張 樂(lè) 張亞紅 喬振羽 王亞楠 陳 璐 周 娟 黃嘉俊

（1寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750000；2寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750000）

香氣作為葡萄果實(shí)品質(zhì)評(píng)價(jià)中權(quán)重賦值最高的指標(biāo)之一，對(duì)果實(shí)本身及其加工品影響重大，也是促進(jìn)葡萄與葡萄酒市場(chǎng)消費(fèi)的重要因素之一［1］。近年來(lái)，為篩選影響果實(shí)香氣品質(zhì)的關(guān)鍵氣象因子，眾多學(xué)者對(duì)國(guó)內(nèi)主要釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)的氣候特征和果實(shí)品質(zhì)特征進(jìn)行了大量研究并總結(jié)，指出晝夜溫差是影響果實(shí)香氣品質(zhì)的關(guān)鍵氣象因子［2］。

葡萄果實(shí)香氣物質(zhì)合成途徑主要有脂肪酸代謝途徑、氨基酸代謝途徑和異戊二烯代謝途徑［3］。脂肪酸代謝途徑是以不飽和的亞油酸和亞麻酸為前體物，在氧合酶的催化下合成C6醛及相應(yīng)的醇、酯類［4］；氨基酸代謝途徑產(chǎn)生的物質(zhì)一般包括脂氨基酸和芳香族氨基酸，其中脂氨基酸是果實(shí)香氣成分中支鏈脂肪族醇、醛、酮和酯類物質(zhì)的主要來(lái)源，芳香族氨基酸則是揮發(fā)性酚、醚類和某些含芳香環(huán)類香氣物質(zhì)的前體物；異戊二烯合成代謝途徑主要以乙酰輔酶A為前體合成倍半萜類化合物為主［5］。大量研究表明，造成葡萄香氣多樣性的原因主要是不同地域的“風(fēng)土條件”，包括氣候條件、土壤條件、栽培措施等，這些因素及其相互作用都會(huì)影響葡萄和葡萄酒的質(zhì)量，其中氣候條件對(duì)葡萄香氣影響的研究得到廣泛關(guān)注［6］。研究發(fā)現(xiàn)，春季溫度顯著影響采收期美樂(lè)葡萄的3-異丁基-2-甲氧基吡嗪等吡嗪類和C6類香氣化合物［7］；低溫在一定程度上提高了瑪奎特葡萄漿果中具有強(qiáng)烈氣味的芳樟醇和香葉醇等萜烯香氣化合物的含量［8］；葡萄園較冷的環(huán)境條件使得葡萄果實(shí)生長(zhǎng)受到限制，從而抑制代謝物的積累和風(fēng)味物質(zhì)的形成；產(chǎn)地的晝夜溫差是促進(jìn)C6酯類和C6醇類合成的關(guān)鍵氣象因子之一［9］；晝夜溫差與C6揮發(fā)物、3-異丁基-2-甲氧基吡嗪和（E）-b-達(dá)馬斯基酮等揮發(fā)性化合物濃度之間存在顯著相關(guān)關(guān)系［10］，可能抑制巰基3-磺基己醇前體物的產(chǎn)生［11］。我國(guó)3個(gè)葡萄主產(chǎn)區(qū)中，新疆產(chǎn)地晝夜溫差較大，而山東產(chǎn)地晝夜溫差較小，寧夏葡萄產(chǎn)地晝夜溫差介于新疆和山東產(chǎn)地之間。3個(gè)產(chǎn)地果實(shí)中揮發(fā)性香氣物質(zhì)組成有顯著差異，山東產(chǎn)地果實(shí)中醛類和萜烯類物質(zhì)種類和相對(duì)含量最高，新疆產(chǎn)地果實(shí)中酯類物質(zhì)種類和相對(duì)含量最高，而寧夏產(chǎn)地果實(shí)中醇類物質(zhì)種類和相對(duì)含量最高［12］。現(xiàn)有晝夜溫差對(duì)果實(shí)香氣影響的研究以通過(guò)對(duì)局部果實(shí)處理或者結(jié)合多氣象因素為主，而各氣象因素對(duì)葡萄的性能以及葡萄酒質(zhì)量的影響存在復(fù)雜性，且多是各種因素相互作用，無(wú)法解釋單一因素—晝夜溫差對(duì)果實(shí)香氣的影響機(jī)制［13］，如在田間條件下，光照可促進(jìn)溫度升高，表明香味物質(zhì)的合成受光照和溫度的綜合影響［14］。

本研究通過(guò)設(shè)施調(diào)控夜間溫度改變晝夜溫差，基于氣相色譜法—質(zhì)譜法聯(lián)用技術(shù)（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）并進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，研究晝夜溫差對(duì)果實(shí)發(fā)育過(guò)程中香氣物質(zhì)積累的影響，以期為釀造者根據(jù)不同釀酒葡萄產(chǎn)區(qū)晝夜溫差特征因地制宜地調(diào)整釀造工藝，打造風(fēng)格特異的葡萄酒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況與試驗(yàn)材料

試驗(yàn)于2021年7—9 月在寧夏吳忠青銅峽市西鴿酒莊葡萄園（北緯38.1°，東經(jīng)105.8°）進(jìn)行，該試驗(yàn)地位于賀蘭山東麓偏南段，屬中溫帶干旱氣候區(qū)，平均海拔高度1 143 m，土壤類型為灰鈣土，日照充足，年降水量在200 mm左右。

供試葡萄品種為25年生歐亞種釀酒葡萄（Vitis viniferaL.）赤霞珠（Cabernet Sauvignon），自根苗定植，南北行向栽培，株距為1.0 m，行距為2.5 m，整體采用單臂“廠”字形架式進(jìn)行整形修剪，田間常規(guī)管理。

1.2 試驗(yàn)處理

在葡萄田間南北方向搭建3 間裝配式鋼架結(jié)構(gòu)溫室（圖1），在每間溫室內(nèi)安裝變頻空調(diào)，于晚間20：00左右升起棉被打開(kāi)空調(diào)，次日清晨6：00 降下棉被關(guān)閉空調(diào)，自轉(zhuǎn)色前期至轉(zhuǎn)色結(jié)束連續(xù)50 d 對(duì)溫室進(jìn)行夜間溫度調(diào)控以改變晝夜溫差，并利用ZDR-11 溫度記錄儀（杭州澤大儀器有限公司）和SS-H21400溫室娃娃（杭州澤大儀器有限公司）監(jiān)測(cè)溫濕度等指標(biāo)，查閱收集2015—2020年7—10 月氣象資料（數(shù)據(jù)來(lái)源于寧夏氣象局），計(jì)算該時(shí)期平均夜間溫度，以此夜間溫度為參考，設(shè)置4 組不同處理，即T-2.6℃（空調(diào)調(diào)控后夜間平均溫度為17.0 ℃，溫差為15.1 ℃）、T0.5℃（空調(diào)調(diào)控后夜間平均溫度為20.1 ℃，溫差為12.0 ℃）、T3.5℃（空調(diào)調(diào)控后夜間平均溫度為23.1 ℃，溫差為9.0 ℃）和CK（未經(jīng)空調(diào)調(diào)控，夜間平均溫度為19.6 ℃，溫差為12.5 ℃）。夜間溫度調(diào)控期間，溫室內(nèi)各項(xiàng)氣象指標(biāo)參數(shù)如表1所示。在最終采收期進(jìn)行取樣，每個(gè)處理各隨機(jī)選取6 個(gè)果穗，帶回實(shí)驗(yàn)室后隨機(jī)剪取果粒，3 次重復(fù)，用液氮速凍后放入-80 ℃冰箱備用。

圖1 夜間溫室示意圖［15］Fig.1 Nighttime greenhouse diagram［15］

表1 調(diào)控夜間溫度期間溫室內(nèi)氣象參數(shù)Table 1 Meteorological parameters in greenhouse during night temperature regulation

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 揮發(fā)性香氣成分檢測(cè) 參照孫磊等［16］的方法并加以改進(jìn)。稱取適量樣品和內(nèi)標(biāo)（2-辛醇）置于頂空瓶中密封，置于80 ℃水浴中平衡30 min，用固相微萃取針萃取30 min，待萃取結(jié)束后，萃取針在進(jìn)樣口解吸5 min。色譜柱：HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；分流比：不分流；載氣流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；掃描方式：全掃描；離子源溫度：230 ℃；四級(jí)桿溫度：180 ℃；升溫程序：起始溫度為45 ℃，保持4 min，以6 ℃·min-1的速率升至130 ℃，保持6 min，再以10 ℃·min-1的速率升至230 ℃，保持8 min。采集到的質(zhì)譜圖利用美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究所（National Institute of Standards and Technology，NIST）譜庫(kù)進(jìn)行檢索，鑒定樣品中的揮發(fā)性成分，并利用內(nèi)標(biāo)法對(duì)各成分進(jìn)行定量分析。

1.3.2 RNA 提取及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成樣品RNA提取和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，且每個(gè)樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)。樣品RNA的提取通過(guò)Omini Plant RNA Kit（DNase I）試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司，泰州）完成，RNA檢測(cè)合格后經(jīng)反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增得到cDNA文庫(kù)，庫(kù)檢合格后，于Illumina平臺(tái)測(cè)序。參考基因來(lái)源：Vitis_vinifera；參考基因組版本：12X；參考基因組來(lái)源：http：//plants.ensembl.org/Vitis_vinifera/Info/Index。

1.3.3 差異基因的功能分析 基于表達(dá)量定量結(jié)果，采用DESeq2軟件進(jìn)行組間差異基因分析，獲得兩組間發(fā)生差異表達(dá)的基因［17］，篩選閾值為：|log2FC|≥1，padjust＜0.05，將篩選出的差異表達(dá)基因與基因本體（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得不同樣品中的功能注釋及相關(guān)代謝通路信息。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）驗(yàn)證分析 根據(jù)富集結(jié)果篩選出參與香氣合成等代謝通路的差異表達(dá)基因，并從中選取9個(gè)基因進(jìn)行qRT-PCR 驗(yàn)證分析（表2），內(nèi)參基因?yàn)锳CTIN1（GenBank：XP_008654957.1），引物序列通過(guò)Primer 平臺(tái)設(shè)計(jì)并由上海生工生物工程有限公司合成（表2）。使用一步法反轉(zhuǎn)錄熒光定量試劑盒（B639277-0100，上海生工生物工程有限公司），反應(yīng)程序?yàn)椋?5 °C預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 °C延伸40 s，40個(gè)循環(huán)。3次重復(fù)，采用2-ΔΔCT法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

表2 qRT-PCR引物序列Table 2 Primer sequence of qRT-PCR

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 26.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan多重比較進(jìn)行顯著性方差分析，最低顯著水平P＜0.05；采用Origin Pro2021軟件進(jìn)行主成分分析和繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同晝夜溫差對(duì)葡萄果實(shí)可溶性固形物、可溶性糖和可滴定酸含量的影響

由圖2 可知，隨著采樣時(shí)間的延遲，不同晝夜溫差處理下赤霞珠漿果可溶性固形物和可溶性糖含量整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，可滴定酸含量則呈下降趨勢(shì)。采收時(shí)，T-2.6℃、T0.5℃、T3.5℃、CK 處理的可溶性固形物含量分別為26.1%、25.2%、24.8%和25.3%，可溶性糖含量分別為224.00、218.70、211.39 和221.12 mg·g-1，可滴定酸含量分別為8.45、6.45、5.15 和6.70 g·L-1。由此可見(jiàn)，晝夜溫差與可溶性固形物、可溶性糖含量呈正相關(guān)，與可滴定酸含量呈負(fù)相關(guān)。

圖2 不同晝夜溫差對(duì)漿果可溶性物質(zhì)的影響Fig.2 Effect of different diurnal temperature treatments on soluble substances in berries

2.2 不同晝夜溫差對(duì)葡萄果實(shí)揮發(fā)性香氣的影響

2.2.1 葡萄果實(shí)香氣成分、種類比較 由表3 可知，不同晝夜溫差處理下的赤霞珠葡萄果實(shí)香氣總量差異顯著，從高到低依次為T0.5℃＞T-2.6℃＞T3.5℃＞CK，T-2.6℃、T0.5℃、T3.5℃的香氣總量分別是CK的2.86、4.58、1.18倍；T-2.6℃、T0.5℃、T3.5℃、CK 的香氣成分種類依次為24、24、29、14種。

表3 不同晝夜溫差處理下的葡萄果實(shí)香氣成分種類和含量Table 3 Types and contents of aroma components of grape fruits under different diurnal temperature differences /（ng·kg-1）

表3（續(xù)）

表3（續(xù)）

T-2.6℃處理的葡萄果實(shí)在脂肪酸途徑中的香氣總含量高于其他處理的樣品，分別是T0.5℃、T3.5℃、CK 處理的1.44、2.58、2.59 倍，其香氣成分主要包括乙醛、己醛、2-己醛和乙酸等，是柑橘、蘋(píng)果、番茄、紫羅蘭等香氣的主要貢獻(xiàn)者。T0.5℃處理的葡萄果實(shí)在氨基酸途徑中的香氣總含量高于其他處理的樣品，分別是T-2.6℃、T3.5℃、CK處理的3.04、6.84、10.38倍，其香氣成分主要包括茴香腦、大茴香基丙酮、2-正庚呋喃、間茴香醛等，是風(fēng)信子、水仙、蘋(píng)果、草莓、樹(shù)莓等香氣的主要貢獻(xiàn)者。與T-2.6℃和T0.5℃處理的葡萄相比，T3.5℃處理的樣品在異戊二烯途徑中的香氣含量最高，分別為T-2.6℃、T0.5℃和CK處理樣品的7.97、2.68和2.66倍，其香氣成分主要包括大馬士酮、香葉基丙酮、蘑菇醇等，主要貢獻(xiàn)烤煙葉、香料、薄荷、埌香、藥草等香氣。

綜合來(lái)看，T-2.6℃和T0.5℃處理提高了赤霞珠果實(shí)中的花香和果香，后續(xù)在釀酒過(guò)程中可提高葡萄酒一類香氣的含量，在釀造干紅的同時(shí)，也宜于釀造起泡桃紅類葡萄酒；T3.5℃處理提高了果實(shí)中的煙草香，為后續(xù)釀造葡萄酒提供了更多的三類香氣，即陳釀香，因此，在較小溫差環(huán)境下生長(zhǎng)的葡萄釀酒后更適宜儲(chǔ)存較長(zhǎng)時(shí)間以更好地形成陳釀香。

2.2.2 主成分分析 為了直觀地展示不同晝夜溫差對(duì)赤霞珠葡萄果實(shí)香氣的影響情況，進(jìn)行了主成分分析（圖3）。其中，脂肪酸途徑得到2 個(gè)主成分，解釋了總方差的85.5%，第1主成分（PC1）和第2主成分（PC2）分別占總變異性的59.1%和26.4%，T-2.6℃和T0.5℃的點(diǎn)集中在第一、二、四象限，T3.5℃則集中在第三象限（圖3-A）；氨基酸途徑得到2 個(gè)主成分，解釋了總方差的75.9%，PC1 和PC2 分別占總變異性的46.2%和29.7%，T-2.6℃和T0.5℃的點(diǎn)集中在第一、二象限，T3.5℃則集中在第四象限（圖3-C）；異戊二烯途徑得到2個(gè)主成分，解釋了總方差的83.3%，PC1和PC2分別占總變異性的59.8%和23.5%，T-2.6℃和T0.5℃的點(diǎn)集中在第三、四象限，T3.5℃則集中在第一象限（圖3-E），從視覺(jué)上說(shuō)明不同晝夜溫差對(duì)赤霞珠果實(shí)香氣成分的影響存在較大差異。

由載荷圖可以看出，脂肪酸途徑中，T-2.6℃和T0.5℃葡萄果實(shí)積累了比較豐富的乙醛、己醛、乙醇、己醇、乙酸等，T3.5℃對(duì)庚醛等的積累較豐富（圖3-B）；氨基酸途徑中，T-2.6℃和T0.5℃葡萄果實(shí)積累了較豐富的苯甘氨醇、苯乙醇、安息香醛、間茴香醛等，T3.5℃對(duì)苯甲醇、苯乙醛等的積累較豐富（圖3-D）；異戊二烯途徑中，T-2.6℃和T0.5℃葡萄果實(shí)積累了較豐富的1，4-戊二烯等，T3.5℃積累了較豐富的大馬士酮、香葉基丙酮、蘑菇醇、肉桂烯等（圖3-F）。

圖3 葡萄果實(shí)香氣成分含量主成分分析Fig.3 Principal component analysis of grape fruit aroma components

2.3 不同晝夜溫差對(duì)葡萄果實(shí)香氣相關(guān)基因表達(dá)的影響

2.3.1 RNA-seq 測(cè)序質(zhì)量評(píng)估 由表4 可知，通過(guò)Illumina平臺(tái)完成T-2.6℃、T0.5℃、T3.5℃和CK（分別包含3次重復(fù)在內(nèi)）共12個(gè)樣品的轉(zhuǎn)錄組分析，共獲得80.03 Gb Clean Data，各樣品Clean Data 均達(dá)到6.22 Gb 以上，Q30堿基百分比在92.51%以上，說(shuō)明測(cè)序質(zhì)量良好且可以進(jìn)行后續(xù)比對(duì)分析；分別將各樣品的Clean Reads 與指定的參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)，比對(duì)率從87.39%到90.14%不等，其中比對(duì)到多個(gè)位置的為3.41%～4.57%，比對(duì)到唯一位置的為83.68%～86.57%。

表4 不同晝夜溫差處理葡萄果實(shí)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果及比對(duì)統(tǒng)計(jì)Table 4 Transcriptome sequencing results and comparative statistics of grape fruit treated with different diurnal amplitude differences

2.3.2 差異表達(dá)基因的篩選及直系同源蛋白（clusters of orthologous groups，COG）分析 由圖4-A 可知，不同晝夜溫差處理下，共檢測(cè)到5 111 個(gè)差異表達(dá)基因，其中，T-2.6℃與CK 之間差異表達(dá)基因?yàn)? 064 個(gè)，包括上調(diào)基因671個(gè)和下調(diào)基因393個(gè)；T0.5℃與CK之間差異表達(dá)基因?yàn)?30 個(gè)，包括上調(diào)基因599 個(gè)和下調(diào)基因231個(gè)；T3.5℃與CK之間差異表達(dá)基因?yàn)? 107個(gè)，包括上調(diào)基因1 911個(gè)和下調(diào)基因1 196個(gè)。由圖4-B可知，不同晝夜溫差處理共有差異表達(dá)基因132 個(gè)，T-2.6℃特異表達(dá)差異基因有488 個(gè)，T0.5℃特異表達(dá)差異基因有263 個(gè)，T3.5℃特異表達(dá)差異基因有2 123個(gè)。

由圖4-C 可知，比對(duì)差異表達(dá)基因與COG 數(shù)據(jù)庫(kù)后，在COG 的21 個(gè)分類中，T-2.6℃、T0.5℃、T3.5℃注釋到S（function unknown，未知功能）（586、1 622、456）的基因數(shù)最多，較多為K（transcription，轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因）（53、166、39）、O（posttranslational modification，protein turnover，chaperones，翻譯后修飾，蛋白質(zhì)折疊和分子伴侶）（50、138、55）等功能條目，而注釋到A（RNA processing and modification，RNA的加工和修飾）（1、11、0）、F（nucleotide transport and metabolism，核苷酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝）（7、15、3）等功能條目的差異表達(dá)基因數(shù)較少。

圖4 差異表達(dá)基因的篩選及COG分析Fig.4 Screening of differentially expressed genes and COG analysis

2.3.3 差異表達(dá)基因GO和KEGG 富集分析 對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 注釋分析（圖5）可知，在細(xì)胞成分、分子功能、生物過(guò)程三大條目的差異表達(dá)基因存在較大差異，圖5 僅展示豐度前20 的GO 富集條目，不同晝夜溫差處理與CK 之間富集到的條目數(shù)一致，在細(xì)胞成分中主要富集到的條目有代謝過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程、生物調(diào)控等；在分子功能中主要富集到的條目有結(jié)合、催化活性、轉(zhuǎn)運(yùn)活性等；在生物過(guò)程中主要富集到的條目有細(xì)胞部分、膜組件、薄膜、細(xì)胞器、含蛋白質(zhì)復(fù)合物等。

圖5 差異表達(dá)基因GO分析Fig.5 GO analysis of differentially expressed genes

對(duì)處理間的差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG 富集分析，結(jié)果表明（圖6），注釋到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)的差異表達(dá)基因共有1 252 個(gè)，代謝通路119 個(gè)，圖6 僅展示豐度前10的KEGG 富集條目，在CK vs T-2.6℃中，差異表達(dá)基因在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、硫代謝、氰基氨基酸代謝、油菜素類固醇生物合成、光合作用-天線蛋白、光合作用、芪類、二芳基庚烷類和姜辣素生物合成、半乳糖代謝、檸檬烯和蒎烯降解、晝夜節(jié)律-植物途徑中明顯富集；在CK vs T0.5℃中，差異表達(dá)基因在淀粉和蔗糖代謝、色氨酸代謝、半乳糖代謝、檸檬烯和蒎烯降解、氮代謝、苯丙烷生物合成、黃酮類生物合成、晝夜節(jié)律-植物、亞油酸代謝途徑中明顯富集；在CK vs T3.5℃中，差異表達(dá)基因在芪類二芳基庚烷類和姜辣素生物合成、類胡蘿卜素生物合成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工、類固醇生物合成、酪氨酸代謝、色氨酸代謝、檸檬烯和蒎烯降解、氮代謝、苯丙烷生物合成、晝夜節(jié)律-植物途徑中明顯富集。其中，關(guān)于香氣的代謝合成，差異表達(dá)基因主要富集在亞油酸、苯丙氨酸、酪氨酸代謝、檸檬烯和蒎烯降解途徑，據(jù)此推測(cè)，上述幾種代謝途徑在各處理香氣形成中起著重要作用，因此，通過(guò)KEGG 富集對(duì)香氣合成途徑相關(guān)的亞油酸、苯丙氨酸、酪氨酸代謝、檸檬烯和蒎烯降解途徑中的相關(guān)基因進(jìn)行進(jìn)一步分析。

圖6 差異基因KEGG富集散點(diǎn)圖Fig.6 Enrichment scatter plot of differential gene KEGG

2.3.4 香氣物質(zhì)相關(guān)候選基因的篩選 亞油酸代謝途徑屬于脂肪酸途徑，由圖7 可知，在此代謝通路上共注釋到8個(gè)差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs），其中包括5個(gè)脂氧合酶（lipoxygenase，LOX，VIT_14s0128g00780、VIT_09s0002g01080、VIT_00s0265g00 170、VIT_13s0064g01480 和VIT_06s0004g01510），2 個(gè)乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH，VIT_07s0005g04 610和VIT_18s0001g15410），1個(gè)丁酰輔酶A脫氫酶（butylcoa dehydrogenase，HBD，VIT_19s0014g02370）。LOX 和HBD相關(guān)基因在T-2.6℃和CK處理下大多下調(diào)表達(dá)，在T0.5℃和T3.5℃處理多上調(diào)表達(dá)；ADH相關(guān)基因在T-2.6℃和CK處理下大多上調(diào)表達(dá)，在T0.5℃和T3.5℃處理下多下調(diào)表達(dá)。

圖7 香氣物質(zhì)代謝合成途徑相關(guān)基因Fig.7 Genes related to aroma substance metabolic synthesis pathway

苯丙氨酸和絡(luò)氨酸代謝途徑屬于氨基酸途徑，在這兩個(gè)代謝通路上共注釋到20個(gè)DEGs，主要包括1個(gè)天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，ASP，VIT_08s0058g01000）、1個(gè)轉(zhuǎn)氨酶（transaminase，TAT，VIT_19s0014g02190）、2 個(gè)煙酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶（niacinamide aminotransferase，NAAT，VIT_12s0028g03200 和VIT_12s0028g03210）、10 個(gè)苯丙氨酸裂解酶（phenylalanine lyase，PAL）、2個(gè)酰胺酶（Amidase，AMI，VIT_03s0038g02010和VIT_14s0128g00320）、1個(gè)雙加氧酶（dioxygenase，HGO，VIT_19s0014g01800）、1 個(gè)丙酮酸雙加氧酶（pyruvate dioxygenase，HPD，VIT_12s0028g00710）、2個(gè)香葉醇氧化還原酶（geraniol oxidoreductase，8HGO，VIT_06s0004g04310和VIT_06s0004g04320）。T-2.6℃和CK 處理促進(jìn)了ASP、TAT、PAL多數(shù)相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)；NAAT、AMI、HGO、HPD、8HGO多數(shù)相關(guān)基因在T0.5℃和T3.5℃處理上調(diào)表達(dá)。

檸檬烯和蒎烯途徑屬于異戊二烯途徑，在此代謝通路上共注釋到3 個(gè)DEGs，主要為醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase，ALDH，VIT_06s0004g02060，VIT_17s0000g 08070和VIT_01s0026g00220），T0.5℃和T3.5℃處理促進(jìn)了ALDH 相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)；而T-2.6℃和CK 處理則降低了ALDH相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平。

綜上可知，較大的晝夜溫差促進(jìn)了ADH、ASP、TAT、PAL 相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)，較小的晝夜溫差促進(jìn)了LOX、HBD、NAAT、AMI、HGO、HPD、8HGO、ALDH相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)。

2.3.5 qRT-PCR 驗(yàn)證 為檢驗(yàn)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的真實(shí)性，本研究從香氣代謝合成途徑相關(guān)基因中隨機(jī)挑選了9個(gè)候選基因LOX（VIT_06s0004g01510）、HBD（VIT_19s0014g02370）、HPD（VIT_12s0028g0071）、HGO（VIT_19s0014g01800）、ADHIII（VIT_07s0005g04610）、HPPD（VIT_12s0028g00170）、ADHI（VIT_18s0001g15410）、ALDH2B4（VIT_17s0000g08070）、ALDH2B4（VIT_01s0026g00220）進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證（圖8）。將qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果與RNAseq的數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析，可知兩者的相關(guān)系數(shù)較高且表達(dá)趨勢(shì)基本相同，表明RNA-seq的分析結(jié)果可靠。

圖8 部分基因的qRT-PCR驗(yàn)證Fig.8 qRT-PCR validation of some genes

3 討論

劉玉蘭［18］研究發(fā)現(xiàn)果實(shí)著色期氣溫平均日較差對(duì)葡萄果實(shí)總糖含量有重要影響，其中，最低氣溫影響最大，而本研究發(fā)現(xiàn)降低夜間溫度增大晝夜溫差，可溶性固形物和可溶性糖含量呈上升趨勢(shì)，造成這一現(xiàn)象的原因可能是由于夜間低溫減弱了呼吸作用，使得漿果內(nèi)有機(jī)物質(zhì)的消耗減少，從而促進(jìn)含糖量等的升高［18］。

香氣是葡萄的重要品質(zhì)特征之一，是葡萄酒消費(fèi)者、葡萄種植者和葡萄酒釀造者共同關(guān)注的焦點(diǎn)。赤霞珠作為在中國(guó)各大葡萄產(chǎn)區(qū)均有種植的釀酒品種之一，對(duì)于其品質(zhì)尤其是香氣品質(zhì)的提升也受到廣泛關(guān)注。一般認(rèn)為，冷涼環(huán)境有利于香氣物質(zhì)的產(chǎn)生，短暫的高溫會(huì)加速果實(shí)成熟，提高葡萄釀酒后的品質(zhì)，然而長(zhǎng)期高溫或強(qiáng)光照會(huì)降低吡嗪類物質(zhì)的含量，導(dǎo)致香氣品質(zhì)改變。炎熱的氣候會(huì)促進(jìn)雷司令葡萄果實(shí)和葡萄酒中產(chǎn)生一種帶有煤油味的物質(zhì)—1，1，6-三甲基-1，2-二氫萘（1，1，6-trimethyl-1，2-dihydronaphthalene，TDN），但氣候過(guò)冷會(huì)導(dǎo)致果實(shí)香氣物質(zhì)含量下降，青草味加強(qiáng)，因此，溫度過(guò)高或過(guò)低都不利于香氣物質(zhì)的積累［19］。本研究發(fā)現(xiàn)，降低夜間溫度增大晝夜溫差提高了赤霞珠葡萄果實(shí)中醛類、酯類、醇類、萜烯類揮發(fā)性香氣物質(zhì)的含量，這可能是由于冷涼環(huán)境有利于香氣物質(zhì)的形成，如生長(zhǎng)季后期的低溫環(huán)境顯著提高了一年兩收栽培的夏黑葡萄冬果C6醛類香氣物質(zhì)的含量，主要特征香氣為花果香［20］，同時(shí)，冷涼環(huán)境在一定程度上也會(huì)使萜烯類含量上升［21］；升高夜間溫度減小晝夜溫差可促使赤霞珠葡萄果實(shí)中酮類和酸類揮發(fā)性香氣物質(zhì)的積累，是由于適度的高溫會(huì)加速果實(shí)成熟，從而提高葡萄果實(shí)部分香氣物質(zhì)的含量［22］。

脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）和乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）是脂肪酸途徑合成揮發(fā)性香氣的關(guān)鍵酶［23］，LOX 與果實(shí)成熟過(guò)程中香氣物質(zhì)釋放的關(guān)系密切，如LOX 活性與不飽和脂肪酸及脂肪酸來(lái)源香氣成分的積累顯著相關(guān)［24］；揮發(fā)性酯類化合物是由醇?；D(zhuǎn)移酶催化醇和羧酸酯化生成的，脂肪酸代謝途徑為酯類化合物的生物合成提供醇等底物，LOX 在巨峰和87-1 葡萄漿果中較高水平的表達(dá)提高了揮發(fā)性酯類化合物的含量［25］；雷司令、維多利亞和優(yōu)株玫瑰葡萄冬果成熟過(guò)程中LOX 的高轉(zhuǎn)錄水平對(duì)冬果中C6醛類物質(zhì)的高積累起主要作用［26］，在葡萄果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，ADH 的嚴(yán)密調(diào)控可能為改變葡萄和葡萄酒香氣提供契機(jī)，如利用植物育種或分子遺傳方法調(diào)控葡萄漿果中的ADH 水平以促進(jìn)醇類（果香）的產(chǎn)生［27］。本研究發(fā)現(xiàn)，降低夜間溫度增加晝夜溫差降低了LOX 相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，促進(jìn)了ADH 相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)，這與劉孟龍［28］的研究結(jié)果基本一致。苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia-lyase，PAL）是苯丙烷途徑的關(guān)鍵酶，催化苯丙烷類代謝第一步反應(yīng)，在植物果實(shí)著色、次生代謝以及發(fā)育過(guò)程中起重要作用［29］。大量PAL 在小果粒葡萄果實(shí)中顯著上調(diào)使得二苯乙烯在果實(shí)開(kāi)始成熟時(shí)大量積累［30］。前人研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)降低溫度可提升PAL 活性，調(diào)控PAL相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)［31-32］，這與本研究中降低夜間溫度增大晝夜溫差可升高PAL 相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的結(jié)果基本一致。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)香氣代謝合成途徑中LOX、ADH 相關(guān)基因與葡萄果實(shí)香氣物質(zhì)存在密切關(guān)系，較大的晝夜溫差條件下，乙醛、己醛等物質(zhì)含量增加，同時(shí)LOX 相關(guān)基因下調(diào)表達(dá)而ADH 相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)。并且，PAL 相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平的提高促進(jìn)了2-己烯醛和乙酸等香氣物質(zhì)的積累，為葡萄貢獻(xiàn)了柑橘、蘋(píng)果、番茄、紫羅蘭等香氣。

4 結(jié)論

晝夜溫差與可溶性固形物、可溶性糖含量呈正相關(guān)，與可滴定酸含量呈負(fù)相關(guān)，較大的晝夜溫差可為葡萄酒提供更多品種香，并促進(jìn)ADH、ASP、TAT、PAL 相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)；較小的晝夜溫差可為葡萄酒提供更多陳釀香，并促進(jìn)LOX、HBD、NAAT、AMI、HGO、HPD、8HGO、ALDH相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)。