童偉楊 路雪萍 羅文舉 錢佳璇 吳佳海，3，* 王小利，4，*

（1貴州大學生命科學學院/農(nóng)業(yè)生物工程研究院，山地植物資源保護與種質(zhì)創(chuàng)新教育部重點實驗室/貴州省農(nóng)業(yè)生物工程重點實驗室，貴州 貴陽 550025；2貴州大學動物科學學院草業(yè)科學系，貴州 貴陽 550025；3貴州省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽 550005；4貴州省農(nóng)業(yè)科學院草業(yè)研究所，貴州 貴陽 550006）

植物的成花轉(zhuǎn)變受到外界環(huán)境信號和植物體內(nèi)分子網(wǎng)絡(luò)的共同調(diào)節(jié)，具有多種調(diào)控途徑，其中光周期途徑作為一條重要途徑，通過感知外界日照長度調(diào)控植物成花［1］。關(guān)于擬南芥的研究發(fā)現(xiàn)，CO（CONSTANS）是調(diào)控成花的關(guān)鍵基因，該基因編碼一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，可以促進FT（FLOWERING LOCUS T）的表達，進而促使植物成花［2］。生物鐘是植物感知日照長度變化并依此調(diào)節(jié)自身節(jié)律的內(nèi)在生理機制，其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)由輸入途徑、輸出途徑、維持自身節(jié)律的中央振蕩器三部分組成［3］。生物鐘可以依賴外界光信號的輸入來實現(xiàn)與外界光環(huán)境的同步變化，其中GI（GIGANTEA）是調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的重要基因［4-5］。GI基因位于CO和FT基因的上游，能通過調(diào)控CO和FT的表達來調(diào)控植物成花，在控制生理節(jié)律和調(diào)控植物開花的過程中具有重要意義［6-9］。GI突變體在1962年首次被描述為晚花表型［10］，Suárez-López 等［11］最先在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了在長日照下促進植物成花的GI-CO-FT調(diào)控路徑，GI的表達受到植物生物鐘的調(diào)控。CCA1（CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED 1）作為生物鐘的關(guān)鍵基因，其轉(zhuǎn)錄翻譯的CCA1 蛋白可以結(jié)合到GI的啟動子上，從而降低GI的表達［12-13］，當CCA1的表達受到抑制時，GI的mRNA在白晝中期積累。ELF3（early flowering 3）最早確定為擬南芥開花的負調(diào)控因子，負責將環(huán)境的光信號傳遞入生物鐘的中央振蕩器中，從而調(diào)節(jié)下游的各種生理過程［14］。當處于連續(xù)光照條件下時，elf3突變體中GI基因轉(zhuǎn)錄水平節(jié)律消失，表明ELF3蛋白質(zhì)可能具有調(diào)控GI基因的轉(zhuǎn)錄節(jié)律性的功能［7］。

植物GI基因有調(diào)節(jié)生物鐘與調(diào)控開花時間兩大功能。但是目前有關(guān)GI同源基因的作用機制研究主要集中在常規(guī)的模式植物擬南芥［Arabidopsis thaliana（L.）Heynh］上［15］，GI在禾本科植物的農(nóng)學性狀如分蘗、穗分化等的作用機制有待進一步研究。二穗短柄草［Brachypodium distachyon（L.） Beauv.］作為一種新型模式植物，其功能基因的挖掘有待完善。為明確GI基因在二穗短柄草晝夜節(jié)律調(diào)控與光周期開花應(yīng)答中的分子作用機制，本研究以二穗短柄草為試驗材料，利用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRTPCR）技術(shù)檢測BdGI在不同日照長度和不同生長發(fā)育狀態(tài)下的表達節(jié)律，應(yīng)用酵母雙雜交、雙分子熒光互補和免疫共沉淀技術(shù)驗證BdGI和ZTL 蛋白互作的真實性，以期為進一步探討B(tài)dGI的功能作用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

二穗短柄草（Brachypodiam distachyon）Bd21，由四川農(nóng)業(yè)大學饋贈。

主要試劑：Axyprep RNA 提取試劑盒，美國Axygen；GoScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國Promega。

主要儀器：RXZ型人工智能氣候箱，寧波江南儀器廠；實時熒光定量PCR儀，德國Eppeddorf。

1.2 試驗方法

1.2.1 二穗短柄草的種植和光照處理 提前將營養(yǎng)土與蛭石按1∶1比例混合裝盆并加水浸濕。挑選飽滿的Bd21種子均勻撒在花盆中，表面覆少許蛭石，放置于人工智能光照培養(yǎng)箱中，給予不同的光照處理并定期澆水管理。長日照（long day，LD）處理條件：溫度22 ℃、相對濕度60%、光照16 h/黑暗8 h、光照強度5 400 lx；短日照（short day，SD）處理條件：溫度22 ℃、相對濕度60%、光照8 h/黑暗16 h、光照強度5 400 lx，隨后轉(zhuǎn)入全光照/全黑暗處理。

1.2.2 二穗短柄草BdGI基因的表達分析 取不同光照處理下的二穗短柄草葉片，每次取樣間隔4 h，連續(xù)取樣24 h，每次取靠近植株頂端的3 片葉，混合備用。在長日照條件下，對處于不同生長時期的二穗短柄草取樣，取樣方式同上。取樣時間安排如表1。取樣后將葉片置于液氮速凍后置于-80 ℃冰箱備用。

表1 取樣時間列表Table 1 Sampling time list

使用Axyprep RNA 提取試劑盒提取總RNA，用GoScriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。cDNA 合成反應(yīng)結(jié)束后稀釋4 倍用于qRT-PCR 檢測，以泛素結(jié)合酶基因（ubiquitin-conjugating enzyme gene）為內(nèi)參基因（BdUBC18），反應(yīng)體系共20 μL：GoTaq?qPCR Master Mix 10 μL，10 μmol·L-1引物上下游各0.3 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O 7.4 μL，引物信息見表2。反應(yīng)程序：96 ℃預(yù)變性6 min，96 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共45個循環(huán)。每個樣品3次技術(shù)重復，3次生物學重復，用2-ΔΔCT方法分析數(shù)據(jù)。

表2 引物列表Table 2 Primer list

1.2.3 GI 與ZTL 酵母雙雜交試驗 首先構(gòu)建GIpGADT7 和ZTL-pGBKT7 載體，隨后準備好酵母感受態(tài)細胞（LiAC Method），將構(gòu)建好的載體與酵母感受態(tài)細胞共轉(zhuǎn)化，得到酵母菌株Y2H gold 后，以0.9% NaCl懸浮酵母細胞，將菌液涂布于SD/-Leu/-Trp培養(yǎng)基上，待其長出克隆后，將其挑選到SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)3～5 d 后，將長出的克隆挑到含有X-α-Gal的四缺培養(yǎng)基上，觀察酵母生長情況。

1.2.4 免疫共沉淀檢測 采用免疫共沉淀法驗證蛋白之間存在相互作用。構(gòu)建pUC-SPYNE-GI與pSPYCE-35S-ZTL 目的質(zhì)粒，將目的基因構(gòu)建至載體上，測序驗證，抽提質(zhì)粒備用。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞GV3101中，并將其制備成浸提液，注射入煙草葉片中。

光照處理48 h 后收集葉片，使用0.5 mL 預(yù)冷的RIPA 裂解液（RIPA Lysis Buffer）使細胞裂解提取總蛋白，用磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）將總蛋白稀釋到約1 μg·μL-1，使用Pierce Magnetic HA-Tag IP/Co-IP Kit（貨號88838）和Pierce Magnetic MYC-Tag IP/Co-IP Kit（貨號88844）試劑盒，按照說明書進行免疫共沉淀試驗。

上述步驟洗脫后得到的樣品進行非變性聚丙烯酰胺凝膠（Native-PAGE）電泳，使用DYCZ-40D 型迷你轉(zhuǎn)印電泳儀進行轉(zhuǎn)膜（北京六一生物科技有限公司），轉(zhuǎn)膜電流為200 mA，轉(zhuǎn)膜時間為2 h。

上述樣品用5%的脫脂奶粉進行封閉。加入1∶1 000稀釋的IP專用熒光標記一抗（DyLight 488標記的HA一抗（貨號ABIN1113144）；Alexa Fluor 647標記的MYC一抗（貨號ABIN6915479），于室溫下封閉1 h，TBST（TBS+Tween）洗滌3 次，每次5 min。最后用ChemiDoc?XRS+凝膠成像系統(tǒng)（Bio-rad，美國）成像。

1.2.5 雙分子熒光互補驗證 構(gòu)建pUC-SPYNE-GI與pSPYCE-35S-ZTL 目的質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101中，在LB培養(yǎng)基中加入100 μg·mL-1利福平（農(nóng)桿菌株GV3101 攜帶抗性）、200 μg·mL-1氨芐霉素（載體攜帶抗性）篩選培養(yǎng)，將攜帶表達載體的菌株制成侵染液，注入煙草細胞，繼續(xù)培養(yǎng)72 h 后，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 長日照和短日照下BdGI基因的表達變化

由圖1-A可知，在短日照（SD）處理下，從ZT0時間點（8：00）開始直至ZT8時間點（16：00），BdGI基因的表達量逐漸增大并在ZT8 達到最大值，在進入黑暗處理后BdGI表達量不斷下降，并在ZT24 時間點（次日8：00）的表達量與ZT0近乎一致。由圖1-B可知，長日照（LD）處理下，在ZT0～ZT8，BdGI的表達模式與短日照處理下的表達模式相似，并在ZT8 時間點到達峰值，隨后BdGI表達量呈現(xiàn)下降趨勢，在ZT24 表達量恢復至與ZT0一致。由圖1可知，光照會影響到BdGI的表達，不同的光照處理其表達模式不同，但都體現(xiàn)出了BdGI的表達具有一定的晝夜節(jié)律性。

圖1 短日照（A）和長日照（B）下BdGI基因的相對表達Fig.1 The relative expression of BdGI gene under short-day （A） and long-day （B）

2.2 長日照和短日照分別轉(zhuǎn)全光照、全黑暗下BdGI的表達變化

24 h 內(nèi)長日照轉(zhuǎn)全光照［（LD-light-light（LL）］BdGI的表達量變化趨勢與長日照（LD）基本相似，BdGI的表達峰值均在ZT8時間點（16：00）時，隨后逐漸降低（圖2-A）；長日照轉(zhuǎn)全黑暗處理［LD-dark-dark（DD）］，初始時，BdGI的表達量最高，隨著黑暗處理，其表達量開始下降，直至ZT16 時間點（24：00）時表達量幾乎檢測不到，隨后表達量逐漸升高（圖2-C）；短日照轉(zhuǎn)全光照處理（SD-LL），BdGI的表達量逐漸下降至ZT4時間點（12：00）后逐漸升高，至ZT8 達到最高，隨后開始逐漸下降（圖2-B）；短日照轉(zhuǎn)全黑暗處理（SD-DD），ZT0～ZT12（8：00～20：00）這一階段BdGI的表達量逐漸升高，即ZT12時，BdGI的表達量達到最高峰，隨后從ZT12～ZT20（20：00～次日4：00）這一階段開始逐漸下降，到ZT20～ZT24（次日4：00～次日8：00）其表達量幾乎檢測不到（圖2-D）。

圖2 全光照和全黑暗下BdGI基因的相對表達量Fig.2 BdGI gene relative expression under aways light and darkness

2.3 不同發(fā)育階段BdGI的表達變化

取長日照下幼苗期、分蘗期、孕穗期和抽穗期4個時期的二穗短柄草葉片，qRT-PCR結(jié)果如圖3所示。不同發(fā)育階段BdGI的表達量變化趨勢相似，均為先升后降，不同的是不同發(fā)育階段BdGI的表達量峰值所處時間點不同，其中幼苗期與分蘗期均在ZT12 時間點（20：00）表達量到達峰值（圖3-A、B）；而分抽穗期與在孕穗期ZT8時間點（12：00）表達量到達峰值（圖3-C、D）。

圖3 不同發(fā)育階段BdGI基因的相對表達量Fig.3 Relative expression of BdGI gene at different stages of development

2.4 酵母雙雜交

酵母雙雜交結(jié)果如圖4 所示，陽性對照BD-P53/AD-T、陰性對照BD-lam/AD-T、自激活BD-ZTL/AD、試驗組BD-ZTL/AD-GI 在二缺培養(yǎng)基（-LW：SD/-Leu/-Trp培養(yǎng)基）上都長出了克隆，說明轉(zhuǎn)化成功。將SD/-Leu/-Trp培養(yǎng)基上的克隆挑取至SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平皿和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp（X-α-Gal）培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，除了共轉(zhuǎn)化陽性對照質(zhì)粒的菌株正常長出克隆和變藍外，試驗組BD-ZTL/AD-GI也可正常長出克隆及變藍，說明BdZTL和BdGI有潛在蛋白互作關(guān)系。

圖4 GI與ZTL的雙雜交驗證結(jié)果Fig.4 Yeast two-hybrid validation results of GI and ZTL

2.5 免疫共沉淀

免疫共沉淀（co-immunoprecipitation）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)，研究兩種蛋白在細胞內(nèi)是否存在相互作用的常用方法，若二者有相互作用，則會沉淀出相應(yīng)的條帶。由圖5可知，陽性對照IB：HA未能檢測到條帶，IB：MYC 檢測到條帶，說明GI-MYC 存在于陽性對照組Input中，表明細胞裂解液中存在目的蛋白，提取蛋白試驗無誤。Co-IP樣品IP-HA兩條膠均未檢測出條帶，說明IB：HA 與IB：MYC 均不能使HA 沉淀。Co-IP 樣品IP-MYC 第一條膠未能檢測到條帶，IB：MYC檢測到條帶，說明IB：HA不能使GI-MYC沉淀，而IB：MYC能使GI-MYC 沉淀。由圖6 可知，相應(yīng)陽性對照檢測到條帶，說明ZTL-HA 與GI-MYC 均存在于陽性對照Input 中，證明目的蛋白存在。Co-IP 樣品沉淀物用IB：HA 和IB：MYC 均可檢測到蛋白條帶，根據(jù)圖5 可知HA 不能使GI-MYC 沉淀，能使ZTL-HA 沉淀，而IB：MYC 能使GI-MYC 沉淀，不能使ZTL-HA 沉淀。所以僅在GI蛋白和ZTL蛋白存在相互作用，且兩者帶著MYC 與HA 標簽才能均被IB：HA與IB：MYC沉淀。利用IgG組進行沉淀試驗，GI蛋白和ZTL蛋白未沉淀，排除蛋白與抗體非特異性結(jié)合的可能性。綜上，BdGI與BdZTL之間存在相互作用。

圖5 BdGI與BdZTL免疫共沉淀試驗結(jié)果（對照組）Fig.5 Co-immunoprecipitation results of BdGI and BdZTL（control group）

圖6 BdGI與BdZTL免疫共沉淀試驗結(jié)果（試驗組）Fig.6 Co-immunoprecipitation results of BdGI and BdZTL（experimental group）

2.6 雙分子熒光互補驗證

在酵母雙雜試驗中，試驗組在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp 平皿和SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp（X-α-Gal）培養(yǎng)基中可以正?？寺∏易?yōu)樗{色；在免疫共沉淀試驗中，只有試驗組才能沉淀出蛋白條帶，說明BdGI 蛋白與BdZTL蛋白有潛在的互作關(guān)系。為了進一步驗證其互作關(guān)系的真實性，本研究進行了雙分子熒光互補試驗，結(jié)果如圖7所示。在激光共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)試驗組BdZTLnYFP/BdGI-cYFP 在細胞核中有黃色熒光信號；陰性對照BdGI-nYFP/35S-cYFP和35S-nYFP/ BdZTL-cYFP未能檢測到黃色熒光信號。以上結(jié)果說明，BdZTL 和BdGI 可在細胞核內(nèi)發(fā)生相互作用，且結(jié)果與酵母雙雜交的結(jié)果相符，即BdGI與BdZTL存在相互作用。

圖7 BdGI與BdZTL的雙分子熒光互補試驗結(jié)果Fig.7 Bilolecular fluorescence complementary experimental results of BdGI and BdZTL

3 討論

基因在生物體內(nèi)表達受一定時間與空間的影響，從而表達出特異性，不同的表達模式顯示出不同的功能。前人研究表明，在擬南芥中，GI能夠調(diào)控植物開花，同時也參與調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律［16］，且在不同日照條件下，擬南芥GI表達量存在差異。本研究利用qRT-PCR檢測BdGI不同光照處理下的表達模式，發(fā)現(xiàn)24 h 內(nèi)在開燈后即能檢測到BdGI的表達，BdGI在LD 和SD 下的表達峰值均出現(xiàn)在ZT8，即下午4∶00 左右，表明BdGI的表達具有一定的晝夜節(jié)律性，并且與擬南芥在長日照處理下相比，BdGI表達峰值出現(xiàn)的時間有所提前。值得注意的是，BdGI在不同光照條件下表達量的變化速率也存在不同，當處于長日照條件時，BdGI表達量在到達峰值后下降速度較慢，而短日照下降速度較快，說明BdGI受光照的影響且具有一定的自我調(diào)節(jié)能力以應(yīng)對光照的變化。這一結(jié)果與小麥中的GI基因表達模式基本相似［17］，僅在不同的植物內(nèi)表達峰值出現(xiàn)的時間不同。采用連續(xù)光照的方式處理植株后，BdGI表達高峰出現(xiàn)的時間未發(fā)生改變，而長日照與短日照轉(zhuǎn)全黑暗處理下BdGI的表達模式呈現(xiàn)不同的趨勢。從長日照轉(zhuǎn)全黑暗處理結(jié)果可以看出，長日照下BdGI表達量積累較多，短日照下BdGI表達量積累較少，而在黑暗時期BdGI表達量逐漸增加到達峰值，隨后降低，表現(xiàn)出BdGI的表達受光周期調(diào)控，這與大豆［Glycine max（Linn.）Merr.］CmGI在光照轉(zhuǎn)黑暗下的表達模式相似［18］。本研究還發(fā)現(xiàn)，不同發(fā)育階段BdGI的表達量變化趨勢大致相同，僅不同發(fā)育階段下BdGI的表達量峰值所處時間點不同，其中幼苗期與分蘗期均在ZT12點表達量達到峰值，而抽穗期與在孕穗期在ZT8 點表達量達到峰值。值得注意的是，抽穗期的表達峰值最高，由此猜測二穗短柄草BdGI在抽穗期能發(fā)揮重要的作用。

GI 的表達受到生物鐘的調(diào)控，生物鐘的形成過程中有多種蛋白參與，通過轉(zhuǎn)錄和翻譯后的調(diào)控作用，形成復雜的負反饋調(diào)節(jié)系統(tǒng)［19］，其中CCA1、LHY（LATE ELONGATED HYPOCOTYL）和TOC1（TIMING OF CAB EXPRESSION 1）被認為是植物生物鐘振蕩器的核心元件，其調(diào)控方式為：早晨元件LHY和CCA1抑制TOC1的轉(zhuǎn)錄，晚間元件TOC1下調(diào)LHY/CCA1的積累［20-22］。ZTL屬于F-box家族蛋白，其家族成員還包括FKF1（Flavin-binding，Kelch repeat，F(xiàn)-box1）、LKP2（LOV kelch protein2）［23-27］，且都具有LOV結(jié)構(gòu)域、F-box結(jié)構(gòu)域、Kelch重復序列3個結(jié)構(gòu)域［28］，具有區(qū)分日照長度和控制光信號輸入的能力［20，29］。ZTL mRNA 的積累不受生物鐘的調(diào)控［23］，但是ZTL 蛋白水平呈現(xiàn)出周期性節(jié)律變化，并在夜晚時其蛋白含量達到峰值［25］，這與GI表達的晝夜節(jié)律高度同步，因此推測GI 蛋白與ZTL 蛋白存在某種相互作用，使得其表達模式基本一致。藍光條件下，擬南芥中ZTL蛋白會與GI蛋白相互作用，起到穩(wěn)定ZTL 蛋白的作用［24］，同時解除ZTL 對TOC1 的抑制作用。傍晚過后LOV 功能域?qū)λ{光的應(yīng)答消失，ZTL 蛋白從GI 解離，靶向介導TOC1 的降解［24-27］。本研究通過酵母雙雜、雙分子熒光互補、免疫共沉淀等方式證實了二穗短柄草中BdGI蛋白與BdZTL 蛋白也存在相互作用，與擬南芥中的研究結(jié)果相符。對模式植物擬南芥研究發(fā)現(xiàn)，長日照條件下FKF1 蛋白和GI 蛋白的表達受生物鐘的調(diào)控，當FKF1 響應(yīng)藍光應(yīng)答，與GI蛋白發(fā)生相互作用時，光誘導產(chǎn)生的FKF1-GI 蛋白復合體會在長日照的下午積累到高水平，降解CO啟動子上的CDF1 蛋白，解除對CO的抑制作用［30-33］。CO的表達上調(diào)確保了其靶標基因FT的表達；FT 蛋白可移動到莖的分生組織中，然后啟動開花轉(zhuǎn)變轉(zhuǎn)錄調(diào)控級聯(lián)控制［34-36］，進而促使植物成花。故推測二穗短柄草中BdGI 蛋白可能與BdZTL 共同調(diào)控TOC1表達，調(diào)控方式與FKF1/GI蛋白復合體的調(diào)控方式相似。

本研究利用酵母雙雜篩選檢測到BdGI 可能與BdZTL 有潛在的互作關(guān)系，由于酵母雙雜交試驗并非對所有蛋白都適用，而且出現(xiàn)假陽性可能性較大，所以再次利用雙分子熒光互補方法與免疫共沉淀法檢測進行驗證，結(jié)果顯示BdGI與BdZTL 存在互作關(guān)系。但對于BdGI 在光周期調(diào)控開花及穩(wěn)定晝夜節(jié)律過程中行使何種職能；BdGI 與BdZTL 的相互作用如何調(diào)控下游基因的表達仍需進一步探索。

4 結(jié)論

本次研究利用qRT-PCR 技術(shù)分析了BdGI在不同光照處理下和長日照的不同發(fā)育階段中的表達情況，結(jié)果表明BdGI的表達具有一定的晝夜節(jié)律并受光周期的調(diào)控；通過酵母雙雜篩選出BdGI 的互作蛋白BdZTL，并通過雙分子熒光互補與免疫共沉淀驗證了BdGI與BdZTL互作的真實性。