文 英,譚 俊,馬夢(mèng)真,袁修磊,何 博,常建軍*,馬文濤*

(1.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院,青海西寧 810016;2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西楊凌 712100;3.平羅縣畜牧水產(chǎn)技術(shù)推廣服務(wù)中心,寧夏平羅 753400 )

隨著畜牧業(yè)的蓬勃發(fā)展,畜牧生產(chǎn)逐漸轉(zhuǎn)向規(guī)?；?在發(fā)展過(guò)程中如何防治細(xì)菌病也成為了亟待解決的問(wèn)題[1]?？股匾蚱涓咝猿蔀榉乐蝿?dòng)物細(xì)菌病的首選,但也因此導(dǎo)致了行業(yè)內(nèi)對(duì)抗生素的濫用,使部分細(xì)菌產(chǎn)生了耐藥性,導(dǎo)致抗生素的效果有所減弱。同時(shí),濫用抗生素也存在動(dòng)物體內(nèi)藥物殘留的風(fēng)險(xiǎn),這引起了動(dòng)物制品加工困難,且可能對(duì)人類的健康造成危害[2]。長(zhǎng)期大量、隨意地使用抗生素會(huì)使一部分細(xì)菌產(chǎn)生抗性,這種具有抗性的細(xì)菌在動(dòng)物體內(nèi)或是環(huán)境中生存繁殖,相應(yīng)的抗性基因就得以保留傳播,導(dǎo)致臨床上人類進(jìn)行抗生素治療的效果減弱[3]?？股卦谌祟愥t(yī)療系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用,抗生素治療被廣泛認(rèn)為是醫(yī)學(xué)史上最成功的治療干預(yù)措施之一,對(duì)包括器官移植和癌癥化療在內(nèi)的多項(xiàng)醫(yī)學(xué)突破發(fā)展起到了關(guān)鍵作用。而我們正在接近抗生素逐漸失去作用的“抗生素后時(shí)代”[4]。

噬菌體是感染細(xì)菌的病毒,具有病毒的所有共同特征。噬菌體不能自己復(fù)制,需要細(xì)菌宿主來(lái)復(fù)制,大小約50～200 nm,由包含雙鏈DNA的頭部和特異性識(shí)別受體的尾部組成,根據(jù)噬菌體尾部特征可以將其分為長(zhǎng)尾噬菌體科、肌尾噬菌體科和短尾噬菌體科[5]。有數(shù)據(jù)表明,生物圈中有大約1 031種噬菌體,它們廣泛存在于土壤、污水等[6],有細(xì)菌存在的地方就可能有噬菌體的存在。此外,噬菌體的特異性高,可以精確地感染特定的病原菌,減少對(duì)正常微生物群落的干擾。噬菌體可以通過(guò)整合細(xì)菌DNA的方式,使細(xì)菌恢復(fù)對(duì)抗生素的敏感性,從而對(duì)抗耐藥性的產(chǎn)生。隨著對(duì)噬菌體的研究不斷深入,噬菌體治療已經(jīng)在畜牧行業(yè)中有較大的應(yīng)用價(jià)值[7],其在畜牧行業(yè)和人類臨床中的治療作用逐漸展現(xiàn)。

1 噬菌體治療的發(fā)展

100多年前,D′Herelle F首先發(fā)現(xiàn)了噬菌體,并立即提出用于人類和動(dòng)物傳染病的治療[8]。他曾設(shè)想噬菌體療法會(huì)成為主要對(duì)抗細(xì)菌感染的治療方法。但是,隨著1928年青霉素的橫空出世[9],這種設(shè)想并未實(shí)現(xiàn)。噬菌體研究也陷入了低谷,但并未被完全放棄,在前蘇聯(lián)和波蘭等地,噬菌體療法穩(wěn)步發(fā)展。在噬菌體方面研究歷史最悠久的機(jī)構(gòu)是由格魯吉亞微生物學(xué)家喬治·埃利亞瓦于1923年創(chuàng)立的埃利亞瓦噬菌體微生物學(xué)和病毒學(xué)研究所,以及1952年在波蘭弗羅茨瓦夫成立的路德維克·赫茲菲爾德免疫學(xué)和實(shí)驗(yàn)療法研究所[10]。

D’Herelle F于1919年第一次使用噬菌體的噬菌斑治愈了1例痢疾,這是人類歷史上首次使用噬菌體進(jìn)行疾病治療并取得成功[11]。之后的1920-1940年是噬菌體發(fā)展的“黃金時(shí)期”,噬菌體治療試驗(yàn)擴(kuò)大至霍亂、痢疾、腺鼠疫、結(jié)膜炎、皮膚感染等[12]。直至抗生素的黃金時(shí)期過(guò)后的1983-1986年,Slopek Smith &Huggins噬菌體療法在人類和多種動(dòng)物模型中對(duì)抗抗生素耐藥性細(xì)菌菌株感染[13]。2017年,Schooley R T等[14]成功將噬菌體靜脈注射給個(gè)體治愈鮑曼不動(dòng)桿菌導(dǎo)致的敗血癥。噬菌體治療在新型抗生素研發(fā)以及減少和耐藥菌株不斷出現(xiàn)的背景下再次興起,針對(duì)噬菌體感染機(jī)制的研究也取得了較大的進(jìn)展。

目前噬菌體基因工程的應(yīng)用也十分廣泛,已有幾種噬菌體基因組工程技術(shù)被開發(fā)出來(lái),包括噬菌體與質(zhì)粒重組、穿梭質(zhì)粒構(gòu)建、直接克隆、重組、CRISPR-Cas選擇以及重組與crispr介導(dǎo)的反選擇[15]。

2 噬菌體的給藥途徑

Payne R J等[16]將噬菌體治療分為“被動(dòng)”治療和“主動(dòng)”治療。“被動(dòng)”治療提供足夠劑量的噬菌體殺死目標(biāo)細(xì)菌,即淹水密度,不需要噬菌體通過(guò)細(xì)菌增殖即可控制感染?！爸鲃?dòng)”治療則需要噬菌體在細(xì)菌感染期間增殖,相對(duì)于“被動(dòng)”治療,其更依賴于噬菌體裂解宿主菌并進(jìn)行增殖能力,較少依賴于噬菌體本身的濃度[17]。不同的給藥途徑也會(huì)使噬菌體作用時(shí)的濃度有所不同,不同的疾病也應(yīng)選擇不用的給藥途徑。臨床上目前所使用的給藥途徑有注射以及口服給藥、局部給藥等。

2.1 注射給藥

注射給藥是最容易通過(guò)機(jī)體屏障的給藥方式,已經(jīng)被證實(shí)是系統(tǒng)遞送噬菌體最有效的途徑。注射給藥可以快速地將噬菌體送入血液中,大約1 h后可以在血液中檢測(cè)到有活性的噬菌體,最快的甚至在5 min左右即可檢測(cè)到[18]。在臨床動(dòng)物模型中,噬菌體的腹腔注射、靜脈注射和肌肉注射已有報(bào)道。

在美國(guó)食品和藥物管理局以及緊急新藥研究制度的推動(dòng)下,有因植入假體而導(dǎo)致銅綠假單胞菌持續(xù)感染,多次注射抗生素都無(wú)效的患者使用靜脈注射噬菌體OMKO1,該噬菌體與銅綠假單胞菌外膜蛋白M結(jié)合,且以該結(jié)合點(diǎn)為靶點(diǎn),使該患者對(duì)頭孢他啶的敏感性增加了2倍,對(duì)化學(xué)合成的環(huán)丙沙星的敏感性增加了10倍。除對(duì)抗生素敏感性的影響外,其對(duì)銅綠假單胞菌的特異性消滅作用也使得患者生物膜保持完整無(wú)菌[19]。

在急性小鼠肺部洋蔥伯克霍爾德菌感染模型中,將鼻吸入與腹腔注射兩種途徑治療的小鼠肺部細(xì)菌載量和肺部炎癥進(jìn)行對(duì)比,腹腔注射組的治療效果要優(yōu)于鼻吸入組[20]。不同的注射方式會(huì)影響噬菌體進(jìn)入血液的時(shí)間,但靜脈注射是最有效的方式,通過(guò)在感染部位局部注射噬菌體進(jìn)行治療除外[21]。McVay C S等[22]研究證明,相較于腹腔注射和肌肉注射,靜脈注射在治愈患有敗血癥的動(dòng)物時(shí)具有更高的效率和更好的治療效果。

2.2 口服給藥

在各種給藥途徑中,口服給藥是最容易被接受的一種給藥途徑。但是口服給藥并不能使噬菌體有效地進(jìn)入體循環(huán),胃腸道對(duì)噬菌體的吸收作用并不樂(lè)觀,并且不能通過(guò)劑量來(lái)解決。Monsur K A等[23]的研究顯示,在對(duì)霍亂患者進(jìn)行口服噬菌體治療時(shí),高噬菌體攝入量(1013～1014PFU)也不能使胃腸道對(duì)噬菌體的吸收量增加,血液中檢測(cè)到的噬菌體數(shù)量?jī)H為1012PFU/mL 。Jun J W等[24]的研究顯示,注射給藥時(shí)噬菌體在血液中出現(xiàn)的時(shí)間比口服給藥快3 h,更是提前6 h達(dá)到峰值。在口服T4噬菌體進(jìn)行的人體安全試驗(yàn)中,血液中始終未出現(xiàn)具有活性的噬菌體[25]。

對(duì)于治療胃腸道感染,口服給藥仍然是一種較為有效的途徑。在口服給藥之前,需對(duì)噬菌體進(jìn)行特殊處理。噬菌體對(duì)于極端pH尤其敏感,如果不克服胃酸造成的障礙,機(jī)體對(duì)于噬菌體的吸收將十分低效[26]。因此,口服給藥時(shí)噬菌體通常與胃酸中和劑一起使用[27]。Otero J等[28]將噬菌體包裹在脂質(zhì)體中給小鼠口服,結(jié)果表明該方法可以使噬菌體長(zhǎng)時(shí)間在胃酸中存活并增加了腸道對(duì)于噬菌體的吸附力。

2.3 局部給藥

局部給藥大多數(shù)是將噬菌體應(yīng)用于生物膜表面。生物膜中的細(xì)菌具有多種免疫和抗生素規(guī)避機(jī)制,使得生物膜相關(guān)感染難以根除,噬菌體是治療生物膜介導(dǎo)的肌肉骨骼感染的潛在方法[29]。噬菌體可通過(guò)局部給藥直接接觸病原菌,對(duì)于一些黏膜感染或是皮膚表面創(chuàng)傷,局部給藥相較于注射給藥和口服給藥有更好的治療效果[30]。用于皮膚創(chuàng)傷治療的噬菌體,可以直接與造成感染的病原菌接觸,噬菌體不必進(jìn)入體循環(huán),也不必為了與目標(biāo)菌株接觸而進(jìn)行移動(dòng)。

吸入性的噬菌體給藥可對(duì)肺部感染小鼠模型有良好的治療作用,且有劑量依賴性,效果優(yōu)于注射給藥[31]。Milho C等[32]在豬皮上利用噬菌體進(jìn)行治療試驗(yàn),結(jié)果顯示噬菌體對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌、大腸埃希氏菌等造成的傷口感染有明顯的治療效果。

3 噬菌體治療在畜牧行業(yè)中的應(yīng)用

3.1 噬菌體治療在禽類養(yǎng)殖中的應(yīng)用

在禽類中常見(jiàn)的造成禽類傷亡嚴(yán)重的病原菌有大腸埃希氏菌屬、沙門氏菌屬、彎曲菌屬等。已經(jīng)證實(shí),在家禽中長(zhǎng)期使用噬菌體已經(jīng)被證實(shí)能夠有效地減少腸道中的沙門氏菌[33]。正如Fiorentin L 等[34]的研究所示,口服噬菌體劑量為1011PFU能夠有效降低沙門氏菌所導(dǎo)致的雞的腸炎。并且作者也證實(shí)這種作用具有劑量依賴性。將噬菌體添加在雛雞日糧中能夠有效降低沙門氏菌在雛雞腸道中感染,這種預(yù)防措施也減少了沙門氏菌在腸道中的復(fù)制[35]。李夢(mèng)哲等[36]通過(guò)生物信息學(xué)分析篩選出了具有較為寬泛宿主范圍的沙門氏菌噬菌體STP4-α,該噬菌體對(duì)91株沙門氏菌中的88株都有抑制作用,并且在體外模擬的胃腸道環(huán)境中保持了50%以上的活性,使用STP4-α對(duì)雛雞預(yù)處理,在雛雞糞便中檢測(cè)不到沙門氏菌,該噬菌體對(duì)于沙門氏菌有較好的抑制效果,有作為治療藥物的潛力。

有研究顯示,噬菌體對(duì)于新生以及3周齡大小的由大腸埃希氏菌導(dǎo)致的腦膜炎和膿毒癥的雛雞有良好的治療作用[37]。吳立婷等[38]分離到1株禽源產(chǎn)氣莢膜梭菌噬菌體,該噬菌體對(duì)于多種產(chǎn)氣莢膜梭菌有裂解作用,在環(huán)境消減測(cè)試中觀察到噬菌體作用0.5 h,殺菌效率可達(dá)98.36%;作用2 h能夠抑制99.60%的產(chǎn)氣莢膜梭菌,為食品動(dòng)物養(yǎng)殖及禽類產(chǎn)品中產(chǎn)氣莢膜梭菌的控制提供了一種可靠的方法。

3.2 噬菌體治療在哺乳動(dòng)物中的應(yīng)用

金黃色葡萄球菌引起的奶牛、奶山羊乳房炎是奶畜行業(yè)的一個(gè)重要問(wèn)題,如今有相當(dāng)數(shù)量導(dǎo)致動(dòng)物乳房炎的金黃色葡萄球菌對(duì)抗生素具有耐藥性,且治療后容易復(fù)發(fā)[39]。Erol H B等[40]測(cè)試了5種市售金黃色葡萄球菌噬菌體“雞尾酒”懸液對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的影響,發(fā)現(xiàn)噬菌體對(duì)菌株裂解率高,為奶畜乳房炎的治療提供了一種新的可能性。Gill J J等[41]對(duì)24頭金黃色葡萄球菌導(dǎo)致的隱性乳房炎荷斯坦奶牛采用對(duì)金黃色葡萄球菌具有裂解作用的噬菌體K讓奶?？诜M(jìn)行治療,與生理鹽水的對(duì)照組相比,治愈率有顯著差異,并且反復(fù)論證,發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)療程比短療程效果更好。黨瑞瑩等[42]分離出1株具有裂解金黃色葡萄球菌作用的噬菌體P82,其效價(jià)高、噬菌譜廣、裂解能力強(qiáng)、增殖速度快,為奶牛乳腺炎的噬菌體治療提供了材料。Mishra AK等[43]使用噬菌體對(duì)耐藥性金黃色葡萄球菌進(jìn)行裂解,也發(fā)現(xiàn)其對(duì)于臨床中奶山羊乳房炎的治療效果顯著。

仔豬成長(zhǎng)過(guò)程中感染致病菌會(huì)出現(xiàn)腹瀉、生長(zhǎng)發(fā)育遲緩等。Seo B J等[44]給28日齡仔豬的飼料中添加噬菌體雞尾酒,發(fā)現(xiàn)這些仔豬感染沙門氏菌的風(fēng)險(xiǎn)將顯著降低,同時(shí)不會(huì)對(duì)仔豬腸道菌群產(chǎn)生不良影響。Desiree K等[45]將噬菌體對(duì)仔豬治療結(jié)果進(jìn)行分析對(duì)比,發(fā)現(xiàn)噬菌體可以有效降低仔豬體內(nèi)目標(biāo)細(xì)菌濃度,作者也發(fā)現(xiàn)將噬菌體添加進(jìn)豬飼料中飼喂比直接灌服噬菌體在盲腸中的存活率更高。王兆飛等[46]從鏈球菌噬菌體phi5218中分離出具有裂解鏈球菌作用的裂解酶,將其命名為Ply5218,在小鼠感染模型中該酶對(duì)鏈球菌裂解效果明顯,對(duì)不同血清型鏈球菌均有效,也能夠緩解鏈球菌引起的仔豬臨床癥狀,有望用于豬鏈球菌感染性疾病的治療。

4 小結(jié)與展望

迫在眉睫的抗生素耐藥性威脅,讓人們將目光更多地轉(zhuǎn)向?qū)ふ姨娲股刂委煹姆椒?噬菌體是一種天然且廣泛存在的病毒粒子,生產(chǎn)成本低、安全性高,一旦宿主細(xì)菌消失,噬菌體也會(huì)隨之被機(jī)體代謝排出。細(xì)菌與噬菌體共同進(jìn)化了數(shù)百萬(wàn)年,兩者之間的相互作用像是“軍備競(jìng)賽”[47],即使一部分細(xì)菌會(huì)進(jìn)化出抵抗噬菌體表型,噬菌體也會(huì)做出相應(yīng)的改變對(duì)抗細(xì)菌的進(jìn)化。噬菌體治療有望成為替代抗生素治療細(xì)菌病的一種主要方法。

目前對(duì)于噬菌體的研究還有很多不足之處,例如臨床數(shù)據(jù)較少、監(jiān)管體系和相關(guān)知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)政策尚不完善、已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)的噬菌體種類不足等。此外,噬菌體本身的高度特異性會(huì)使其作用范圍受限。這些因素均使得噬菌體治療距離真正得到廣泛應(yīng)用還需要進(jìn)行一段時(shí)間的研究探索。但是噬菌體治療正在迅速發(fā)展,其所帶來(lái)的經(jīng)濟(jì)效益和對(duì)醫(yī)療健康發(fā)展的推動(dòng)作用將十分顯著,噬菌體作為一種綠色生物制劑,一定會(huì)對(duì)養(yǎng)殖行業(yè)和人類健康帶來(lái)積極影響。