傳播,防范病毒蔓延的目的。

4 結(jié) 論

廣西百色市辣椒呈現(xiàn)葉片上卷、黃化、皺縮等癥狀的病毒病原為TYLCV和PaLCuCNV。通過進化樹分析發(fā)現(xiàn),本研究獲得的TYLCV和PaLCuCNV辣椒分離物與GenBank已報道的TYLCV和PaLCuCNV番茄分離物均具有較近的親緣關(guān)系,說明這2種病毒可能是經(jīng)番茄傳播至辣椒,今后應(yīng)加強監(jiān)測。