王俊柯，魏義勇，王海英

(1.遵義醫(yī)科大學(xué) 麻醉醫(yī)學(xué)院，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 麻醉科，貴州 遵義 563099)

目前發(fā)現(xiàn)的雙孔鉀離子通道有6類，15種亞型，各種亞型在不同的組織，參與了一系列重要生理功能[1]。雙孔鉀離子通道THIK(Two-pore-domain halothane-inhibited K+channel，THIK)于2001年被發(fā)現(xiàn)，包括THIK-1和THIK-2兩種亞型。Rajan等[2]通過逆轉(zhuǎn)錄-PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，THIK-1離子通道在腦、肺、腎、肝、胃、脾、骨骼肌、心臟和睪丸等組織中均有表達(dá)；運(yùn)用原位雜交技術(shù)檢測(cè)到THIK-1離子通道在成年大鼠嗅球顆粒細(xì)胞層、嗅結(jié)節(jié)、外側(cè)隔以及不同的下丘腦和丘腦核團(tuán)(下丘腦腹內(nèi)側(cè)核、乳頭狀外側(cè)核、網(wǎng)狀核、團(tuán)聚核)中均有表達(dá)[2]。Kang等[3]將轉(zhuǎn)染含有GFP質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞C端與THIK-1融合(THIK-1-GFP)，共聚焦圖像顯示，THIK-1定位于質(zhì)膜。THIK鉀離子通道是由4個(gè)跨膜片段(M1-M4)、2個(gè)孔結(jié)構(gòu)域(P1、P2)和一個(gè)位于M1-P1之間的環(huán)形螺旋帽結(jié)構(gòu)構(gòu)成的背景鉀離子通道[4]，吸入麻醉藥氟烷和異氟烷可抑制THIK離子通道電流，這是此類離子通道區(qū)別于其它類型雙孔鉀離子通道的一個(gè)顯著特征[1-2]。THIK-1和THIK-2離子通道高度同源，但THIK-2離子通道擁有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞內(nèi)沒有活性[5-6]。THIK-1離子通道在靜息膜電位下介導(dǎo)了內(nèi)向的鉀離子漏電流，從而參與細(xì)胞的興奮性和靜息膜電位[3, 7]。

目前已知THIK-1離子通道參與了多個(gè)重要的病理生理過程。例如，背根神經(jīng)節(jié)THIK-1離子通道表達(dá)增加參與了炎癥后疼痛的發(fā)生，使其可能成為治療潛在炎性疼痛靶點(diǎn)[8]。有研究發(fā)現(xiàn)，THIK-1離子通道還是吸入麻醉藥物作用的潛在分子靶點(diǎn)[9-11]。另外，THIK-1離子通道在人和小鼠的神經(jīng)系統(tǒng)疾病(多發(fā)性硬化癥)組織的小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)[12-13]。因此，本文綜述了THIK-1離子通道參與疼痛和神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及吸入麻醉藥的作用機(jī)制等。通過進(jìn)一步闡述THIK-1離子通道在這些領(lǐng)域中的具體作用，有助于以THIK-1離子通道作為潛在的分子靶點(diǎn)研發(fā)減輕疼痛、防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物，以及研發(fā)新型麻醉藥物。

1 THIK-1離子通道與疼痛

Djouhri等[14]報(bào)道外周病理性疼痛和急性疼痛可由部分神經(jīng)損傷、組織損傷和/或炎癥引起。背根神經(jīng)節(jié)(Dorsal root ganglia，DRG)初級(jí)傳入神經(jīng)元電生理特性的改變是引起和維持這種疼痛的關(guān)鍵。在炎性和病理性疼痛模型中，神經(jīng)細(xì)胞自發(fā)放電(Spontaneous firing)頻率增加、電閾值降低，自發(fā)[15]抬腳(Spontaneous foot lifting，一種自發(fā)疼痛的標(biāo)志)和/或完整纖維的傷害性感覺降低[14, 16-17]。根據(jù)生物物理特性的差異，鉀離子通道參與疼痛狀態(tài)的作用大小和性質(zhì)迥異，有學(xué)者認(rèn)為通過限制或阻止周圍神經(jīng)末梢的動(dòng)作電位(AP)啟動(dòng)來抑制外周興奮性，從而降低軸突的傳導(dǎo)保真度，或限制中樞終末的神經(jīng)遞質(zhì)釋放，這可能是參與了治療疼痛的機(jī)制[18-19]。鑒于鉀離子通道對(duì)維持胞體膜電位(Em)中的作用，因此被認(rèn)為是治療頑固性和病理性疼痛的潛在靶點(diǎn)[15, 19]。因此，對(duì)Em影響最大的K2P通道，被認(rèn)為是影響自發(fā)性疼痛發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

THIK-1離子通道由KCNK13基因編碼， Haskins等[8]結(jié)合免疫組化、Western blotting和行為學(xué)測(cè)試等手段，發(fā)現(xiàn)大鼠的所有DRG小神經(jīng)元，大量的中、大神經(jīng)元都表達(dá)THIK-1離子通道。有髓和無髓纖維、皮膚的神經(jīng)末梢和脊髓的I、II層也表達(dá)該離子通道。THIK-1離子通道染色與IB4(Isolectin B4，植物凝集素)結(jié)合和trkA(Tropomyosin-receptor kinase A，一種肽能傷害性感受器)共定位，提示該離子通道在傷害性感受器中廣泛表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)[8]THIK-1離子通道的功能與SFL持續(xù)時(shí)間呈顯著負(fù)相關(guān)，THIK-1離子通道表達(dá)降低會(huì)導(dǎo)致K+滲漏降低，從而引起靜息膜電位去極化。反過來，這將導(dǎo)致傷害性感受器自發(fā)放電易化。在DRG神經(jīng)元中，目前還沒有關(guān)于THIK-1離子通道對(duì)Em影響的數(shù)據(jù)，因此很難確定THIK-1離子通道在完全弗氏佐劑誘導(dǎo)的皮膚炎癥后1 d(CFA1)自發(fā)性疼痛中的確切作用，但是免疫熒光染色顯示，THIK-1離子通道在幾乎所有的小神經(jīng)元(C纖維傷害性感受器)以及中型和大型神經(jīng)元中均有表達(dá)，鑒于此，進(jìn)一步研究THIK-1離子通道對(duì)Em影響意義重大。

此外， Haskins等[8]也發(fā)現(xiàn)，在條件性敲除小鼠THIK-1離子通道會(huì)延長(zhǎng)的自發(fā)抬足持續(xù)時(shí)間，證明THIK-1離子通道在自發(fā)性疼痛中可能發(fā)揮一定作用。作者在小鼠足底注射完全弗氏佐劑誘導(dǎo)炎癥后1 d(CFA1)，胞漿和邊緣(膜相關(guān))THIK-1離子通道染色發(fā)現(xiàn)，同側(cè)小神經(jīng)元數(shù)量較正常側(cè)明顯減少。誘導(dǎo)炎癥后4 d(CFA4)，與正常相比，雙側(cè)小神經(jīng)元邊緣THIK-1離子通道表達(dá)降低。中、大型DRG神經(jīng)元在CFA1和CFA4處的THIK-1離子通道表達(dá)均無明顯變化。CFA1處同側(cè)(而非對(duì)側(cè))小神經(jīng)元THIK-1離子通道的平均強(qiáng)度與自發(fā)抬足時(shí)間(自發(fā)疼痛的標(biāo)志)呈顯著負(fù)相關(guān)。因此，THIK-1離子通道參與了炎癥調(diào)控皮膚傷害性感受器的表達(dá)。最后，siRNA敲除體內(nèi)THIK-1離子通道比siRNA干擾THIK-1離子通道大鼠具有更長(zhǎng)的自發(fā)抬足持續(xù)時(shí)間[8]。上述證據(jù)表明THIK-1離子通道可能是炎癥后疼痛的發(fā)生機(jī)制。

2 THIK-1離子通道與吸入麻醉

吸入麻醉藥的作用機(jī)制至今仍然是醫(yī)學(xué)上最令人困惑的謎團(tuán)之一。Jung等[20]研究發(fā)現(xiàn)吸入麻醉藥抑制線粒體生成ATP，而ATP的生成減少，反過來又使突觸前神經(jīng)元的ATP生成減少，減弱了細(xì)胞胞吞作用。研究表明，異氟醚通過抑制線粒體復(fù)合物I來抑制突觸前神經(jīng)元的胞吞作用，從而導(dǎo)致突觸前神經(jīng)元ATP的生成下降。ATP依賴性的突觸前神經(jīng)元胞吞作用被抑制可能是異氟烷發(fā)揮麻醉作用的主要機(jī)制。Izquierdo等[21]在THIK-1基因敲除的小鼠研究中，發(fā)現(xiàn)THIK-1活性的降低會(huì)導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬能力和降解能力顯著減弱。吸入麻醉藥會(huì)影響突觸前神經(jīng)元的胞吞能力，THIK-1離子通道可影響小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬能力，那么THIK-1離子通道是否有可能是突觸前神經(jīng)元ATP生成減少的關(guān)鍵生理機(jī)制呢？這是重要的科學(xué)問題之一。

Lazarenko等[10]發(fā)現(xiàn)烏拉坦麻醉后的大鼠，異氟醚也增加了斜方體后核(RTN，Retrotrapezoid nucleus)化學(xué)敏感神經(jīng)元的放電頻率，不依賴于CO2水平。異氟醚短暫地增強(qiáng)了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物呼吸功能，這種效應(yīng)在呼吸驅(qū)動(dòng)水平較低時(shí)最為顯著，主要通過呼吸頻率的增加來調(diào)節(jié)，這些結(jié)果表明RTN神經(jīng)元在呼吸調(diào)控中起著重要作用。吸入麻醉藥激活RTN神經(jīng)元，增強(qiáng)RTN神經(jīng)元興奮，抵消部分呼吸運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)中其它因素的抑制作用，從而在系統(tǒng)其他功能普遍受到抑制的情況下為呼吸系統(tǒng)提供更強(qiáng)的興奮性驅(qū)動(dòng)。因此，進(jìn)一步研究不同腦區(qū)不同神經(jīng)元的THIK1離子通道在吸入麻醉藥物作用中的重要機(jī)制，可為優(yōu)化吸入麻醉效果，改善吸入麻醉的蘇醒質(zhì)量提供理論基礎(chǔ)，針對(duì)THIK-1離子通道深入研究，有望開發(fā)新型全身麻醉藥物，提高麻醉安全。

3 THIK-1離子通道與神經(jīng)系統(tǒng)疾病

多發(fā)性硬化是一種神經(jīng)系統(tǒng)炎癥性疾病，先天免疫反應(yīng)既有對(duì)抗感染微生物的能力，又有推動(dòng)病理性炎癥的能力，炎性小體復(fù)合物通過調(diào)節(jié)白介素1β(IL-1β)、白介素18(IL-18)和細(xì)胞焦亡，因此成為這些過程的核心步驟，炎性小體復(fù)合物(NLRP3)通過直接結(jié)合配體和間接機(jī)制識(shí)別受損或死亡細(xì)胞釋放的微生物產(chǎn)物或內(nèi)源性分子，IL-1家族的細(xì)胞因子可能導(dǎo)致組織損傷和慢性炎癥[22]。Drinkall等[23]進(jìn)一步研究使用藥物抑制劑和THIK-1基因敲除小鼠的細(xì)胞，在體外評(píng)價(jià)THIK-1對(duì)巨噬細(xì)胞NLRP3的激活作用。筆者發(fā)現(xiàn)THIK-1離子通道抑制劑TPA(Tetrapentylammonium，四戊基溴化銨)可使NLRP3激動(dòng)劑對(duì)小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞(BMDMs，Bone-marrow-derived macrophages)、混合膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的caspase-1激活和IL-1β的釋放減少。同樣，THIK-1全身敲除(或條件性敲除)小鼠的BMDMs和小膠質(zhì)細(xì)胞也減少了IL-1β的釋放。這些研究表明THIK-1是NLRP3炎癥小體激活的調(diào)節(jié)因子，并確定THIK-1是炎癥性疾病的潛在治療靶點(diǎn)?？梢姡琓HIK-1調(diào)節(jié)炎性小體復(fù)合物在整個(gè)炎癥過程的發(fā)展過程中起著至關(guān)重要的作用。

小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常駐免疫細(xì)胞，它們通過運(yùn)動(dòng)突起以及納米級(jí)傳感絲狀突起動(dòng)態(tài)地觀察它們所處的環(huán)境[24]，在健康的大腦動(dòng)態(tài)平衡和可塑性中起著關(guān)鍵作用。小膠質(zhì)細(xì)胞在大多數(shù)神經(jīng)病理中被激活，包括神經(jīng)退行性疾病、癲癇、自閉癥、精神障礙和中風(fēng)[25-27]，THIK-1離子通道在健康人中樞神經(jīng)系統(tǒng)和多發(fā)性硬化(Multiple sclerosis)癥組織的小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)[12-13]。多發(fā)性硬化中被激活的小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬掉髓鞘和神經(jīng)元碎片[28-31]，這有利于神經(jīng)保護(hù)和髓鞘再生。整個(gè)過程受ATP、趨化因子、神經(jīng)遞質(zhì)、細(xì)胞外鉀濃度等因素的調(diào)節(jié)[7, 32-33]，并通過小膠質(zhì)細(xì)胞受體整合，特別是嘌呤能受體P2Y12和Fractalkine受體CX3CR1，以及最近發(fā)現(xiàn)的雙孔鉀離子通道THIK-1[7, 34-35]。小膠質(zhì)細(xì)胞與郎飛氏髓鞘和郎飛氏結(jié)節(jié)的直接接觸最近在大鼠的穹窿體內(nèi)觀察到[36]，少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(OPC，Oligodendrocyte precursors cells)和星形膠質(zhì)細(xì)胞接觸通過郎飛氏結(jié)節(jié)[37]，同時(shí)有文獻(xiàn)顯示這些細(xì)胞可能在特定的節(jié)點(diǎn)處相互作用傳遞信號(hào)[38]。表明郎飛氏結(jié)節(jié)可能是中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞間通訊的樞紐。

Ronzano等[39]使用3D重建數(shù)據(jù)進(jìn)一步支持了這一點(diǎn)，該數(shù)據(jù)顯示，大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞與結(jié)節(jié)成分和其它接觸的膠質(zhì)細(xì)胞建立了物理聯(lián)系。Ronzano等[39]為了評(píng)估THIK-1離子通道是否參與小膠質(zhì)細(xì)胞-郎飛氏結(jié)節(jié)相互作用，使用鉀通道的廣譜抑制劑四乙銨30mM處理有髓切片，培養(yǎng)1h后發(fā)現(xiàn)TEA不影響小膠質(zhì)細(xì)胞的整體形態(tài)和動(dòng)力學(xué)。然而，這種處理導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞與郎飛氏結(jié)節(jié)的相互作用減少了40%，與對(duì)照條件下的(18.8±1.1)%相比，處理后的切片中有(11.4±1.1)%的節(jié)點(diǎn)接觸。提示軸突靜息電位上存在的外向鉀電流，參與調(diào)節(jié)了小膠質(zhì)細(xì)胞-郎飛氏結(jié)節(jié)的相互作用。Ronzano等[39]使用不同的鉀離子通道阻斷劑，影響小膠質(zhì)細(xì)胞的促細(xì)胞再生功能，發(fā)現(xiàn)這與髓鞘再生的減少有關(guān)。提示影響神經(jīng)元與小膠質(zhì)細(xì)胞之間的鉀離子信號(hào)傳遞，可能是干預(yù)髓鞘再生能力的關(guān)鍵靶點(diǎn)。筆者進(jìn)一步使用溶血磷脂酰膽堿(Lysophosphatidylcholine，LPC)誘導(dǎo)了局灶性脫髓鞘病變，構(gòu)建了多發(fā)性硬化的病理模型，首先，使用THIK-1的阻斷劑四戊基溴化銨(TPA)或廣譜鉀離子通道阻滯劑四乙銨(TEA)處理腦組織切片1h，并通過IGF1標(biāo)記促再生表型的小膠質(zhì)細(xì)胞，iNOS標(biāo)記促炎癥表型的小膠質(zhì)細(xì)胞，來量化小膠質(zhì)細(xì)胞的功能表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TEA處理后促再生小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著減少22%，而TPA處理后顯著減少25%。相反，在TEA處理后，促炎癥小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量顯著增加了21%，TPA處理后顯著增加26%。筆者得出結(jié)論，鉀離子通道抑制劑改變了小膠質(zhì)細(xì)胞與結(jié)節(jié)的相互作用，損害了小膠質(zhì)細(xì)胞向再生表型的轉(zhuǎn)換，并減少了髓鞘的再生，并且雙孔鉀離子通道THIK-1對(duì)髓鞘再生的影響更大。

4 展望

THIK-1離子通道廣泛的表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周組織中，參與了細(xì)胞的電生理活動(dòng)和細(xì)胞代謝等多個(gè)環(huán)節(jié)。在不同的組織細(xì)胞中參與了不同的重要病理生理過程。THIK-1離子通道參與疼痛和神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生，以及吸入麻醉藥的作用機(jī)制。進(jìn)一步研究THIK-1離子通道在這些領(lǐng)域中的具體作用，有助于以THIK-1離子通道作為潛在的分子靶點(diǎn)，研發(fā)減輕疼痛和防治神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥物，以及研發(fā)新型麻醉藥物。