馬 超 宋 鵬 尚申申 楊夏夏 楊金華 韓群威 李記民 馮雅嵐
(河南科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/河南省旱地農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心,河南 洛陽 471023)
生長(zhǎng)調(diào)控因子(growth-regulating factors, GRFs)是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族,其在植物生長(zhǎng)發(fā)育過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用[1],如參與葉片細(xì)胞大小[2]和數(shù)量的調(diào)控[3]、分生組織的生長(zhǎng)和維持[4]、花的發(fā)育[5]和花期調(diào)控[6]、種子[7]和根的發(fā)育[8]、植物壽命[4]以及對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)[9-10]等。 隨著基因組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,多種植物的GRFs基因家族已被鑒定,包括玉米、油菜、梨等[11]。 研究表明,GRFs基因家族含有2個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域:復(fù)雜芳香疏水性氨基酸QLQ(谷氨酸、亮氨酸、谷氨酸)結(jié)構(gòu)域和WRC(色氨酸、精氨酸、半胱氨酸)結(jié)構(gòu)域[11]。 前者是重要的蛋白互作區(qū)域,如擬南芥該保守區(qū)域可與GIF(GRF-interacting factor)蛋白發(fā)生互作從而行使轉(zhuǎn)錄激活作用[12];后者含有的C3H 鋅指結(jié)構(gòu),能夠引導(dǎo)GRF 蛋白入核并結(jié)合其靶基因[13]。 QLQ 和WRC 結(jié)構(gòu)域都位于GRF 蛋白序列的N 端,前者在所有真核生物中都有存在,而后者是植物特有的,一些物種個(gè)別GRF 蛋白成員可能缺少Q(mào)LQ或WRC 結(jié)構(gòu)域[13]。
二穗短柄草(Brachypodium distachyon)是原產(chǎn)于非洲北部、歐洲南部和亞洲中部的一種適應(yīng)冷涼氣候的一年生禾本科植物[14]。 二穗短柄草與普通小麥、大麥、燕麥等麥類作物同屬于早熟禾亞科,其形態(tài)、生理特征及基因組等特點(diǎn)都十分相似;另外,由于二穗短柄草具有株型較小,可實(shí)現(xiàn)在溫室內(nèi)大量的種植,生命周期較短,嚴(yán)格的自花授粉,易于遺傳轉(zhuǎn)化等特點(diǎn),使其具有與擬南芥相似的模式植物特點(diǎn)[15-16]。 二穗短柄草自交系Bd-21 的基因組測(cè)序已于2010 年完成,二穗短柄草基因組小、染色體少,且DNA 重復(fù)序列少,也佐證了其具有作為模式植物的基本特性[17]。 水稻作為單子葉植物的典型模式植物,其相關(guān)研究取得了迅猛發(fā)展,但是水稻的原始生境處于熱帶、亞熱帶。 對(duì)于像小麥、大麥等生活在冷涼氣候、需要春化過程的麥類作物來說,水稻并不是理想的模式植物,而二穗短柄草在親緣關(guān)系上與小麥、大麥、燕麥等糧食作物更近;同時(shí),水稻植株較大且生育期較長(zhǎng)[18-19]。 基于以上特點(diǎn),Draper 等[20]首次建議將二穗短柄草作為禾本科植物功能基因組學(xué)研究的模式植物。
本研究利用NCBI 數(shù)據(jù)庫首次對(duì)二穗短柄草12個(gè)GRFs基因家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系和基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,通過RT-qPCR 的方法對(duì)GRFs基因家族成員的表達(dá)模式進(jìn)行研究,旨在為進(jìn)一步了解二穗短柄草中GRFs家族成員基因功能提供理論基礎(chǔ)。
以二穗短柄草Bd-21 為試驗(yàn)材料,在濕潤(rùn)的濾紙上催芽1 d 后轉(zhuǎn)入4℃冰箱春化8 d,然后種植于營(yíng)養(yǎng)缽內(nèi)。 在灌漿期分別取根、莖、老葉、新葉、幼穗、籽粒6 個(gè)不同組織用于基因表達(dá)定量分析。 于五葉期進(jìn)行外源激素處理,分別施用生長(zhǎng)素(auxin,IAA) 10 μmol·L-1, 脫落酸(abscisic acid,ABA)50 μmol·L-1、赤霉素(gibberellin,GA3) 50 μmol·L-1、細(xì) 胞 分裂素( cytokinin, 6-BA) 10 μmol·L-1、 油菜素內(nèi)酯(brassinolide,BR)10 μmol·L-1,噴施12 h 后取葉片為樣品,液氮速凍后-80℃超低溫冰箱保存待測(cè)。
利用 Plant Transcription Factor Database v4.0(http:/ /planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)對(duì)二穗短柄草和擬南芥中GRFs基因家族進(jìn)行篩選;利用Pfam 31.0 數(shù)據(jù)庫(http:/ /pfam.xfam.org/)對(duì)篩選到的GRFs基因家族進(jìn)行結(jié)構(gòu)域確定并去除冗余基因[21];利用Phytozome v12.1(http:/ /www.phytozome.net/)和TAIR(http:/ /www.arabidopsis. org/)數(shù)據(jù)庫確定二穗短柄草與擬南芥GRFs基因家族在染色體上的位置信息;利用Circos 0.6 軟建構(gòu)建GRFs基因家族的染色體分布圖譜[22];利用在線軟件ProtParam(https:/ /web. expasy. org/protparam/)和Sopma(http:/ /npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl? page =/NPSA/npsa_h(yuǎn)nn.html)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì);利用蛋白質(zhì)保守基序在線搜索軟件MEME(http:/ /meme.nbcr.net/)分析GRFs基因家族保守結(jié)構(gòu)域的特征;利用DNAMAN version 6.0 對(duì)序列保守性進(jìn)行分析。
將篩選完成的二穗短柄草、擬南芥、水稻、玉米和谷子GRFs 家族成員氨基酸全序列另存為FASTA 格式,利用MEGA5.05(http:/ /www.mega-software.net/)進(jìn)行序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建,bootstrap 值設(shè)定為1 000[23]。
根據(jù)二穗短柄草GRFs基因家族序列信息設(shè)計(jì)特異引物,由北京華大基因公司合成。 Total RNA 的提取采用Trizon 法,cDNA 第一鏈的合成使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒,Real-time PCR 使用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒,均購自寶生物工程有限公司。 反應(yīng)總體積20 μL,包含10 μL SYBR premix Ex Taq (2×)、1 μL cDNA(稀釋5 倍)、上下游引物各0.4 μL(10 μmol·L-1),8.2 μL ddH2O。 反應(yīng)程序?yàn)槎椒?95℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s,60℃退火30 s,40個(gè)循環(huán);在復(fù)性時(shí)采集熒光信號(hào),重復(fù)3 次。 以UBC18為內(nèi)參基因,采用2-ΔΔCT法[24]計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。
通過Plant Transcription Factor Database (http:/ /planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)獲取二穗短柄草與擬南芥GRFs候選基因,對(duì)這些候選基因結(jié)構(gòu)域進(jìn)行比對(duì),最終確定到12 個(gè)二穗短柄草GRFs基因、9 個(gè)擬南芥GRFs基因。 為了確定GRFs基因在染色體上的分布特點(diǎn),構(gòu)建了二穗短柄草、擬南芥GRFs基因在染色體上的分布圖(圖1)。 其中12 個(gè)二穗短柄草GRFs基因(圖1 灰色部分)分布在二穗短柄草5 條染色體上;9個(gè)擬南芥GRFs基因(圖1 黑色部分)分布在擬南芥4條染色體上(擬南芥at01 染色體上無GRFs基因分布)。 在二穗短柄草中,bd01 號(hào)染色體上分布最多,有5 個(gè)GRFs基因,bd02 和bd04 號(hào)染色體上分布最少,都只有1 個(gè)GRFs基因;而在擬南芥中,在at02 號(hào)染色體上分布最多,有4 個(gè)GRFs基因,在at05 號(hào)染色體上分布最少,只有1 個(gè)GRFs基因。 上述結(jié)果表明,GRFs基因在2 種植物不同染色體上的分布是不均勻的,在同一染色體上的位置分布也是不均勻的。
由表1 可知,二穗短柄草GRFs家族成員編碼序列(coding sequence, CDS)長(zhǎng)度為645~1 734 bp,編碼蛋白長(zhǎng)度為238~577 aa,分子量為25.44~61.64 kDa,等電點(diǎn)(pI)為4.81~10.57;GRF3、GRF6 和GRF9 由4個(gè)外顯子組成,GRF4、GRF5 和GRF8 由5 個(gè)外顯子組成,其他家族成員均由3 個(gè)外顯子組成;亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果表明,二穗短柄草GRFs 家族蛋白均定位于細(xì)胞核,具有轉(zhuǎn)錄因子的一般特性。
圖1 二穗短柄草和擬南芥GRFs 直系同源基因關(guān)系分布圖Fig.1 The distribution diagram of GRFs orthologous genes between Brachypodium distachyon and Arabidopsis thaliana
表1 二穗短柄草GRFs 基因家族成員理化性質(zhì)Table 1 The physic-chemical characters of bdGRFs gene family in Brachypodium distachyon
GRFs 家族是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子家族,其典型特征是含有保守的DNA 結(jié)合域。 GRFs 家族成員包含2 個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域,QLQ 結(jié)構(gòu)域位于GRFs 蛋白的N 端,含有18~26 個(gè)α 螺旋,1 ~4 個(gè)β 轉(zhuǎn)角,6 ~15 個(gè)無規(guī)則卷曲和2 ~7 個(gè)延伸鏈;另一個(gè)WRC 結(jié)構(gòu)域也位于GRFs 蛋白的N 端,含有4~15 個(gè)α 螺旋,0 ~6 個(gè)β 轉(zhuǎn)角,29 ~40 個(gè)無規(guī)則卷曲和0 ~11 個(gè)延伸鏈(表2),而WRC 結(jié)構(gòu)域能夠與C3H 基序結(jié)合,該區(qū)域是DNA 結(jié)合域并能引導(dǎo)該蛋白入核行使轉(zhuǎn)錄因子的功能。 由圖2 可知,12 個(gè)二穗短柄草GRFs 蛋白都具有保守的QLQ 和WRC 結(jié)構(gòu)域,2 個(gè)結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基分別為34 ~36 個(gè)(最少的是BdGRF2 ~5,最多的是BdGRF1、BdGRF6 ~9、BdGRF11-1 和BdGRF11-2)和49~66 個(gè)(最少的是BdGRF4,最多的是BdGRF2)。
表2 二穗短柄草QLQ 結(jié)構(gòu)域和WRC 結(jié)構(gòu)域二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Table 2 The Secondary structure prediction of QLQ and WRC domains in Brachypodium distachyon
圖2 二穗短柄草GRFs 蛋白序列的多重序列比對(duì)Fig.2 The multiple sequence alignment of GRFs proteins in Brachypodium distachyon and Arabidopsis thaliana
為了比較二穗短柄草等主要單子葉植物和擬南芥(雙子葉植物)GRFs 蛋白家族的進(jìn)化關(guān)系,以二穗短柄草、水稻、玉米、谷子和擬南芥GRFs 氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。 由圖3 可知,5 個(gè)物種中GRFs 蛋白家族成員可以聚類為8 個(gè)主要的進(jìn)化分支。 以最小分支樹中的基因?yàn)橹毕低椿騕25],進(jìn)一步分析了5 個(gè)物種中系統(tǒng)發(fā)育樹的8 個(gè)進(jìn)化分支的關(guān)系。 具有直系同源關(guān)系的基因共有23 組,含有二穗短柄草的共有9組,其中與水稻直系同源的家族成員數(shù)量有4 個(gè),與谷子和擬南芥直系同源的家族數(shù)量均是2 個(gè)。
圖3 二穗短柄草、擬南芥、水稻、玉米和谷子GRFs 蛋白家族系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree of GRFs protein family among Brachypodium distachyon,Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Zea mays and Setaria italica
二穗短柄草GRFs 蛋白家族系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,GRFs 蛋白家族分為5 類:Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ,并且存在4 對(duì)直系同源基因。 通過MEME 在線軟件對(duì)二穗短柄草12 個(gè)GRF 蛋白的保守基序進(jìn)行分析(圖4),結(jié)果表明,12 個(gè)GRF 蛋白具有9 個(gè)保守基序。 進(jìn)一步分析了9 個(gè)保守基序在二穗短柄草GRFs 蛋白中的分布情況,GRF9 包含全部9 個(gè)保守基序;其他8 個(gè)GRF 蛋白中都存在不同保守基序的缺失,每個(gè)蛋白包含保守基序的數(shù)量在2 ~6 個(gè)之間,其中GRF11-1、GRF11-2、GRF10 和GRF12 保守基序缺失最多,只包含2 個(gè)保守基序;另外,有2個(gè)保守基序(Motif 3 和Motif 4)在所有二穗短柄草GRFs 蛋白中都是完全保守的。
通過SMART 網(wǎng)站提取了二穗短柄草與擬南芥GRFs 蛋白家族中所包含的QLQ 和WRC 保守結(jié)構(gòu)域。在二穗短柄草中得到12 個(gè)QLQ 和WRC 保守結(jié)構(gòu)域,而在擬南芥中得到9 個(gè)。 對(duì)QLQ 和WRC 結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了保守區(qū)域的分析,二穗短柄草中12 個(gè)QLQ 結(jié)構(gòu)域
相似度為20.5%,一致序列為T(x)Q(x)EL(x)Q(x)Y(x)P(x)L,擬南芥中9 個(gè)QLQ 結(jié)構(gòu)域相似度為20.6%,一致序列為Q(x)E(x)Q(x)Y(x)VP(x)L(圖5-A);二穗短柄草中12 個(gè)WRC 結(jié)構(gòu)域相似度為40.0%,一致序列為P(x)RCRRTDGKKWRC(x)KYC(x)H(x)R(x)R(x)Ⅴ,擬南芥中9 個(gè)WRC 結(jié)構(gòu)域相似度為37.5%,一致序列為EP(x)RC(x)RTDGKK WRC(x)KYC(x)H(x)R(圖5-B)。 通過比較二穗短柄草和擬南芥中QLQ 和WRC 結(jié)構(gòu)域發(fā)現(xiàn),在2 個(gè)物種之間WRC 結(jié)構(gòu)域在氨基酸長(zhǎng)度和序列上均有較好的一致性,而QLQ 結(jié)構(gòu)域存在較大的差異。
圖4 二穗短柄草GRFs 蛋白家族的保守基序分布Fig.4 Distribution of conserved motifs of GRFs protein family in Brachypodium distachyon
圖5 二穗短柄草GRFs 蛋白家族保守結(jié)構(gòu)域分析Fig.5 Analysis of conserved domains of GRFs protein family in Brachypodium distachyon
為了分析二穗短柄草GRFs基因家族在不同組織器官中的表達(dá)特征,利用RT-qPCR 技術(shù)分析了12 個(gè)GRFs家族成員在根、莖、老葉、新葉、幼穗和籽粒的表達(dá)模式。 結(jié)果發(fā)現(xiàn),所有GRFs家族成員在幼穗中表達(dá)量最高,而在根中表達(dá)量最低,其中差別最大的是GRF2(23.3 倍),差別最小的是GRF6(3.89 倍),新葉的表達(dá)量普遍高于老葉(1.2 ~3.0 倍),在籽粒中表達(dá)量也較高。GRFs家族成員在幼嫩組織(特別是在幼穗中)表達(dá)豐度較高,說明GRFs家族成員在不同器官的生長(zhǎng)和發(fā)育中的作用是不同的。
圖6 二穗短柄草GRFs 基因家族的組織表達(dá)模式分析Fig.6 Expression analysis of GRFs family members of Brachypodium distachyon in different tissues
由圖7 可知,幾乎所有的GRFs家族成員均對(duì)外源激素產(chǎn)生了響應(yīng)。 依次有2、3、6、6 和2 個(gè)GRFs家族成員分別對(duì)外源IAA、ABA、GA3、6-BA 和BR 發(fā)生2倍以上的上調(diào)響應(yīng)。 外源IAA 顯著促進(jìn)了7 個(gè)GRFs家族成員的上調(diào)表達(dá),5 個(gè)GRFs家族成員顯著下調(diào)表達(dá),其中,上調(diào)表達(dá)差異倍數(shù)最大的是BdGRF1(2.4倍),其次為BdGRF3(2.3 倍),而下調(diào)倍數(shù)最高的是BdGRF10(0.2 倍)。 外源ABA 僅對(duì)BdGRF11-1 產(chǎn)生了顯著的下調(diào)表達(dá)效果(0.4 倍),BdGRF5 與CK 相比差異不顯著,其余家族成員均呈現(xiàn)顯著上調(diào)表達(dá)的效果,上調(diào)表達(dá)差異倍數(shù)最大的是BdGRF4(2.4 倍)。外源GA3顯著促進(jìn)了8 個(gè)GRFs家族成員的上調(diào)表達(dá),3 個(gè)GRFs家族成員略微上調(diào)但差異不顯著,BdGRF9 下調(diào)表達(dá)差異也不顯著;其中,上調(diào)表達(dá)差異倍數(shù)最大的是BdGRF2(24.0 倍),其次為BdGRF12(8.7 倍)和BdGRF1(6.6 倍)。 外源6-BA 對(duì)全部GRFs家族成員都呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)效果,其中,上調(diào)表達(dá)差異倍數(shù)最大的是BdGRF1(7.6 倍),其次為BdGRF3(5.3 倍)。 外源BR 對(duì)BdGRF10(0.7 倍)和BdGRF11-1(0.8 倍)產(chǎn)生下調(diào)表達(dá)效果,其余家族成員均表現(xiàn)為上調(diào)表達(dá)效果。
作為植物特有的轉(zhuǎn)錄因子,在基因組水平上,GRFs已經(jīng)在許多物種中得到鑒定;截至目前,在苔蘚中只鑒定到2 個(gè)GRFs成員;單子葉植物中鑒定到GRFs成員數(shù)量最少的是大麥,僅有8 個(gè)成員,最多的是香蕉,有19 個(gè)成員;雙子葉植物中鑒定到GRFs成員數(shù)量最少的是百脈根,僅有2 個(gè)成員,最多的是大豆,有26 個(gè)成員;多數(shù)高等植物都能鑒定到8 個(gè)以上成員,而且表現(xiàn)為雙子葉植物大于單子葉植物,多倍體大于單倍體[25]。 本研究在全基因組范圍內(nèi)鑒定到12個(gè)二穗短柄草GRFs基因家族成員。 二穗短柄草與擬南芥GRF 蛋白保守結(jié)構(gòu)域的分析結(jié)果表明,2 個(gè)物種QLQ 結(jié)構(gòu)域保守性約為20%,該結(jié)構(gòu)域的差異主要表現(xiàn)在氨基酸偏好性的不同,這可能會(huì)導(dǎo)致不同家族成員在特定組織、發(fā)育階段或特殊生理狀態(tài)下發(fā)生特異性表達(dá),而QLQ 結(jié)構(gòu)域是蛋白質(zhì)互作區(qū)域,這種多態(tài)性很可能是執(zhí)行不同生物學(xué)功能的重要原因;WRC 結(jié)構(gòu)域保守性約為40%,保守氨基酸存在較大差異,而保守氨基酸一般出現(xiàn)在結(jié)構(gòu)域的N 端,這表明GRFs蛋白家族結(jié)構(gòu)在單子葉植物和雙子葉植物之間的保守性并不高。 這種由缺失和插入所造成的結(jié)構(gòu)域氨基酸殘基數(shù)量的變異,也是二穗短柄草GRFs呈現(xiàn)遺傳多樣性的重要原因。
圖7 二穗短柄草GRFs 基因家族對(duì)外源激素響應(yīng)的表達(dá)模式分析Fig.7 Expression analysis of GRFs family members in response to various hormones of Brachypodium distachyon
GRFs基因家族在植物不同生命進(jìn)程中發(fā)揮著不同的功能,GRF1~5 在細(xì)胞大小和數(shù)量的調(diào)控中起著重要作用,進(jìn)而影響根系生長(zhǎng)、葉片大小和植株高度等,特別是GRF2 對(duì)穗子發(fā)育、種子大小和含油量具有重要影響[2-3,25-28];此外,GRF1、GRF3 和GRF7 通過解除對(duì)DREB2A的抑制作用來響應(yīng)環(huán)境的脅迫[9];而大部分GRFs家族成員都能參與植物花器官的發(fā)育及花期的調(diào)控[5-7,29]。 本研究系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果表明,二穗短柄草、擬南芥、水稻、玉米和谷子分為Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ和Ⅷ6 組,分別包含1、2、2、2、2 和3 個(gè)二穗短柄草GRFs 蛋白,表明二穗短柄草GRFs 蛋白家族成員之間存在著廣泛的多樣性,這可能是由QLQ 結(jié)構(gòu)域保守性較低決定的,不同的DNA 結(jié)合位點(diǎn)可能是GRFs 蛋白家族成員功能多樣性的重要原因,同時(shí)也可能出現(xiàn)功能冗余的現(xiàn)象[25]。 系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果還表明,二穗短柄草GRFs 蛋白家族成員可能來自同一祖先。 此外,二穗短柄草GRFs 蛋白家族親緣關(guān)系與水稻最近,這可能與二者都是C3 植物有關(guān),與C4 植物的谷子親緣關(guān)系次之,而與C4 植物的玉米較遠(yuǎn),與雙子葉植物擬南芥親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。 基因家族成員的分布和結(jié)構(gòu)的多樣性決定了功能的多樣性,為研究二穗短柄草GRFs基因功能奠定了基礎(chǔ)。 本研究還發(fā)現(xiàn),二穗短柄草和擬南芥GRFs基因家族中存在8 對(duì)直系同源基因,在二穗短柄草中,未發(fā)現(xiàn)與擬南芥GRF7 直系同源的基因,這表明二穗短柄草在進(jìn)化的過程中可能發(fā)生了基因丟失事件,同時(shí)也按照物種特異性的方式進(jìn)行了擴(kuò)展,該現(xiàn)象在植物其他基因家族的研究中也得到了廣泛的驗(yàn)證[30-31],說明不同類型的GRFs基因家族成員存在不同的進(jìn)化途徑和進(jìn)化速度。 此外,二穗短柄草的12 個(gè)GRFs家族基因廣泛而非均勻地分布于其5 條染色體上,表明GRFs基因家族在二穗短柄草基因組中具有共同的祖先。 GRFs 蛋白家族結(jié)構(gòu)域和基序的保守性及多樣性都表明,GRFs 蛋白家族在二穗短柄草進(jìn)化過程中具有重要且多重的作用。 然而,染色體分布和序列比對(duì)分析結(jié)果表明,二穗短柄草GRFs家族成員的擴(kuò)張并未出現(xiàn)串聯(lián)重復(fù)的現(xiàn)象,這與前人研究結(jié)果是一致的[32-33]。
表達(dá)模式分析可以在一定程度上預(yù)測(cè)基因的分子功能和涉及的生命過程。 本研究通過RT-qPCR 分析了GRFs基因家族在二穗短柄草不同組織器官中的表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)幾乎所有GRFs家族成員表達(dá)量在幼穗和新葉等幼嫩器官中表達(dá)量較高,而在根系和老葉等器官中表達(dá)量較低。 Kim 等[34]和Choi 等[35]分別對(duì)擬南芥和水稻GRFs基因家族在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行了鑒定和表達(dá)分析,結(jié)果表明,擬南芥和水稻全部GRFs家族成員在地上部分生組織中大量表達(dá),而在9 個(gè)擬南芥GRFs基因家族成員中有7 個(gè)成員在根系分生區(qū)域有表達(dá),在12 個(gè)水稻中GRFs基因家族成員中有2個(gè)表現(xiàn)出低豐度的表達(dá)模式,這與本研究結(jié)果基本一致,暗示GRFs 蛋白在植物生長(zhǎng)發(fā)育中可能具有不同的生物學(xué)功能。GRFs基因通過正向調(diào)節(jié)細(xì)胞的伸展與分裂來促進(jìn)植物葉片的生長(zhǎng),且GRFs基因的表達(dá)量隨著植物的衰老而下降,說明GRFs基因家族廣泛參與了二穗短柄草旺盛生長(zhǎng)器官的生命過程,推斷GRFs基因家族成員在分生組織功能和器官形成中具有重要作用[36-37]。 植物的第一個(gè)GRFs轉(zhuǎn)錄因子(OsGRF1)是在研究GA3促進(jìn)水稻節(jié)間伸長(zhǎng)中被發(fā)現(xiàn)的[38]。 前人研究表明,外源GA3能誘導(dǎo)水稻、大白菜和煙草GRFs基因的上調(diào)表達(dá),而擬南芥GRFs家族成員對(duì)外源GA3沒有響應(yīng),這可能是不同物種間進(jìn)化關(guān)系不同導(dǎo)致的[12]。 本研究結(jié)果表明,外源GA3能夠使8 個(gè)GRFs基因家族成員顯著上調(diào),其他4 個(gè)成員差異不顯著,由此推斷并不是所有的GRFs家族成員都參與了二穗短柄草對(duì)外源GA3的響應(yīng),這與水稻中的研究結(jié)果相似。KNOX是重要的調(diào)節(jié)因子,通過抑制GA的生物合成進(jìn)而抑制細(xì)胞分化,因而能夠負(fù)向調(diào)控分生組織的發(fā)育及其功能;而GRFs是KNOX的上游抑制基因,由此推測(cè),外源GA3誘導(dǎo)了KNOX的表達(dá),并導(dǎo)致GRFs基因的上調(diào)表達(dá),說明二穗短柄草的GA 信號(hào)可能存在負(fù)向反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。 本研究還發(fā)現(xiàn),大部分GRFs基因家族成員對(duì)外源IAA、ABA、6-BA 和BR均產(chǎn)生了響應(yīng),這是因?yàn)榕c激素相關(guān)的順式作用元件存在于GRFs基因家族成員的啟動(dòng)子區(qū)域,如ABRE、GARE、TATC-box 和P-box 元件[12]。 然而,GRFs基因家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機(jī)制包括其啟動(dòng)子特異作用元件的相關(guān)研究仍需要進(jìn)一步深入探索。
本研究利用生物信息學(xué)的方法,在全基因組范圍內(nèi)鑒定了二穗短柄草的12 個(gè)基因家族成員;多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)它們均含有2 個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域:QLQ 和WRC結(jié)構(gòu)域。 染色體定位、基因結(jié)構(gòu)特征、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析表明,與擬南芥同源基因比對(duì)發(fā)現(xiàn),二穗短柄草GRFs基因家族可能經(jīng)歷了不同的進(jìn)化過程。 RTqPCR 分析表明,這些GRFs家族基因在二穗短柄草不同器官中表達(dá)模式類似,在幼嫩組織中表達(dá)量較高,且多數(shù)成員對(duì)外源激素特別是GA3有響應(yīng),表明GRFs家族基因廣泛參與了分生組織功能和器官形成。 該結(jié)果為進(jìn)一步研究GRFs家族基因在二穗短柄草生長(zhǎng)發(fā)育和器官形成等過程中的作用奠定了基礎(chǔ)。