蔡理,姚锃鈺,楊路,許秀洪,羅夢(mèng),周國(guó)平,

(1.南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院,廣州 510515;2.南方醫(yī)科大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院,廣州 510315)

腦血管病是全國(guó)第一大、全球第二大致死性疾病,其高發(fā)病率、高病死率和高致殘率使其成為目前最為威脅人類健康的疾病之一,嚴(yán)重增加社會(huì)負(fù)擔(dān)[1-2]。隨著老齡化的進(jìn)展,我國(guó)缺血性腦梗死發(fā)病率也正在逐年上升[3]。大腦缺血一定時(shí)間后血液再次恢復(fù)供應(yīng),其功能不僅未能恢復(fù),反而出現(xiàn)了更加嚴(yán)重的腦功能障礙,稱為腦缺血再灌注(cerebral ischemia reperfusion, CIR)損傷[4]。CIR后神經(jīng)元損傷是由多種機(jī)制參與的一種復(fù)雜的病理生理過(guò)程,多種環(huán)節(jié)因素之間又互相作用。細(xì)胞焦亡是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)并證實(shí)的程序性細(xì)胞死亡方式,其發(fā)生伴隨炎癥反應(yīng),是CIR后神經(jīng)元損傷的重要形式之一[5]。減輕細(xì)胞焦亡及炎癥反應(yīng)的發(fā)生有助于 CIR后大腦損害,是卒中防治機(jī)理研究的熱點(diǎn)[6]。針刺是臨床治療缺血性卒中的有效方法,大量研究表明,針刺能改善 CIR損傷,減少神經(jīng)元死亡[7]。為了進(jìn)一步闡明針刺治療腦缺血中風(fēng)病的機(jī)理,為臨床治療提供思路,本文就近年來(lái)針刺抗卒中病涉及細(xì)胞焦亡及相關(guān)標(biāo)志物的研究作一綜述。

1 細(xì)胞焦亡概述

細(xì)胞焦亡被描述最早可追溯到 198 6年,Friendlnnder等發(fā)現(xiàn)炭疽致死性毒素可使小鼠巨噬細(xì)胞死亡,并伴隨胞內(nèi)物質(zhì)快速釋放,但這種不同于凋亡的細(xì)胞死亡方式并未引起當(dāng)時(shí)學(xué)界的重視[8]。直至2001年, GALLUZZI L等[9]發(fā)現(xiàn)細(xì)菌感染的巨噬細(xì)胞經(jīng)歷了依賴半胱氨酸天冬酶-1(Caspase-1)活性的快速裂解細(xì)胞死亡后,細(xì)胞焦亡一詞才被正式定義。細(xì)胞焦亡的形態(tài)學(xué)特征、發(fā)生及調(diào)控機(jī)制等均不同于凋亡、壞死等其他細(xì)胞死亡方式。研究表明,焦亡細(xì)胞在形態(tài)上同時(shí)具有凋亡和壞死的特征,其形態(tài)學(xué)特征為核碎裂、核溶解;細(xì)胞膜滲透性增高,細(xì)胞腫脹破裂,引起胞內(nèi)物質(zhì)和促炎因子釋放,如白介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白介素-18(interleukin-18, IL-18)等,誘發(fā)炎癥反應(yīng)[10-11]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞發(fā)生焦亡時(shí),細(xì)胞膜有1～2 nm的小孔形成,正是這些小孔使細(xì)胞內(nèi)的離子平衡喪失,水分內(nèi)流,細(xì)胞腫脹繼而膜破裂,細(xì)胞發(fā)生滲透性溶解[11]。

上述細(xì)胞焦亡的形態(tài)學(xué)特征是由Caspase-1介導(dǎo)產(chǎn)生的,內(nèi)源性和外源性的刺激信號(hào)通過(guò)不同途徑激活 Caspase-1,Caspase-1繼而將無(wú)活性的 IL-1β、IL-18前體裂解為具有活性的炎癥細(xì)胞因子,激活其他免疫細(xì)胞,誘導(dǎo)其他炎癥細(xì)胞因子、趨化因子、黏附分子等的合成,放大局部和全身炎癥反應(yīng),形成“級(jí)聯(lián)效應(yīng)”[12-13]。因此,Caspase-1對(duì)細(xì)胞焦亡的形成起決定性作用,已證實(shí)在大鼠短暫性腦缺血后,皮質(zhì)及海馬CA1區(qū)錐體神經(jīng)元IL-1β在缺血3 h表達(dá)最顯著,且動(dòng)態(tài)變化與腦水腫變化時(shí)間一致,應(yīng)用 Caspase-1抑制劑YVAD-CMK可顯著減少腦組織IL-1β的含量,減輕腦水腫,改善缺血性腦損傷[14]。炎癥小體(inflammasome)是一種多蛋白質(zhì)復(fù)合物,它的組裝可以導(dǎo)致Caspase-1被激活。在識(shí)別外源性或內(nèi)源性病原相關(guān)分子后,Nod樣受體家族(Nod-like receptor, NLRs)部分成員發(fā)生自身寡聚化,在接頭蛋白ASC(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD, ASC)的銜接下與 Pro-Caspase-1連接形成活化的小體,從而把無(wú)活性的 Caspase-1剪切為有活性的Caspase-1[15-16]。其中NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白 3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3, NLRP3)是NLR蛋白家族中細(xì)胞焦亡中的主要炎性復(fù)合物,可對(duì)多種刺激進(jìn)行應(yīng)答,具有整合多種類型的危險(xiǎn)信號(hào)從而使 Caspase-1活化的能力,是腦缺血后中樞神經(jīng)系統(tǒng)無(wú)菌性炎癥反應(yīng)的始動(dòng)因子,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡和炎癥反應(yīng)[17]。除上述途徑,還有一類為依賴Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11的非經(jīng)典途徑。在革蘭氏陰性菌等信號(hào)刺激下,活化的Caspase-4、Caspase-5和Caspase-11切割gasdermin D(GSDMD),誘導(dǎo)細(xì)胞膜穿孔破裂,釋放內(nèi)容物并引起炎癥反應(yīng)[18]。細(xì)胞焦亡是機(jī)體重要天然免疫反應(yīng),在拮抗感染和內(nèi)源危險(xiǎn)信號(hào)中起著關(guān)鍵作用。大量研究[19-21]表明,Caspase-1廣泛參與了感染性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、動(dòng)脈粥樣硬化性等疾病的發(fā)生發(fā)展,并在其中發(fā)揮了重要作用。

2 細(xì)胞焦亡與CIR損傷

CIR損傷的病理生理過(guò)程非常復(fù)雜,目前的研究主要認(rèn)為涉及該過(guò)程的機(jī)制主要有自由基損傷、炎癥反應(yīng)、線粒體功能障礙、細(xì)胞自噬、鈣超載等[22]。炎癥反應(yīng)的發(fā)生貫穿 CIR的整個(gè)過(guò)程,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)發(fā)生CIR的腦組織中IL-1β、IL-6等炎癥因子呈高表達(dá),對(duì)神經(jīng)元的損傷起到重要的作用[23]。腦缺血發(fā)生的早期,缺血區(qū)腦血流速度減慢,中性粒細(xì)胞黏附至血管內(nèi)皮細(xì)胞啟動(dòng)炎癥反應(yīng),血流恢復(fù)供應(yīng)后,外源性炎性細(xì)胞透過(guò)血腦屏障到達(dá)腦缺血區(qū),形成繼發(fā)性低灌注,大量氧自由基開(kāi)始釋放;另一方面,中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的星形膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞活化、增殖,產(chǎn)生大量炎癥介質(zhì),增加興奮性氨基酸毒性,進(jìn)一步釋放氧自由基[24-25]。在這些內(nèi)源/外源性刺激下,多個(gè)炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被激活,促使NLRP1、NLRP3等寡聚化,通過(guò)接頭蛋白ASC與相關(guān)受體結(jié)合并招募Pro-Caspase-1從而形成炎癥小體,而 Caspase-1前體又能被炎癥小體裂解,使其變成活化的 Caspase-1最終誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生焦亡,同時(shí)放大炎癥反應(yīng),加重腦缺血再灌注損傷[26]。

此外,有研究表明,CIR發(fā)生時(shí)線粒體的過(guò)度分裂將導(dǎo)致自身功能發(fā)生障礙,異常線粒體與氧化酶結(jié)合產(chǎn)生大量氧自由基,激活NLRP3等炎性小體,并為炎性復(fù)合體的組裝提供平臺(tái),從而激活 Caspase-1并誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡的發(fā)生[27]。而在腦缺血再灌注的中晚期,大量細(xì)胞自噬性死亡,細(xì)胞內(nèi)容物釋放并激活 NLRP3等炎性小體,也能誘導(dǎo)周邊細(xì)胞發(fā)生壞死或焦亡[28]?？傊?作為伴隨炎癥反應(yīng)而產(chǎn)生的細(xì)胞焦亡在CIR的病理生理過(guò)程中發(fā)揮重要作用,并與其他機(jī)制密切相關(guān),腦缺血后 NLRP3、ASC及 Caspase-1等蛋白表達(dá)均有所升高,IL-1β、IL-18等炎癥因子呈高表達(dá),而敲除NLRP3基因或使用Caspase-1抑制劑可顯著減少神經(jīng)元死亡,改善缺血再灌注損傷[29-30]。

3 細(xì)胞焦亡在針刺抗CIR損傷中的研究

臨床上針灸治療中風(fēng)病具有良好的效果,閆志剛等[31]對(duì)靳三針治療中風(fēng)后痙攣性偏癱進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)針刺能提高中風(fēng)后運(yùn)動(dòng)功能與日常生活活動(dòng)能力,康復(fù)訓(xùn)練的基礎(chǔ)上配合針刺治療能進(jìn)一步提高偏癱患者肢體恢復(fù)能力;楚佳梅等[32]證實(shí)電針刺激腦平衡區(qū)對(duì)提高偏癱患者站立平衡功能、改善其步行能力有較好的幫助。劉憲印[33]對(duì)頭三針聯(lián)合體針治療缺血性卒中后認(rèn)知障礙進(jìn)行研究,結(jié)果表明針刺促進(jìn)了中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)中乙酰膽堿的分泌和合成,從而改善患者的認(rèn)知功能和記憶功能。此外,針灸對(duì)改善中風(fēng)病患者吞咽障礙、睡眠障礙、抑郁等諸癥都有較好的療效[34-35]。大量基礎(chǔ)研究也顯示針刺干預(yù)能顯著改善CIR后的神經(jīng)功能缺損癥狀,降低腦梗死面積,減少神經(jīng)細(xì)胞死亡等,其中關(guān)于抗神經(jīng)元損傷的研究主要集中在細(xì)胞凋亡、自噬及壞死[36-37],但對(duì)細(xì)胞焦亡這一近年新發(fā)現(xiàn)并證實(shí)的細(xì)胞死亡方式的研究報(bào)道尚少。

3.1 針刺抗CIR損傷后伴隨炎癥反應(yīng)的相關(guān)研究

細(xì)胞焦亡的發(fā)生伴隨炎癥反應(yīng),而炎癥反應(yīng)是腦缺血損傷的重要機(jī)制。大量研究顯示針刺抗CIR后損傷大的作用機(jī)制和減輕炎癥損傷有關(guān),其中也包括針刺對(duì) NLRP3等炎性小體和IL-1β、IL-18等炎癥因子的調(diào)控作用。張亞敏等[38]發(fā)現(xiàn),針刺百會(huì)和足三里可下調(diào)大鼠外周血清IL-1β和IL-6的表達(dá),以24～48 h最顯著,提示針刺可抑制腦缺血損傷早期炎癥反應(yīng)并延緩組織損傷。卞煒等[39]發(fā)現(xiàn)電針百會(huì)、合谷和太沖可抑制大腦中動(dòng)脈阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)大鼠皮質(zhì)區(qū)嘌呤能受體P2X7R(purinergic 2X7 receptor,P2X7R)/NLRP3表達(dá),減少小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量,并下調(diào)IL-1β、IL-18等炎癥因子含量從而減輕腦缺血再灌注損傷。ZHANG T等[40]研究顯示針刺能抑制卒中各時(shí)期炎癥小體NLRP3和ASC的表達(dá)及相關(guān)炎癥因子IL-1β、TNF-α、IL-6的釋放,減輕腦組織水腫和神經(jīng)性炎癥,發(fā)揮腦保護(hù)作用。此外,針刺可能對(duì)不同炎癥因子存在雙向調(diào)控,方晨晨等[41]研究發(fā)現(xiàn),電針可以通過(guò)增加IL-4表達(dá)量,降低TNF-α表達(dá)量,提升 IL-4/TNF-α的比值從而發(fā)揮抗炎作用,抑制缺血再灌注區(qū)的炎癥反應(yīng),減小腦梗死體積并促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)。上述研究證明針刺可減輕腦缺血后的炎癥反應(yīng),同時(shí)對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生焦亡的炎癥小體和級(jí)聯(lián)效應(yīng)下游的炎癥因子具有調(diào)控作用,為針刺抗細(xì)胞焦亡的可能性提供了理論依據(jù),但遺憾的是并未對(duì)細(xì)胞焦亡這一細(xì)胞死亡方式做過(guò)多探究。

3.2 針刺抗 CIR損傷后神經(jīng)細(xì)胞焦亡調(diào)控因子的相關(guān)研究

Caspase家族是細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵調(diào)控基因,通過(guò)敲除Caspase-1基因或使用Caspase-1抑制劑能有效降低細(xì)胞焦亡,減輕卒中損傷,故Caspase-1在實(shí)驗(yàn)研究中常被作為細(xì)胞發(fā)生焦亡的標(biāo)記物[42-43]。最新的研究顯示,針刺可直接對(duì) Caspase-1等細(xì)胞焦亡調(diào)控因子進(jìn)行調(diào)控,減少神經(jīng)細(xì)胞焦亡發(fā)生從而改善 CIR損傷。許秀洪等[44]發(fā)現(xiàn),電針足三里、三陰交、尺澤和合谷可下調(diào)MACO大鼠海馬區(qū)Caspase-1的mRNA及蛋白水平,改善CIR損傷,HE染色顯示電針干預(yù)后發(fā)生焦亡的細(xì)胞數(shù)量減少。董苗苗等[45]發(fā)現(xiàn)電針可減少 MACO大鼠神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞死亡,并下調(diào) Caspase-1、IL-1β、IL-18及 TNF-α表達(dá),電鏡下觀察到海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生焦亡減少。劉昱麟等[46]則通過(guò)眼針干預(yù)CIRI大鼠,發(fā)現(xiàn)其能夠抑制缺血半暗帶區(qū) IL-1β、IL-18及 P2X7R、NLRP3、Pro-Caspase-1、ASC、Caspase-1的表達(dá),減少細(xì)胞焦亡的發(fā)生并發(fā)揮抗炎作用。上述研究均提示,針刺改善CIR后神經(jīng)細(xì)胞焦亡的機(jī)制可能是通過(guò)細(xì)胞焦亡產(chǎn)生的經(jīng)典途徑,即對(duì)NLRP3/Caspase-1的調(diào)控。但對(duì)于依賴 Caspase-4、Caspase-5、Caspase-11誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生焦亡的非經(jīng)典途徑,或下游執(zhí)行蛋白 GSDMD等針刺干預(yù)可能存在的調(diào)控機(jī)制,相關(guān)的研究報(bào)道尚少。

此外,細(xì)胞焦亡作為一種促炎性的細(xì)胞死亡方式,在多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程廣泛參與,其他研究者的發(fā)現(xiàn)中,也指出了針刺療法對(duì)細(xì)胞焦亡存在的抑制作用。李曉寧等[47]通過(guò)夾脊電針干預(yù)急性脊髓損傷模型大鼠,發(fā)現(xiàn)夾脊電針能夠使大鼠脊髓組織NLRP3、ASC、Cleaved Caspase-1表達(dá)下降,且在術(shù)后3、7 d兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)最顯著,提示夾脊電針可能發(fā)揮了抑制 NLRP3炎癥小體過(guò)度活化,降低Caspase-1表達(dá),減緩細(xì)胞焦亡的作用。李海波等[48]采用電針刺激急性腎損傷大鼠雙側(cè)足三里和腎俞,發(fā)現(xiàn)其能降低腎小管上皮細(xì)胞焦亡率,下調(diào)腎皮質(zhì)Caspase-1、IL-1β及其mRNA表達(dá)。ZHANG Y等[49]研究發(fā)現(xiàn),持續(xù)4周的電針治療顯著改善了由慢性不可預(yù)測(cè)應(yīng)激引起的抑郁樣行為,抑制了NLRP3炎性體組分表達(dá)和小膠質(zhì)細(xì)胞激活標(biāo)志物Iba-1的增加,并同時(shí)下調(diào)了IL-1β、TNF-α、IL-6表達(dá)。這些研究再次證實(shí)了針刺這一干預(yù)手段對(duì)細(xì)胞焦亡可能存在調(diào)控作用,且不局限于腦缺血病。

4 小結(jié)與展望

針刺是抗 CIR損傷的有效治療手段,但其具體作用機(jī)制尚未闡明。細(xì)胞焦亡這一新近發(fā)現(xiàn)并逐漸被學(xué)界重視的神經(jīng)細(xì)胞死亡方式,其發(fā)生依賴 Caspase家族的激活并同時(shí)伴隨炎癥反應(yīng)。目前的研究證實(shí),針刺干預(yù)能下調(diào) Caspase-1及相關(guān)炎癥因子的表達(dá),發(fā)揮抗炎作用并改善CIR損傷,但尚不能完全揭示其機(jī)理。首先,針刺穴位的選擇未能統(tǒng)一,相關(guān)研究多采用百會(huì)、合谷、足三里等,或單穴位進(jìn)行治療,橫向可比性較低。其次,治療窗口期是影響針刺調(diào)控CIR后細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵,不同研究選擇進(jìn)行針刺干預(yù)時(shí)間點(diǎn),以及干預(yù)次數(shù)和持續(xù)時(shí)長(zhǎng)其產(chǎn)生效果的差異性需進(jìn)一步分析。最后要指出的是,目前研究對(duì)細(xì)胞焦亡發(fā)生的信號(hào)通路缺乏整體研究,并在細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢測(cè)上未能予以重視,后續(xù)實(shí)驗(yàn)可從這些方面進(jìn)一步探索研究,以期揭示針刺的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制,并為臨床治療腦缺血病提供理論依據(jù)。