丁常根,楊興林,馮 平

(榆林學院,陜西榆林 719000)

動物骨骼標本作為醫(yī)學院和獸醫(yī)學院的必備教具,被廣泛應用于教學與科普[1]。常見的動物骨骼標本有3種,即附韌帶骨骼標本、透明雙染色骨骼標本、關節(jié)分離式骨骼標本[2]。附韌帶骨骼標本使用年限短,韌帶容易斷裂致使骨骼散架。透明雙染色骨骼標本利用阿爾新藍、不同濃度梯度的酒精或甲醇、胰蛋白酶、茜素紅使骨骼顯現(xiàn)出藍色與紅色,使軟組織透明,以此方便觀察[3]。關節(jié)分離式骨骼標本具有不易損壞的優(yōu)點,在實際生活中更為常見。

在關節(jié)分離式骨骼標本的制作過程中,脫脂是重要的環(huán)節(jié),常用物理和化學方法進行脫脂。物理脫脂的方法有高壓蒸汽滅菌鍋蒸煮和超臨界CO2處理[4]。有學者研究表明,高溫煮沸會增加鯨魚骨骼孔隙率,超臨界CO2萃取使骨骼中的哈佛斯管產(chǎn)生細小裂紋,兩種方法都會對骨骼的膠原蛋白造成不可逆的損傷[5-6]。脫脂的化學試劑有汽油、工業(yè)酒精、丙酮、環(huán)已酮、甲醛/氯仿、天那水、二甲苯、醋酸戊酯、十二烷基苯磺酸鈉[7-9]。用FT-拉曼光譜及氣相色譜開展氯化溶劑和丙酮對骨骼的脫脂試驗,氯化溶劑會使骨骼變脆并產(chǎn)生細小裂紋,丙酮脫脂僅作用于骨骼表面,對骨骼內部脫脂作用不顯著[10]。對魚類骨骼采用氨水進行脫脂,氨水對小型骨骼具有良好脫脂效果,大型骨骼用氨水可以輔助脫脂;對綿羊骨骼用氨水防止泛油腐蝕,結果顯示,氨水對動物骨骼的脫脂不徹底具有較好防止泛油的效果;在羊骨骼的脫脂處理中用汽油進行初步脫脂,其次取90 ℃的熱水進行浸泡,浸泡過程中添加氨水進一步脫脂,此時熱水中有氣泡冒出,冒泡停止后,脂肪全部脫出[11-12]。

本研究運用關節(jié)分離式骨骼標本制作方法,用氨水作為脫脂溶劑對210日齡雄性羊駝骨骼進行脫脂試驗,探索骨骼標本在使用過程中不腐爛變質、不泛油變黃的骨骼脫脂新方法,以期為骨骼標本的制作提供新的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗用骨骼 選取210日齡雄性羊駝大小相近的10對肋骨及其他部位的骨骼。

1.1.2 主要試劑 氫氧化鈉(批號:20210508),天津科密歐化學試劑有限公司產(chǎn)品;過氧化氫片劑(批號:20210927),昌樂鑫富強有限公司產(chǎn)品;氨水(批號:20200707),煙臺遠東精細化工有限公司產(chǎn)品;蒸餾水由榆林學院生命科學學院實驗室提供。

1.1.3 儀器與設備 解剖手術臺、電子天平、浸泡箱、恒溫箱,均由榆林學院生命科學學院實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 動物預處理 ①取210日齡雄性羊駝沿腹中線打開腹腔去除內臟,進行清水沖洗,以四肢、頸部、頭部依次取下,逐一剔除骨骼各部位上的軟組織,解剖過程中舌骨、腕骨、籽骨、胸骨柄等細小骨要保留[13]。②剝離好的骨骼依照骨骼的大小、密度、骨髓腔容量放入1～3號浸泡箱內,頭骨、頸椎、胸椎、腰椎、薦骨置1號浸泡箱,前肢骨置2號浸泡箱,后肢骨、骨盆置3號浸泡箱。同時肋骨、胸骨、舌骨、尾椎、腕骨、籽骨等細小骨分類置于各紗布袋內[14],置入燒杯內。將現(xiàn)配制的20 g/L NaOH溶液對骨骼進行初步脫脂腐蝕,浸泡箱內NaOH溶液以沒過骨骼為準,分別加入配制好的NaOH溶液。1～20號燒杯內肋骨斜置,各加入1 L配制好的NaOH溶液使肋骨完全浸于溶液當中。21號燒杯內細小骨與所剩6根肋骨加入配制好的NaOH溶液。經(jīng)肉眼觀察殘余肌肉呈透明膠凍樣后,對骨骼澆注約85 ℃的熱水,長骨兩端打孔,利用注射器清水沖洗后,將配制的20 g/L NaOH溶液注入到長骨內骨髓腔。再于NaOH溶液中浸泡10～12 h,后清水沖洗,清除殘余肌肉并剔除蹄部角質層,暴露骨骼,為脫脂漂白試驗做好準備。腐蝕脫脂完成后,根據(jù)骨骼大小、密度和骨髓腔容量,將骨骼分為后肢骨、前肢骨、頭骨、肋骨、細小骨等5類,并置于不同的容器。

1.2.2 骨骼脫脂漂白 ①選取羊駝肋骨13對中的10對大小相近的肋骨,將20根肋骨依次置入1號～20號燒杯內,隨機為分4組。同時制備濃度為2、4、6、8、10 mL/L氨水與100 mL/L H2O2混合溶液,將其1組的每件燒杯分別加入1 L制備好的混合溶液置于20 ℃的恒溫箱內反應,其反應時間設為4 h(其余組將溫度依次設為25、30、35 ℃,其濃度、液體量、時間等其他條件不變)。觀察不同條件下的脫脂效果。②對篩選到的最適氨水濃度及溫度,其室溫與恒溫箱溫度相近時,骨骼可在室內進行脫脂,將后肢骨、前肢骨、頭骨、所剩肋骨、細小骨為標志性骨骼與全身其他骨骼分類置于不同的浸泡箱,添加溶液使骨骼完全浸于溶液中進行脫脂漂白處理,觀察各浸泡箱內骨骼的脫脂時間。

2 結果

2.1 不同溫度、氨水濃度處理結果

25～30 ℃時6 mL/L的氨水皂化反應可控且不損傷肋骨,1 h后反應明顯,大量白色泡沫析出,泡沫表面附有脂滴,用玻璃棒進行緩慢攪拌使骨骼充分與藥品發(fā)生反應。在溫度相同情況下,氨水濃度越高,反應越迅速,氨水濃度過高對肋骨表面產(chǎn)生損傷,對肋體損傷較大,肋頭次之。在溫度不同,氨水濃度相同的情況下,低溫無法對肋骨有效脫脂漂白,并對肋骨表面造成了損傷(表1)。

表1 反應4 h條件下不同濃度、不同溫度的氨水與100 mL/L H2O2的混合溶液對肋骨的處理效果

2.2 不同部位骨骼在氨水中的處理時間和效果

25～30 ℃、6 mL/L氨水對不同類型骨骼脫脂漂白顯示,后肢骨9 h可完成脫脂漂白,前肢骨8 h可完成脫脂漂白,頭骨6 h可完成脫脂漂白,籽骨、腕骨、髕骨、尾椎、胸骨柄等細小骨骼,2 h可完成脫脂漂白,表明骨骼的大小、密度、骨髓腔容量會影響到脫脂漂白的時間,且呈正相關性(表2)。

表2 氨水對不同部位骨骼脫脂漂白的效果

3 討論

氨水為無機溶劑,與有機溶劑相比,H2O2漂白過程中添加氨水能與油脂產(chǎn)生皂化反應,不同于NaOH的皂化反應,強堿作用在暴露骨質的骨骼其損傷較為嚴重,而氨水為弱堿對骨骼損傷較小。本研究通過氨水與H2O2的混合溶液對羊駝骨骼的處理,發(fā)現(xiàn)溫度在25～30 ℃反應可控且不損傷骨骼。此外,在25～30 ℃的條件下發(fā)現(xiàn)當氨水的濃度過高或室內溫度過高,皂化反應明顯增強,同時室外陽光充沛的條件下自然光的直射,會導致皂化反應劇烈,制作過程中需關注自然條件造成的影響,必要時需迅速將骨骼取出并重新配制溶液。

漂白作為較多動物骨骼標本所必需的環(huán)節(jié),H2O2濃度超過200 mL/L會造成骨骼的損傷,H2O2濃度對于不同動物不同部位的骨骼、薄厚、骨質及其抗侵蝕的性質也均有差別[15],按照動物體型、骨密度、骨髓腔容量等原則合理控制H2O2濃度在30～100 mL/L[16],可降低對骨質的影響。

NaOH作為骨骼脫脂腐蝕的重要試劑,其不僅能夠去除殘留在骨骼凹槽縫隙處的肌肉,同時還可將脂肪水解成甘油和脂肪酸鹽,對去除骨骼表面的油脂有一定的成效[17-18]。本試驗羊駝骨骼利用NaOH處理后其表面均有油污殘留,其中較小的骨骼表面油脂處理有一定效果,而長骨骨骼表面殘留有較多油污和不規(guī)則小黃點,說明NaOH可作為油脂處理的輔助方法,但其主要作用是去除骨骼縫隙內殘余筋肉。

動物骨骼標本制作時,未完全脫脂的骨骼,油脂會緩慢滲出,極易滋生細菌污染,影響骨骼標本的使用壽命[19]。動物骨骼的質量也會影響到骨骼標本的使用和保存年限,老齡動物骨骼往往伴有纖維質骨化,骨骼內黃骨髓過多,難于溶解,骨髓中含有大量飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸,是造成骨骼標本發(fā)生霉變、發(fā)黑、散發(fā)酸臭味等造成使用年限縮短的主要誘因,而幼齡動物骨骼發(fā)育不完善,部分骨骼發(fā)育未愈合,不適于制作為骨骼標本。為了避免動物本身對骨骼標本造成的影響,選擇試驗動物方面,成年動物相比老齡動物與幼齡動物更易制作骨骼標本[20-22]。

羊駝骨骼以6 mL/L氨水與100 mL/L H2O2混合,25～30 ℃脫脂漂白效果較好,其脫脂漂白的時間與骨骼的大小、密度、骨髓腔容量呈正相關性。通過對羊駝全身骨骼的脫脂漂白處理,為脫脂的方案增添了新的選擇,同時填補了制作羊駝骨骼標本資料上的空白。