李 玥 蔣 帥 楊 希 龔思銘 何 穎 曹軍英 卓忠雄

據(jù)2020年國際癌癥研究中心數(shù)據(jù)顯示，我國已成為肺癌疾病負(fù)擔(dān)最重的國家，肺癌發(fā)病率和死亡率逐年上升，分別占全球總病例的37.0%、39.8%［1］。我國肺癌臨床診療指南（2021版）［2］針對可完整切除的ⅡA～ⅡB期非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者，推薦以鉑類為基礎(chǔ)的方案進(jìn)行輔助化療；針對ⅢA期可手術(shù)的NSCLC患者，推薦術(shù)后含鉑兩藥方案輔助化療；針對Ⅲ期不可切除的NSCLC患者，推薦以鉑類為主的同步化療方案或序貫化療方案（均為1類推薦證據(jù)）?？ㄣK作為肺癌化療方案一線藥物，確保其抗腫瘤療效并減少嚴(yán)重全身毒副作用一直是臨床醫(yī)學(xué)面臨的難題。微泡作為無肝、腎毒性的超聲對比增強(qiáng)劑，在超聲輻照下可向腫瘤遞送化學(xué)治療劑，該方法稱為聲化療［3］?；熯^程中，超聲聯(lián)合微泡（ultrasound combined with microbubbles，USMB）可以開放生物膜屏障、輔助化療藥物進(jìn)入腫瘤細(xì)胞，改善藥物分布［4-5］。本實驗旨在探討USMB在卡鉑化療A549肺癌細(xì)胞凋亡中的作用。

材料與方法

一、主要實驗材料

1.細(xì)胞及試劑：A549肺癌細(xì)胞系（由陸軍軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心實驗室提供）；胎牛血清（澳大利亞AusGeneX公司），DMEM/F12培養(yǎng)基（武漢普諾賽生命科技有限公司），青-鏈霉素（美國GE Healthcare Life Sciences公司）、胰酶（北京索萊寶科技有限公司），卡鉑（昆明貴研藥業(yè)有限公司）。SonoVue（意大利Bracco公司，2～5×108個微泡/ml）。醫(yī)用超聲耦合劑（重慶安碧捷科技股份有限公司）。Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒（美國BD Pharmingen公司）。

2.儀器：彩色多普勒超聲診斷儀（Accusonic Plus-AP 170，澳大利亞Metron公司），901150探頭，面積5 cm2，聲 強(qiáng)0～3 W/cm2；流 式 細(xì) 胞 儀（Gallios，美 國Beckman Coulter公 司）；離 心 機(jī)（5702 R，德 國Eppendorf公司）。

二、主要實驗方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)、傳代及分組：A549肺癌細(xì)胞采用DMEM/F12培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素）于37℃、5%二氧化碳孵箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁生長融匯至80%～85%，用0.25%胰酶（不含EDTA）消化，行1∶3傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，于6孔板中每孔配置5×105個細(xì)胞懸液，設(shè)置6組：對照組（未經(jīng)任何處理）、US組（僅使用超聲輻照）、USMB組（使用超聲輻照聯(lián)合微泡）、CBP組（僅使用卡鉑）、CBP+US組（使用超聲輻照+卡鉑）、CBP+USMB組（使用超聲輻照聯(lián)合微泡+卡鉑）；其中卡鉑均采用最適宜劑量50μg/ml［6］。超聲輻照方法：保持孔板水平，于每孔板底部涂耦合劑后進(jìn)行超聲輻照，每15 s水平轉(zhuǎn)動探頭90°，避免探頭各個區(qū)域能量差異所致輻照能量不均。超聲輻照參數(shù)：聲強(qiáng)0.6 W/cm2，峰值負(fù)壓0.35 MPa，占空比10%，中心頻率1 MHz，脈沖重復(fù)頻率100 Hz，輻照時間1 min［6］。SonoVue微泡配制：加入5 ml注射用0.9%生理鹽水振搖并完全溶解凍干物，制成六氟化硫微泡混懸液，使用血球計數(shù)板計數(shù)，加入培養(yǎng)基稀釋至細(xì)胞與微泡數(shù)量比約1∶1。

2.流式細(xì)胞術(shù)檢測各組A549肺癌細(xì)胞凋亡率：各組處理后培養(yǎng)24 h。收集上清液中的懸浮細(xì)胞，使用PBS漂洗2次，加入胰酶（不含EDTA）消化細(xì)胞，輕柔吹打并收集細(xì)胞懸液，合并上清液與消化下的細(xì)胞懸液，離心5 min（1000 r/min），使用PBS漂洗后再次離心5 min（1000 r/min）重懸加入EP管，離心（1000 r/min，5 min）去上清液，將細(xì)胞重新懸浮在100μl結(jié)合緩沖液（約1×105個細(xì)胞），轉(zhuǎn)至5 ml試管中，加入5μl FITC標(biāo)記的Annexin V、5μl PI室溫避光反應(yīng)15 min，加入400μl結(jié)合緩沖液，在1 h內(nèi)使用流式細(xì)胞儀檢測各組A549肺癌細(xì)胞凋亡率；應(yīng)用Kaluza分析軟件（美國Beckman Coulter公司）分析其結(jié)果。其中，Annexin V（+）/PI（-）提示早期凋亡細(xì)胞；Annexin V（+）/PI（+）提示晚期凋亡細(xì)胞；總凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。各組均收集3個獨立樣本，取平均值。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

各組A549肺癌細(xì)胞24 h凋亡率點陣圖見圖1。檢測12 000個細(xì)胞，其中右上象限示晚期凋亡細(xì)胞，右下象限示早期凋亡細(xì)胞，左下象限示正常細(xì)胞。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組A549肺癌細(xì)胞24 h凋亡率點陣圖

各組A549肺癌細(xì)胞凋亡率比較見表1。A549肺癌細(xì)胞總凋亡率由低到高依次為對照組、US組、USMB組、CBP組、CBP+US組、CBP+USMB組；其中CBP+USMB組早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率均最高，與其余各組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），CBP+US組與CBP組晚期凋亡率、總凋亡率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。CBP組早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率與對照組、US組、USMB組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。對照組、US組、USMB組早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 各組A549肺癌細(xì)胞凋亡率比較（） %

表1 各組A549肺癌細(xì)胞凋亡率比較（） %

與CBP+USMB組比較，#P＜0.01；與CBP+US組比較，*P＜0.01；與CBP組比較，△P＜0.01

組別對照組US組USMB組CBP組CBP+US組CBP+USMB組早期凋亡率0.45±0.11#*△0.56±0.23#*△0.65±0.26#*△1.84±0.08#1.82±0.42#3.39±0.92*△晚期凋亡率1.34±0.49#*△1.51±0.16#*△1.94±0.21#*△2.86±0.84#*5.69±0.36#△7.99±0.54*△總凋亡率1.79±0.59#*△2.07±0.10#*△2.59±0.28#*△4.70±0.90#*7.51±0.74#△11.39±0.54*△

討 論

含鉑類化療方案是肺癌治療的常用方法，如何促進(jìn)鉑類藥物于腫瘤靶區(qū)局部充分釋放、改善其在瘤區(qū)的分布、減少全身毒副作用成為當(dāng)前研究熱點［7］。Shen等［8］采用USMB聯(lián)合含鉑類化療方案治療3例晚期惡性腫瘤患者，發(fā)現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移瘤、腹壁轉(zhuǎn)移瘤直徑縮小，患者疼痛癥狀減輕。超聲靶向藥物遞送主要機(jī)制包括空化、聲孔效應(yīng)、聲輻射力、聲流；其中超聲空化為液體介質(zhì)中的氣體核（微泡）經(jīng)超聲波作用后發(fā)生振蕩、生長、破裂等一系列動力學(xué)過程。當(dāng)微泡在細(xì)胞附近振蕩時，對細(xì)胞產(chǎn)生的剪切力可誘導(dǎo)細(xì)胞膜瞬時穿孔，即聲孔效應(yīng)，為開放生物膜屏障提供暫時、可逆的時間窗，同時刺激細(xì)胞內(nèi)吞作用，促進(jìn)超聲輻照區(qū)細(xì)胞的藥物分子攝取。流體介質(zhì)中的聲輻射力及聲流通過產(chǎn)生壓力梯度，推動藥物粒子在聲波傳播方向的遞送［9-10］。各機(jī)制相互作用產(chǎn)生一系列化學(xué)和機(jī)械效應(yīng)，促進(jìn)化療藥物穿透生物膜屏障。本實驗旨在探討USMB在卡鉑化療A549肺癌細(xì)胞凋亡中的作用。

抵抗細(xì)胞死亡為癌癥的六大特征之一［11］，細(xì)胞凋亡屬于程序性細(xì)胞死亡。本實驗采用最適宜的超聲輻照參數(shù)與卡鉑劑量［6］聯(lián)合作用于A549肺癌細(xì)胞，結(jié)果顯示CBP+USMB組、CBP+US組總凋亡率與CBP組及其余各組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），表明USMB可協(xié)同卡鉑誘導(dǎo)A549肺癌細(xì)胞凋亡。其可能機(jī)制有：①USMB、超聲引發(fā)一系列化學(xué)效應(yīng)（如超聲、USMB與卡鉑可協(xié)同誘導(dǎo)A549肺癌細(xì)胞內(nèi)源性鈣釋放，鈣超載為A549肺癌細(xì)胞凋亡的可能機(jī)制［12］），誘導(dǎo)A549肺癌細(xì)胞凋亡；②超聲空化、聲孔效應(yīng)、聲輻射力、聲流等產(chǎn)生一系列機(jī)械效應(yīng)，作用于細(xì)胞膜屏障，增加了卡鉑藥物遞送效能；③化學(xué)效應(yīng)與機(jī)械效應(yīng)協(xié)同誘導(dǎo)A549肺癌細(xì)胞凋亡。本實驗中CBP+USMB組早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率均最高，與其余各組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01），原因可能為CBP+USMB組SonoVue微泡的物理特性使其成為理想空化核，降低了穩(wěn)態(tài)空化的閾值。在較低聲強(qiáng)下，微泡發(fā)生穩(wěn)態(tài)空化并形成微流，從而促進(jìn)微泡及粒子位移，對相鄰細(xì)胞產(chǎn)生剪切力，增加細(xì)胞膜通透性，增加卡鉑藥物遞送并協(xié)同誘導(dǎo)A549肺癌細(xì)胞凋亡。Cao等［13］研究發(fā)現(xiàn)USMB組AsPC-1胰腺癌細(xì)胞凋亡率增高，與US組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而本實驗中USMB組、US組、對照組早期凋亡率、晚期凋亡率、總凋亡率兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，原因可能為該超聲輻照條件下，USMB產(chǎn)生的空化效應(yīng)較微弱，無法直接誘導(dǎo)A549肺癌細(xì)胞凋亡。本實驗CBP+US組早期凋亡率與CBP組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但晚期凋亡率及總凋亡率比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）；而本課題組前期實驗［6］顯示兩組細(xì)胞存活率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，表明CBP+US組可抑制A549肺癌細(xì)胞活性，但未明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，未聯(lián)合微泡的CBP+US組產(chǎn)生的空化效應(yīng)及卡鉑藥物遞送效能較CBP+USMB組低，有待進(jìn)一步優(yōu)化參數(shù)以調(diào)控其誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡。

本實驗的局限性：僅使用流式細(xì)胞術(shù)檢測各組A549肺癌細(xì)胞凋亡率，實驗方法單一、數(shù)據(jù)不夠充分，今后將進(jìn)一步優(yōu)化超聲參數(shù)，進(jìn)行體外及動物實驗，檢測腫瘤凋亡信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平，探討超聲、USMB聯(lián)合化療藥物誘導(dǎo)腫瘤凋亡的分子機(jī)制、微泡聲學(xué)行為與促進(jìn)藥物遞送之間的關(guān)系，擬實現(xiàn)藥物的超聲控釋與局部靶向釋放。

綜上所述，USMB在卡鉑化療A549肺癌細(xì)胞凋亡中有協(xié)同作用。