張 玥，胡宏濤，趙 穎，蔣智鋼，周遠忠，范奇元,2

(1.遵義醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)藥高等專科學校 衛(wèi)生管理系，貴州 遵義 563006)

錳是氨基酸、脂質、蛋白質和化合物代謝所必需的微量元素[1]，與發(fā)育、新陳代謝和抗氧化密切相關[2-4]。錳攝入不足將造成生殖缺陷、體重減輕、生長障礙、皮膚疾病和心情改變等[5]，接觸過量錳則會導致錳中毒，以中樞神經系統(tǒng)受損為主要表現[6]。錳對神經系統(tǒng)的損害，多以多巴胺能神經細胞為靶細胞，可導致該細胞中線粒體受損。維持多巴胺能神經細胞的正常功能，依賴于細胞中線粒體的質量和數量[7]，線粒體參與細胞中多種功能的正常發(fā)揮：能量轉換、鈣穩(wěn)態(tài)、細胞凋亡和代謝合成等[8]。細胞內活性氧(ROS)產生過多超過了細胞自身的清除能力、ATP產生受阻、線粒體DNA損傷、半胱天冬酶釋放和電子傳遞復合物酶缺陷等[9]都將誘導線粒體功能失調，產生神經細胞中毒效應[10]。

線粒體自噬可以清除受損或不完整的線粒體，被認為是控制線粒體數量和質量的一種重要機制[11]，參與維持自身功能的完整性，是細胞內線粒體新陳代謝的主要途徑，對維持細胞的穩(wěn)態(tài)具有重要意義[12]。已有的研究已經證實線粒體受損誘導蛋白激酶 PINK1聚集到線粒體外膜，其下游蛋白 Parkin泛素化線粒體外膜上的蛋白，介導線粒體自噬的發(fā)生[13-15]。雖然錳與線粒體自噬之間的關系已有相關研究報道，但PARK2介導的線粒體自噬如何影響錳對多巴胺神經元細胞毒性未見相關報道。本課題組前期工作[16-19]發(fā)現錳中毒伴隨PARK2基因表達下降：錳暴露工人血液和唾液中PARK2基因下調；錳暴露大鼠血、 大腦中PARK2基因下調； 大鼠在脫離錳接觸后，血中PARK2基因的下降恢復正常， 而PARK2基因的產物蛋白Parkin在中腦、紋狀體的表達也恢復正常， 伴隨多巴胺神經元的恢復； 在SH-SY5Y細胞中， 染錳導致PARK2基因和Parkin蛋白的下調與線粒體損傷和多巴胺的分泌下降有關。但PARK2/Parkin的下調如何影響錳的毒性不明。因此構建PARK2基因過表達/敲低的細胞有助于進一步研究PARK2基因/Parkin蛋白在多巴胺能神經細胞染錳時的線粒體自噬調節(jié)，這對于探討錳中毒作用機制有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料 氯化錳(MnCl2·4H2O )購于生工生物工程( 上海) 股份有限公司；PARK2過表達和敲低質粒購于中洪博元生物技術有限公司(南昌)； LipotamineTM2000 購自中洪博元生物技術有限公司(南昌)；多巴胺 (Dopamine,DA) ELISA試劑盒(上海生工生物工程股份有限公司)；Parkin單克隆抗體(美國CST，#4211)；LC3單克隆抗體(美國Abcam，ab192890)；OPTN單克隆抗體(美國Abcam，ab213556)；P62單克隆抗體(美國Abcam，ab109012)；GAPDH單克隆抗體(上海碧云天生物技術研究所)。

1.2 細胞培養(yǎng) SK-N-SH細胞購于上海和元生物公司，培養(yǎng)于含有10%胎牛血清(FBS)及1%雙抗的MEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱內孵育，每隔1天更換培養(yǎng)基。為更好觀察PARK2對錳引起的自噬， 實驗中使用2% FBS MEM培養(yǎng)基。

1.3 細胞轉染 使用中洪博元生物技術有限公司構建的PARK2過表達和敲低質粒來轉染細胞。取8.75 μL LipotamineTM2000和2.5 μg目的質粒溶于150 μL Opti-MEM無血清培養(yǎng)基中，混勻室溫下孵育30 min。棄原培養(yǎng)基，清洗細胞后，每孔加入1.7 mL基礎培養(yǎng)基，再將混勻的質粒溶液逐滴加入。置于37 ℃孵箱內培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)基，每孔加入2 mL基礎培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。加入嘌呤霉素進行穩(wěn)轉株的篩選，得到穩(wěn)轉株細胞。穩(wěn)轉細胞株用PARK2 mRNA 和Parkin蛋白的表達來驗證。

1.4 qPCR 用Trizol法提取Total RNA后用PrimeScript RT reagent Kit(Takara,Japan)試劑盒逆轉錄為cDNA，再用SYBR?Premix Ex Tag(Takara,Japan)進行qPCR擴增。實驗以GAPDH為內參，采用相對定量法(Q = 2-ΔΔCt)計算目的基因的表達量。qPCR 探針序列見表1。

表1 qPCR 探針序列表

1.5 Western blot實驗 用RIPA、PMSF和蛋白酶抑制劑提取SK-N-SH細胞的總蛋白，再用BCA蛋白檢測試劑盒檢測總蛋白濃度 。用十二烷基硫酸鈉/聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離等量的蛋白質(20 μg)，并將蛋白轉移到聚亞甲基氟化物膜。在5%脫脂牛奶中封閉2 h，在4 ℃下孵育一抗過夜，洗滌后用辣根過氧化物酶標記的二抗 (1∶10 000) 孵育1 h。最后用凝膠圖像分析系統(tǒng)計算目的蛋白相對含量=目的蛋白灰度值/內參GAPDH蛋白灰度值。

1.6 細胞分組及技術路線 慢病毒構建PARK2過表達/敲低穩(wěn)轉株后，分為空載質粒組、PARK2過表達組、PARK2敲低組3組，對其染毒24 h后進行后續(xù)實驗。技術路線見圖1。

圖1 技術路線

1.7 CCK 8法測錳對細胞增殖-毒性 在細胞對數期收集細胞，以1×105個/mL的密度接種于96孔板培養(yǎng)24 h后加入配制好的含不同Mn2+濃度(0～3 000 μM)的2% FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，然后每孔加入10 μL CCK8工作液(避光操作)，2 h后用酶標儀檢測在波長450 nm處的吸光度。根據吸光度值算出細胞活力。

1.8 熒光探針測ROS水平 將20 μL H2DCFDA儲存液加入到10 mL Assay Buffer中，配置成染色液 (終濃度10 μM)。將1mL染色液覆蓋細胞于培養(yǎng)箱內孵育1 h后用PBS洗滌細胞，再消化、離心、重懸細胞后用流式細胞儀檢測。

1.9 透射電鏡下觀察自噬小體數量 細胞染Mn2+24 h后用2.5%戊二醛溶液和1%鋨酸固定液固定，再脫水包埋固化后切片染色，用透射電鏡觀察、拍片。

1.10 ELISA法測DA含量 按多巴胺 ELISA試劑盒說明書進行：將細胞培養(yǎng)上清移離心， 在標準孔、空白孔和樣本孔中分別各加入50 μL標準品稀釋液、檢測緩沖液和細胞上清液，然后加入50 μL生物素標記多巴胺抗體工作液，于37 ℃孵育45 min。洗滌后每孔加入 100 μL 稀釋的辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素(1∶100 稀釋)，封板后于37 ℃孵育30 min。洗滌后每孔加入90 μL顯色底物TMB，避光室溫孵育 15 min后用酶標儀450 nm波長測定OD值。

2 結果

2.1 WB和q-PCR實驗驗證PARK2 基因過表達/敲低穩(wěn)轉株 圖2A顯示， 與空細胞組比較，空載質粒組無蛋白表達，PARK2 過表達組中Parkin蛋白表達，表明PARK2 過表達穩(wěn)轉株構建成功。圖2B顯示，與空細胞組比較，PARK2基因的表達在空載質粒組無差別，而在PARK2 敲低組中PARK2 基因的表達量僅為空白組的9.17%(P<0.05)，表明PARK2 基因敲低穩(wěn)轉株構建成功。

A:PARK2過表達后各組細胞內Parkin蛋白表達 (55KD)；B:PARK2敲低后各組細胞內PARK2基因相對表達量； *：與空細胞組比較，圖2 WB/q-PCR驗證PARK2過表達/敲低穩(wěn)轉株

2.2 不同濃度Mn2+對SK-N-SH細胞增殖毒性 為更好觀察自噬，采用血清饑餓法。 圖3A顯示2%FBS培養(yǎng)基不影響細胞活力， 故2%FBS 培養(yǎng)基用來評價錳的毒性。 設置含不同濃度Mn2+(0～3 000 μM)的培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24 h后，用CCK 8法測細胞活力。圖3B顯示，與對照組比較，125、250和500 μM Mn2+組存活率無差異(P>0.05)，其余各組的細胞存活率隨Mn2+濃度而較低(P<0.05)，選擇900 μM作為染錳劑量進行后續(xù)實驗。

*：與對照組比較，圖3 不同濃度Mn2+對細胞的增殖毒性

2.3 熒光探針測細胞內ROS水平 用流式細胞儀檢測細胞內ROS生成水平(見圖4)。與空載質粒組比較，PARK2過表達組ROS含量較低(P<0.05)。

2.4 透射電鏡觀察自噬小體數量 在透射電鏡下觀察不同處理組細胞內自噬小體數量，見圖5。細胞內可見多個內含物質的囊泡結構，即為自噬小體(箭頭)。與空載組比較，PARK2過表達組自噬小體數量較多(P<0.05)。

2.5 WB檢測OPTN、P62和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表達 經WB法檢測了不同處理組細胞內OPTN、P62和LC3Ⅱ/Ⅰ 蛋白表達情況(見圖6)。與空載組比較，PARK2過表達組OPTN蛋白表達量較低(P<0.05)，PARK2敲低組OPTN蛋白表達量較高(P<0.05)；PARK2敲低組P62蛋白含量較高(P<0.05)；PARK2過表達組LC3Ⅱ/Ⅰ較高(P<0.05)。

A:流式細胞儀檢測結果；B：統(tǒng)計結果；*：與空載質粒組比較，圖4 不同處理組細胞內ROS水平

A、B、C：空載質組、PARK2過表達組、PARK2敲低組電鏡下自噬小體；D：統(tǒng)計結果；箭頭：自噬小體；*：與空載質粒組比較，圖5 電鏡下觀察各組細胞內自噬小體數量

A、D:P62/LC3Ⅱ/Ⅰ/OPTN WB代表性條帶圖；B、C、E：P62/LC3Ⅱ/Ⅰ/OPTN蛋白表達量統(tǒng)計結果；*:與空載質粒組比較，P<0.05；a、b、c：空載質粒組、Parkin過表達組、Parkin敲低組；圖6 不同處理組細胞內OPTN、P62和LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白的表達

2.6 ELISA法檢測多巴胺(DA) 用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)基中DA水平(見圖7)。與空載組比較，PARK2過表達組DA水平較高(P<0.05)。

*:與空載質粒組比較，圖7 不同處理組細胞培養(yǎng)基中DA水平

3 討論

錳進入機體后，主要的作用靶點為大腦的多巴胺能神經細胞。研究組的前期研究[16-19]發(fā)現：錳暴露可引起人骨髓神經母細胞瘤細胞株(類多巴胺能神經細胞)PARK2 mRNA和Parkin蛋白的表達均降低，SOD活力下降，MDA含量增加，細胞氧化應激，機體清除氧自由基的能力下降，導致細胞凋亡增加，合成多巴胺減少；錳暴露大鼠全血、唾液、紋狀體和皮質內的錳水平與PARK2/Parkin 表達呈負相關，高劑量染錳組多巴胺能神經元幾乎消失；冶煉廠中的錳暴露可導致工人血液中PARK2的表達減少。本次研究發(fā)現通過構建PARK2基因過表達/敲低的細胞，繼而改變Parkin蛋白的表達，從而影響細胞內線粒體自噬來清除受損的線粒體。這說明錳中毒的作用機制之一可能為通過降低PARK2基因的表達，阻礙細胞內線粒體自噬，從而導致細胞凋亡。

錳對線粒體有特殊的親和力，可蓄積于富含線粒體的組織中，阻斷能量合成，有研究表明錳中毒可導致線粒體代謝障礙[20]。細胞中線粒體自噬是細胞中清除失去功能的線粒體、維持細胞正常功能的重要途徑，對維持細胞內穩(wěn)態(tài)具有重要意義[12]，一旦線粒體自噬受到影響，可導致細胞死亡。

PARK2基因表達產物為Parkin蛋白，Parkin蛋白是一種E3泛素蛋白連接酶，是泛素-蛋白酶體途徑(UPP)中的重要組成成員，失去功能蛋白質在細胞中堆積可導致細胞的死亡，而UPP途徑在清除細胞中失去功能的蛋白質過程中發(fā)揮重要作用[21]。PARK2基因突變可出現細胞內蛋白降解障礙，蛋白降解受阻并積聚可引起神經毒性，Kitada等發(fā)現該基因突變可導致常染色體隱性遺傳性青少年型帕金森綜合征，PARK2基因突變導致了多巴胺能神經元細胞中Parkin蛋白缺乏、UPP途徑障礙、多巴胺能神經細胞死亡，導致青少年型帕金森綜合征[22]。

自噬過程[23]分為 4 個階段：(1)雙層隔離膜形成；(2)自噬體形成；(3)自噬溶酶體形成；(4)自噬體溶酶體降解。Kimura等[24]研究發(fā)現自噬相關蛋白 LC3 是哺乳動物細胞中酵母自噬相關基因 8 (Autophagy-related gene，ATG8)的同源物，靶向定位于自噬體膜，分為 LC3Ⅰ和 LC3Ⅱ。當自噬發(fā)生時，細胞內形成自噬泡，LC3Ⅰ經泛素樣加工修飾與自噬泡表面的磷脂酰乙醇胺(PE)形成 LC3Ⅱ，是自噬發(fā)生的標志性蛋白。Yamano等[25]研究發(fā)現OPTN和SQSTM1(P62)為哺乳動物的自噬受體，當線粒體自噬發(fā)生時，這些受體被招募到線粒體外膜上與 LC3-Ⅱ結合形成復合物，最終在溶酶體內降解，隨著自噬作用的增加，自噬受體蛋白被不斷消耗，LC3Ⅱ與自噬受體蛋白水平成反比，是細胞內自噬效應的標志蛋白之一。

在本研究中，使用SK-N-SH細胞作為染錳的研究細胞，該細胞與錳作用于人體中樞神經中的多巴胺能神經元細胞的功能類似。PARK2過表達細胞株和敲低細胞株用定量PCR和WB實驗予以驗證，結果證明試驗所用的細胞株達到PARK2過表達和敲低的目的。

各組染錳后，PARK2過表達細胞株的多巴胺水平高于對照組和PARK2敲低組，說明細胞內Parkin水平的提高有利于細胞功能的正常發(fā)揮，對染錳細胞有保護作用；染錳后，隨著自噬小體增加，OPTN和P62蛋白水平也降低，LC3Ⅱ/Ⅰ 升高，說明染錳對SK-N-SH細胞損害，由于線粒體自噬的增加而降低。證明在PARK2過表達的細胞中受損線粒體有較高水平的Parkin組成的UPP參與自噬，對細胞清除受損的線粒體，保持細胞內穩(wěn)態(tài)有促進作用[26]，從而降低了錳對細胞的毒性。

在PARK2敲低細胞組中，多巴胺水平與空載質粒組比較未見顯著差異，可能原因是染錳后，錳引起細胞毒性時已經降低了Parkin蛋白的表達(和我們的前期研究結果一致)，因此再對細胞PARK2基因敲低，其產生的效應對實驗結果的影響不明顯。雖然P62和OPTN蛋白表達量與空載質粒組比較增加具有顯著性，自噬小體數量與空載質粒組比較，趨勢有降低，但差異沒有顯著性。說明染錳產生的毒性和PARK2敲低同時作用，并未對自噬效應產生明顯疊加效應。

本次實驗發(fā)現過表達Parkin后OPTN蛋白表達降低，敲低Parkin后OPTN蛋白表達增高。推測在錳致細胞神經毒性時，OPTN與P62發(fā)揮相同作用：作為Parkin蛋白的自噬受體蛋白參與Parkin介導的線粒體自噬過程。我們的推測符合Wong等[27]的研究結果：通過高分辨活細胞成像發(fā)現OPTN蛋白被招募到Parkin泛素化的線粒體上，與LC3相互作用誘導自噬泡包裹受損線粒體形成自噬小體。

綜合研究結果，我們可以推測：Parkin可能通過介導線粒體自噬效應減輕錳對神經細胞的毒性作用，并且OPTN蛋白作為Parkin蛋白的下游蛋白參與此過程。