楊軍, 孔祥瑞, 鄭國華, 邱陳華, 王讓劍

茶樹品種‘金牡丹’自然雜交后代遺傳鑒定

楊軍, 孔祥瑞, 鄭國華, 邱陳華, 王讓劍*

(福建省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所/國家茶樹改良中心福建分中心/農(nóng)業(yè)部福建茶樹及烏龍茶加工科學觀測實驗站，福州 350000)

為了對‘金牡丹’茶樹自然雜交后代進行遺傳鑒定，利用EST-SSR毛細管電泳熒光標記技術對65個金牡丹自然雜交后代進行研究。結(jié)果表明，28對SSR標記共擴增出192個等位片段，平均等位基因數(shù)(Na)、平均觀測雜合度(Ho)及遺傳多態(tài)信息量(PIC)分別為6.86、0.540、0.532。單親基因型已知時的累積排除概率為0.999，說明選擇的28對SSR標記位點具有高度的多態(tài)性和較高的排除概率，適用于遺傳分析和個體的親子鑒定。15個‘金牡丹’自然雜交后代的遺傳鑒定結(jié)果表明，MD44、JMD45、JMD47、JMD32為早生綠茶類型；JMD51、JMD53為閩北肉桂烏龍茶類型；MD2、JMD56為閩南‘鐵觀音’烏龍茶類型；JMD24、JMD26、JMD29、JMD55、JMD59、JMD27、JMD61為‘黃棪’烏龍茶類型。

茶樹；自然雜交；EST-SSR；遺傳鑒定; 模擬分析

茶樹是山茶科(Theaceae)山茶屬()茶組(sect.)的多年生常綠木本植物[1]，且為常異花授粉植物，具有高度雜合性，雜交結(jié)實率低[2]，自然雜交收獲種子比人工雜交收獲種子相對容易，但缺乏對其父本信息了解，對自然雜交后代父本的模擬鑒定有助于提高茶樹育種者對茶樹自然雜交后代的選擇。EST-SSR具有共顯性、多態(tài)性高、重復性好等特點[3–8]，被應用在不同生物上進行模擬親本鑒定。用于親本模擬分析的軟件主要有CERVUS、COLONY和PAPA，李博等[9]對比了這3個軟件的準確率，認為CERVUS親本模擬分析的準確率可達81.2%，鑒定效果較好。不同作物都有大量采用CERVUS軟件進行親本模擬分析的報道，艾暢等[10]通過馬尾松()自由授粉子代模擬父本分析，建立遺傳多樣性與同父本組成之間的聯(lián)系，為種子園集約生產(chǎn)種子提供理論依據(jù)；張冬梅等[11]利用SSR對油松()種子進行父本分析, 結(jié)合油松在園內(nèi)的分布，明確種子園內(nèi)花粉傳播的最大距離和花粉活力；馮源恒等[12]對廣西馬尾松第2代育種群體進行父本分析，表明個體間的近交程度較低，為開展馬尾松高世代雜交育種奠定了基礎；王建忠等[13]從桉樹()候選父本中鑒定出D2、D4、D11、D19、D20等7個子代的父本，探究了桉樹自交不親和與近交衰退機制，并準確進行子代父本鑒定和雜交親本重建; 邵文豪等[14]認為高多態(tài)性和高累積排除概率的SSR位點適用于對油橄欖()品種子代進行父本分析，‘城固32’具有一定的自交親和性，這為品種建園時授粉品種的選擇和配置提供重要依據(jù)；何勇鳳等[15]準確找出了圓口銅魚子1代()的父母本，為圓口銅魚的家系管理、種群遺傳管理和增殖放流效果評估提供了科學依據(jù)；余書平等[16]對開化縣茶樹種質(zhì)資源進行父本分析，了解茶樹種質(zhì)資源的遺傳背景。同時，利用CERVUS軟件對子代模擬親本鑒定在黃鰭棘鯛()[17]、鳙()[18]、羊()[19]、黃喉擬水龜()[20]、許氏平鲉()[21]和唇?()[22]等生物上有較多的報道。總的來說，親本模擬分析主要用于分析親本的遺傳方式(花粉轉(zhuǎn)播距離、自交不親性)、后代群體遺傳差異評估(遺傳多樣性、種群遺傳管理、遺傳背景、近交程度)、輔助雜交后代選擇等方面。

茶樹品種‘金牡丹’為“九五”國家科技攻關的一級優(yōu)異茶樹種質(zhì)資源[23]，適制性廣，制優(yōu)率高，制烏龍茶香氣馥郁芬芳，滋味醇厚甘爽，“韻味”顯, 制紅、綠茶花香顯、味醇厚。本試驗以42個福建茶樹良種為候選父本對‘金牡丹’自然雜交后代進行分子鑒定，并調(diào)查其節(jié)間長度、葉片長度、葉片寬度等葉片性狀，旨在分析‘金牡丹’自然雜交后代親緣關系與遺傳差異，為茶樹品種選育提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

2015年11月收取福建省茶樹種質(zhì)資源圃內(nèi)‘金牡丹’成熟茶果，2016年1月播種。2016年11月選取生長正常的實生苗，與福建省茶樹種質(zhì)資源圃鄰近種植，位于福建省農(nóng)業(yè)科學院茶葉研究所二號山(27°12′58″ N，119°34′31″ E)。種植規(guī)格為行距1.5 m，株距0.3 m，按順序編號JMD1～JMD65。2019年分別采集65個‘金牡丹’自然雜交后代和42個福建省茶樹品種(福建省茶樹種質(zhì)資源圃內(nèi))的嫩葉，用液氮冷凍處理，于-70 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?表1)。

1.2 方法

基因組DNA的提取 采用改進的CTAB法[24]提取茶樹基因組DNA。采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，用756-MC型紫外分光光度計測定OD260和OD280，檢測茶樹基因組DNA的純度。

引物合成 參照Ma等[25]的引物序列，序列由上海Sangon公司合成，引物信息見表2。

PCR擴增和產(chǎn)物鑒定 PCR反應體系為: 雙蒸水18.8L，2.5L 10×Buffer (Mg2+)，0.5L dNTP (10 mmol/L)，正、反向引物(10mol/L)各0.5L,聚合酶0.2L (0.5 U)，模板DNA 1L。PCR反應于美國ABI-9600型擴增儀上進行，反應程序為: 94 ℃預變性4 min；然后94 ℃變性45 s，不同溫度下退火60 s，72 ℃延伸75 s，共35次循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。反應產(chǎn)物于4 ℃保存。統(tǒng)一在反向引物(R)的5′段標記熒光(FAM/TAMRA), 由上海百力格生物科技有限公司合成。擴增產(chǎn)物0.5L，GeneScan? 500 ROX? 0.5L，HiDi 9L，混勻后使用ABI公司3730XL進行毛細管電泳。

葉片性狀測量 測量17個‘金牡丹’自然雜交后代(父本模擬達到顯著性)與40個福建良種的主要葉片性狀，主要有第1～3葉芽稍的長度、第1～3節(jié)間長度、葉齒數(shù)、葉脈對數(shù)、第1～4葉片長度與寬度，每個性狀調(diào)查重復5次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用ABI公司的GeneMapper 4.0軟件，選擇GeneScan? 500 ROX?作為分子量標準，對每條擴增條帶記錄大小。使用Cervus 3.0[26]軟件計算多態(tài)信息含量、期望雜合度、等位基因頻率與非父排除概率等參數(shù)。利用SAS9.3進行葉片性狀聚類。運用NTSYSpc 2.1對參試材料進行遺傳距離計算，利用MEGA7進行UPGMA聚類分析，并利用網(wǎng)站https://itol.embl.de/進行圖片優(yōu)化。

1.4 親子鑒定模擬分析

使用Cervus 3.0軟件進行親子鑒定模擬分析，分別運行Simulation程序與Parentage Analysis程序中的paternity子程序，模擬10 000次親子鑒定，candidate fathers的設置為42，候選親本檢測率為80%, 位點檢測率為90%, 基因型判別錯誤率為0.01, 計算候選親本基因型似然對數(shù)比(LOD)值和95%置信水平，根據(jù)LOD值判定親子關系。對福建省農(nóng)業(yè)科學院茶葉所審(鑒)定品種、65個‘金牡丹’自然雜交后代分別進行雙親模擬分析與單親模擬分析。

表1 供試材料

表2 SSR引物信息

續(xù)表(Continued)

2 結(jié)果和分析

2.1 遺傳多樣性分析

對65個‘金牡丹’自然雜交后代與42個模擬親本進行擴增，28個SSR位點的平均等位基因數(shù)6.86個(表3)，其中，TM422位點上的等位基因數(shù)目最多(14個)，TM499和TM589最少(3個)，均滿足利用SSR標記進行父本分析所需等位基因數(shù)要求。28個SSR位點的平均觀測雜合度和期望雜合度分別為0.540和0.583，變異范圍分別為0.247～0.794和0.240～0.805。Ho與HE均值相近，表明茶樹品種受選擇及近交等因素的影響較小，平均雜合度較高, 等位基因在群體中分布較均勻。

2.2 多態(tài)信息含量及排除概率

28個SSR位點的平均多態(tài)信息含量(PIC)為0.532, 其中，TM499位點最低(0.221)，TM262位點最高(0.778)。28個SSR位點具有豐富的多態(tài)性, 能夠為研究提供足夠的多態(tài)信息。

當雙親基因型皆未知時，單個SSR位點的非父排除概率(NE-1P)為0.551～0.972，均值0.793；當1個親本基因型已知時，單個SSR位點的非父排除概率(NE-2P)為0.375～0.882，均值0.645；當雙親基因型已知時，單個SSR位點的非父排除概率(NE-PP)為0.187～0.793，均值0.485 (表4)。

依據(jù)PIC由高至低次累積計算28個SSR位點的排除概率，隨著SSR位點數(shù)增加，累積排除概率增大(圖1)。對于單親已知類NE-2P，基于前6個SSR位點累積排除概率0.975，基于前13個SSR位點累積排除概率0.999，而基于全部28個SSR位點累積排除概率接近1。因此，28對引物適合用于親本鑒定分析。

2.3 親子模擬鑒定分析

從表4可見，18個福建省農(nóng)業(yè)科學院茶葉所審(鑒)定品種的親子鑒定可分為2個類型，類型I真實親本不在實驗模擬親本中，‘悅茗香’(母本為‘赤葉觀音’)、‘早春毫’(母本為‘迎春’)、‘朝陽’(母本為‘崇慶枇杷茶’)未能找到顯著性模擬親本；類型II真實親本在實驗模擬親本中，‘福云6號’、‘福云7號’、‘福云10號’、‘福云20號’和‘福云595’的真實親本之一為‘福鼎大白茶’，另一真實親本(‘云南大葉種’)未在42個模擬親本中；‘黃奇’、‘春蘭’、‘瑞香’、‘丹桂’、‘紫牡丹’的真實親本之一分別為‘黃棪’、‘鐵觀音’、‘黃棪’、‘肉桂’、‘鐵觀音’，單一親本鑒定模擬結(jié)果與真實親本相一致；‘茗科1號’、‘金牡丹’真實親本為母本(‘鐵觀音’)、父本(‘黃棪’)，雙親親本模擬鑒定結(jié)果與真實親本相一致；‘黃玫瑰’、‘黃觀音’的真實親本與模擬鑒定結(jié)果不完全一致，能準確模擬到其中之一親本為‘黃棪’；‘九龍袍’模擬親本之一為‘肉桂’，且達到顯著性水平，‘九龍袍’真實父本未知，推測‘肉桂’為‘九龍袍’真實父本。類型II中的12個品種能找到真實親本，準確率80%，因此，模擬親本結(jié)果較為準確。

65個‘金牡丹’自然雜交后代中的25個子代的LOD值均大于0，且置信度均達到95%，說明25個‘金牡丹’自然雜交后代均能準確地找到顯著性模擬父本。后代中模擬父本為‘茗科1號’的有14個, 占56%，其次模擬父本為烏龍茶品種的有‘丹桂’、‘黃棪’和‘黃奇’，模擬父本為綠茶品種的有‘福鼎大白茶’、‘福云6號’和‘福云7號’ (表5)。

2.4 ‘金牡丹’自然雜交后代親緣關系分析

為進一步解讀‘金牡丹’自然雜交后代的遺傳信息，將模擬父本結(jié)果標注在107個參試材料遺傳距離聚類圖上(圖2)?！鹉档ぁ匀浑s交后代的顯著性模擬父本(天藍色)為‘黃棪’、‘茗科1號’、‘丹桂’、‘福鼎大白茶’與‘福云6號’等，為福建省主要種植烏龍茶和綠茶品種，模擬父本來源廣泛，遺傳多樣性豐富。‘金牡丹’為‘鐵觀音’ (母本)與‘黃棪’ (父本)的人工雜交后代，大多數(shù)‘金牡丹’自然雜交后代受雙親的影響，分別與祖母、祖父、母本、模擬父本聚類在一起，形成5個類群。5個類群分別為‘鐵觀音’ (祖母)與‘金牡丹’自然雜交后代類群(草綠色)、‘黃棪’ (祖父)與‘金牡丹’自然雜交后代類群(深藍色)、‘金牡丹’(母本)與‘金牡丹’自然雜交后代類群(紅色)、‘茗科1號’ (模擬父本)與‘金牡丹’自然雜交后代類群(金黃色)、‘丹桂’ (模擬父本)與‘金牡丹’自然雜交后代類群(淺紫色)；Jmd51、Jmd53模擬父本為‘丹桂’，與‘丹桂’ (模擬父本)形成一個類群。少部分‘金牡丹’自然雜交后代未與親本聚類在一起, Jmd44、Jmd45模擬父本為‘福云6號’，遺傳聚類分別未與‘金牡丹’ (母本)、‘福云6號’ (父本)聚類在一起，推測Jmd44、Jmd45遺傳信息受雙親共同作用影響。另外, JMD9、JMD3未能模擬到顯著性父本，從遺傳距離看分別與‘白芽奇蘭’、‘杏仁茶’遺傳距離較近，推測JMD9、JMD3的真實父本與‘白芽奇蘭’、‘杏仁茶’親緣關系較近，且遺傳信息偏向未知父本。

表3 28對SSR引物遺傳多樣性與鑒定排除率

NS:>0.05; *:<0.05; ***:<0.001; ND: 未檢驗。

NS:>0.05; *:<0.05; ***:<0.001; ND: Not detected.

圖1 28個SSR位點的累積排除概率

表4 18個茶樹品種的親子鑒定結(jié)果

表5 65個茶樹品種的父本

續(xù)表(Continued)

2.5 ‘金牡丹’自然雜交后代遺傳多樣性分析

將107份試驗材料按來源與是否找到顯著性父本進行分類，分為4個類群進行遺傳多樣性分析。從表6看出，參試材料的Shannon信息指數(shù)為0.828～ 1.245，類群的遺傳多樣性為：類群D>所有材料>類群C>類群B>類群A，說明65個‘金牡丹’自然雜交后代降低參試材料整體的遺傳多樣性水平，且遺傳多樣性略低于福建省茶樹品種。Ho和He分別為0.497～0.587和0.481～0.625。其中，類群C的Ho與He相當，屬于基因型的分布就越接近于平衡狀態(tài)，說明65個‘金牡丹’自然雜交后代群體基因型相對穩(wěn)定；類群A的Ho大于He，說明存在雜合子過剩，推測類群A基因型雜合性較高；類群D的Ho小于He，說明存在雜合子缺失現(xiàn)象，福建省茶樹品種間遺傳交流較少。

2.6 ‘金牡丹’自然雜交后代葉片性狀輔助鑒定

基于葉片長寬、葉齒數(shù)、葉脈對數(shù)等性狀，利用SAS軟件對父本模擬顯著性的‘金牡丹’自然雜交后代與福建主要茶樹品種進行葉片性狀聚類(圖3)。模擬父本為‘福云6號’、‘福云7號’的‘金牡丹’自然雜交后代JMD44、JMD45、JMD47都聚類在類群I中，且類群I中主要為‘福云6號’、‘福云7號’、‘福云10號’、‘福云20號’等綠茶品種，推測JMD44、JMD45、JMD47葉片主要性狀偏向于模擬父本，可優(yōu)先進行綠茶、白茶加工品質(zhì)鑒定。

圖2 遺傳距離聚類圖

表6 4個群體的遺傳多樣性

類群III內(nèi)JMD51、JMD53模擬父本為‘丹桂’，葉片性狀與‘丹桂’的母本‘肉桂’聚類在一起，葉片性狀更偏向‘肉桂’(祖母)。JMD61模擬父本為‘黃奇’, 葉片性狀更偏向‘黃棪’(祖母)。JMD59模擬父本為‘黃棪’，葉片性狀與‘黃棪’聚類在一起，葉片性狀偏向于模擬父本‘黃棪’。MD24、JMD26、JMD29、JMD55與JMD27、JMD41的模擬父本分別為‘茗科1號’與‘黃棪’，葉片性狀與‘黃棪’聚類在一起，葉片性狀更偏向于‘黃棪’(祖父、模擬父本)，可優(yōu)先進行烏龍茶加工品質(zhì)鑒定。

類群IV中JMD56、JMD2模擬父本為‘茗科1號’，葉片性狀與‘茗科1號’的母本‘鐵觀音’聚類在一起，葉片性狀更偏向‘鐵觀音’(祖母)，可優(yōu)先進行烏龍茶加工品質(zhì)鑒定。

3 結(jié)論和討論

3.1 影響模擬父本篩選的因素

本試驗選擇的候選父本為42個福建省鑒定審(鑒)定品種，引物28對，在95%置信水平下為25個自然雜交后代找到模擬父本，顯著性模擬父本的概率為38.4%，與其他植物的模擬父本概率(37.67%[10]、34.5%[11]、36.2%[14])相近。影響模擬父本篩選的因素較多，耿瑞靜等[27]認為無效等位基因的存在是影響親子鑒定結(jié)果準確性的首要因素；祝招玲等[28]研究表明無效等位基因是影響親權(quán)鑒定準確性的基礎因素；朱克誠等[17]認為無效等位基因與等位基因的缺失導致低質(zhì)量的DNA序列是影響準確性的主要原因?；蚍中湾e誤也會導致子代與親本的錯配，一方面是實驗操作包括PCR擴增、電泳等諸多因素影響, 使得條帶擴增不清導致分型錯誤, 另一方面是數(shù)據(jù)處理過程中的人為分型錯誤[29]; 親子關系鑒定試驗中應盡可能降低標記基因型在擴增和判定時的錯誤率，有些微衛(wèi)星基因座在擴增時可能產(chǎn)生無效基因，導致某些等位基因無法出現(xiàn)，本可能為雜合子的個體可能出現(xiàn)為純合子，這會影響鑒定的準確性[30]；進行排除法親本分析時, 群體中候選親本數(shù)量不宜大于100，否則很難為大多數(shù)子代確定親本來源[31]。本試驗認為，無效等位基因是不可避免的，只能盡可能的降低；候選父本的數(shù)量不是越多越好，而是模擬父本代表性越強越好，在理論上，選擇相同母本與親緣關系相近的品種作為父本，雜交后代可能為基因型一致的或極其相似的, 因此，增加親緣關系相近的品種作為模擬父本數(shù)量會影響到軟件鑒定的結(jié)果；同時構(gòu)建核心種質(zhì)與確定核心引物有利于提高模擬親本鑒定結(jié)果準確性。

圖3 葉片性狀最大距離法聚類圖

3.2 ‘金牡丹’自然雜交后代鑒定與輔助篩選

本研究中父本模擬分析達到顯著性的‘金牡丹’自然雜交后代一共有25個，其中8個模擬父本為‘茗科1號’的自然雜交后代種植4 a后，樹勢衰弱或自然死亡，不能滿足葉片性狀調(diào)查的需要，可能由于‘茗科1號’與‘金牡丹’雜交組合屬于近親雜交，部分雜交后代生長勢弱。對父本模擬達到顯著性的‘金牡丹’自然雜交后代需進一步分析。

模擬父本相同的‘金牡丹’自然雜交后代，親緣關系聚類可能有差異。JMD59、JMD27、JMD41模擬父本同為‘黃棪’，葉片性狀與‘黃棪’相似，但親緣關系聚類顯示有所不同，JMD59與‘金牡丹’(母本)親緣關系更接近，JMD41與‘黃棪’(模擬父本)親緣關系更接近，JMD27與‘茗科1號’親緣關系更接近。JMD51、JMD53與JMD46的模擬父本相同，JMD51、JMD53與‘丹桂’(模擬父本)親緣關系更接近，葉片性狀更接近‘肉桂’(祖母)；JMD46與‘金牡丹’(母本)親緣關系更接近，葉片性狀更接近福云系列綠茶品種，葉片性狀遺傳可能來自于‘丹桂’(模擬父本)的未知父本。

模擬父本相同的試驗材料，葉片性狀聚類可能有差異。JMD24、JMD26、JMD29、JMD55與MD2、JMD56模擬父本同為‘茗科1號’，JMD24、JMD26、JMD29、JMD55的葉片性狀聚類與‘黃棪’(祖父)在一起，后代可能與‘黃棪’(祖父)品質(zhì)性狀相似; MD2、JMD56的葉片性狀聚類與‘鐵觀音’(祖母)在一起，后代可能與‘鐵觀音’(祖母)品質(zhì)性狀相似。

因此， ‘金牡丹’自然雜交后代在相同模擬父本的情況下，葉片性狀可以分別與父本、母本、祖父、祖母相似。進行初步輔助選種，選種目標為早生優(yōu)質(zhì)綠茶品系的可以選擇JMD32、MD44、JMD45、JMD46和JMD47進行鑒定；選種目標為閩北高香巖茶烏龍茶品系可以選擇JMD51和JMD53進行鑒定；選種目標為閩南‘鐵觀音’烏龍茶品系可以選擇MD2和JMD56進行鑒定；選種目標為與‘黃棪’相似的早生高香烏龍茶類型可以選擇JMD24、JMD26、JMD27、JMD29、JMD41、JMD55和JMD59。

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Genetic Identification of the Natural Hybrid Progenies of ‘Jinmudan’ Tea Varieties

YANG Jun, KONG Xiangrui, ZHENG Guohua, QIU Chenhua, WANG Rangjian*

(Tea Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences/Fujian Branch, National Center for Tea Improvement/Scientific Observing and Experimental Station of Tea Tree and Oolong Tea Processes in Fujian, Ministry of Agriculture,Fuzhou 350000, China)

In order to analyze the genetic identification of the natural hybrid progenies of tea, EST-SSR capillary electrophoresis fluorescence maker technique was used to analyze 65 the natural hybrid progenies of ‘Jinmudan’ tea. The results showed that a total of 192 polymorphic alleles were detected by 28 SSR markers, the average number of alleles (Na), observed heterozygosity (Ho) and polymorphism information content (PIC) was 0.58, 0.58 and 0.98, respectively. When the parental genotype was known, the combined exclusion probability was all reached 0.999, indicating that the 28 selected SSR marker sites had high polymorphism and high probability of exclusion, which were suitable for genetic analysis and paternity identification of individuals. The results of genetic identification showed that the 15 natural hybrid progenies of ‘Jinmudan’ tea could be divided into 4 types, JMD44, JMD45, JMD47 and JMD32 were early green tea, JMD51 and JMD53 were ‘Rougui’ oolong tea in northern Fujian, MD2 and JMD56 were ‘Tieguanyin’ oolong tea in southern Fujian, JMD24, JMD26, JMD29, JMD55, JMD59 and JMD27 were ‘Huangdan’ oolong tea.

Tea tree; Natural hybrid; EST-SSR; Genetic identification; Simulation analysis

10.11926/jtsb.4557

2021-11-02

2022-02-07

福建省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(茶葉)產(chǎn)業(yè)技術體系項目(閩農(nóng)綜2019[144號])；公益類科研院所專項(2021R1029008)資助

This work was supported by the Project for Modern Agriculture (Tea) Industry Technology System in Fujian (Grant No. 2019[144]), and the Special Project for Public Welfare Research Institutes in Fujian (Grant No. 2021R1029008).

楊軍(1981年生)，男，碩士，助理研究員，主要從事茶樹種質(zhì)資源與遺傳育種研究。E-mail: 99258768@qq.com

E-mail: wangrj@faas.cn