近年來，該文作者對(duì)基于中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)病理性疼痛機(jī)制的理解取得了重大突破，主要得益于兩項(xiàng)重大發(fā)現(xiàn)：脊髓神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活及介導(dǎo)輕觸解除疼痛抑制的細(xì)胞信號(hào)通路。目前尚不清楚周圍神經(jīng)改變是慢性神經(jīng)病理性疼痛維持的原因，還是僅作為中樞可塑性過程的初始誘因。

慢性疼痛與損傷后神經(jīng)再生的關(guān)系研究甚少。物理創(chuàng)傷后，受損的周圍神經(jīng)纖維在容許的環(huán)境中逐漸再生的能力有限。如果其再生受到軀體障礙或不利的局部環(huán)境阻礙，鄰近未受損的神經(jīng)纖維可以通過“側(cè)枝生芽”侵入去神經(jīng)區(qū)域。然而，這會(huì)導(dǎo)致正常感覺恢復(fù)和疼痛消失，還是會(huì)因神經(jīng)過度支配或側(cè)枝錯(cuò)誤連接而加劇神經(jīng)病理性疼痛，仍存在爭議。

迄今為止，由于在臨床前研究中的尸檢組織與神經(jīng)病理性疼痛相關(guān)性的限制以及臨床研究中人體實(shí)驗(yàn)的特殊性，沒有考慮到神經(jīng)再生的動(dòng)態(tài)性、神經(jīng)支配模式個(gè)體間的差異性以及與末端器官的連通性，要闡明周圍神經(jīng)再生在神經(jīng)病理性疼痛中的作用一直存在困難，加之這些研究缺乏因果分析。因此，無法確定外周神經(jīng)重構(gòu)是神經(jīng)病理性疼痛的原因還是結(jié)果。

1.感覺神經(jīng)支配的在體成像

該研究對(duì)特定的感覺傳入神經(jīng)亞群進(jìn)行縱向成像，明確了外周神經(jīng)再生在慢性疼痛中的作用。本文作者在活體小鼠中觀察了神經(jīng)損傷前和神經(jīng)損傷后10 個(gè)月至1 年內(nèi)皮膚外周觸覺纖維和傷害性感受器的衰退、再生、側(cè)枝生芽和末端器官連接，并對(duì)其感覺功能的協(xié)調(diào)行為進(jìn)行了評(píng)估。

利用分子遺傳技術(shù)獲得了特異標(biāo)記無髓鞘C-纖維和薄髓鞘Aδ 傷害性纖維的SNS-mGFP 小鼠，以及標(biāo)記觸覺敏感低閾值機(jī)械感覺Aβ 傳入纖維(Aβ-LTMRs) 的Thy1-YFP 小鼠。并借助多光子激發(fā)熒光成像，對(duì)小鼠活體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了持續(xù)數(shù)月的穩(wěn)定可視化檢測(cè)。使用坐骨神經(jīng)分支選擇性損傷模型(SNI)，選擇小鼠后爪無毛表面的兩個(gè)區(qū)域：①損傷或去神經(jīng)區(qū)域，通常由在SNI 中受損和結(jié)扎的脛神經(jīng)和腓總神經(jīng)支配，模擬正常再生的障礙；②主要由腓腸神經(jīng)支配的非損傷區(qū)域，在SNI 后結(jié)構(gòu)完好無損，但會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的機(jī)械過敏反應(yīng)。研究受損和未受損神經(jīng)的混合型損傷導(dǎo)致的神經(jīng)病理性疼痛。

2.神經(jīng)再支配與疼痛產(chǎn)生

使用vonFrey 測(cè)試小鼠后爪對(duì)機(jī)械刺激的敏感性。在SNI 后的3 天至1 周內(nèi)，Thy1-YFP 和SNSmGFP 小鼠的Aβ-LTMRs 和傷害性傳入神經(jīng)纖維都丟失后，去神經(jīng)的脛骨區(qū)域?qū)Ψ莻π院蛡π詸C(jī)械刺激完全不敏感，但隨著時(shí)間的推移，不敏感的脛骨區(qū)域逐漸重新獲得反應(yīng)。在第8 周左右對(duì)傷害性機(jī)械刺激出現(xiàn)了反應(yīng)，在第16 周時(shí)對(duì)非傷害性機(jī)械刺激也出現(xiàn)了反應(yīng)；同時(shí)，小鼠脛骨區(qū)域出現(xiàn)了傷害性纖維的漸進(jìn)性再支配，而Aβ 纖維在這里仍然明顯缺失。從SNI 后第20 周開始，SNS-mGFP和Thy1-YFP 小鼠在先前對(duì)機(jī)械刺激不敏感的脛骨區(qū)域都顯示出明顯的痛覺過敏(hyperalgesia)和痛覺超敏，并持續(xù)到第42 周。故推測(cè)小鼠在SNI 后第20 周，傷害性感受器與觸覺傳入神經(jīng)可能重新建立了一個(gè)廣泛的網(wǎng)絡(luò)聯(lián)系。

結(jié)合對(duì)SNS-mGFP 和Thy1-YFP 小鼠的行為和纖維總長度的定量分析，發(fā)現(xiàn)傷害性感受器密度恢復(fù)的最大值恰好在機(jī)械性痛覺超敏功能表現(xiàn)的時(shí)間點(diǎn)之前，在SNI 后42 周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，所有小鼠中均沒有出現(xiàn)Aβ-LTMRs；此外，還發(fā)現(xiàn)這種機(jī)械性痛覺過敏并非反射亢進(jìn)，而是一種厭惡行為。因?yàn)樵赟NI 后24 周發(fā)現(xiàn)即使小鼠的脛骨區(qū)域接受的是非傷害性刺激，也會(huì)回避黑暗小室（通常小鼠喜好黑暗處）；而假手術(shù)組小鼠沒有出現(xiàn)這種回避現(xiàn)象。表明只有SNI 小鼠厭惡這種對(duì)脛骨區(qū)域的非傷害刺激。

總之，這種從感覺缺失到痛覺過敏、痛覺超敏和厭惡的漸進(jìn)轉(zhuǎn)變揭示了遲發(fā)性慢性神經(jīng)病理性疼痛的出現(xiàn)過程，并表明這與傷害性感受器的重新支配有關(guān)，而與Aβ-LTMRs 無關(guān)。

3.神經(jīng)纖維軌跡的差異

接下來，該研究試圖解釋腓腸神經(jīng)傷害性感受器能進(jìn)入去神經(jīng)的脛骨區(qū)域，而Aβ-LTMRs 不能進(jìn)入的原因。由于無髓鞘神經(jīng)纖維總體上比厚髓鞘纖維具有更強(qiáng)的再生能力，且側(cè)枝生芽的生長軌跡和遠(yuǎn)端連接對(duì)于實(shí)現(xiàn)功能恢復(fù)至關(guān)重要?；谶@些特點(diǎn)，提出了兩個(gè)觀點(diǎn)：①發(fā)現(xiàn)基線條件下脛骨神經(jīng)支配的傷害性感受器的三維結(jié)構(gòu)與SNI 后42 周侵入脛骨區(qū)的腓腸神經(jīng)傷害性感受器的三維結(jié)構(gòu)幾乎完全一致，表明來自不同神經(jīng)元的無關(guān)傷害性感受器能在側(cè)枝生芽的時(shí)候準(zhǔn)確回溯原始傷害性感受器的痕跡；②通過靜脈注射德克薩斯紅標(biāo)記的高分子葡聚糖標(biāo)記SNI 42 周后的小鼠血管，觀察到側(cè)枝生芽中mGFP 標(biāo)記的傷害性感受器的小遠(yuǎn)端分支與小血管交織在一起；而在對(duì)照組小鼠中，雖然檢測(cè)到了完整的血管，卻沒有Thy1-YFP 標(biāo)記的Aβ 纖維。這表明傷害性感受器能夠?qū)⑿⊙茏鳛樯L支架，側(cè)枝侵入去神經(jīng)區(qū)域再現(xiàn)原始的軌跡模式。

4.傷害性感受器末端連接異常

此外，該研究解釋了為什么傷害性感受器側(cè)枝生芽進(jìn)入去神經(jīng)區(qū)域會(huì)導(dǎo)致痛覺超敏，而不是簡單地恢復(fù)正常傷害性感覺。不同類型的外部感覺刺激通過終末器官傳遞到皮膚中不同類型的神經(jīng)纖維上，不同類型的終末器官-神經(jīng)末梢連接是分辨疼痛和觸摸的關(guān)鍵。的確，該研究發(fā)現(xiàn)了終末器官連接和側(cè)枝生芽的傷害性感受器的功能缺陷，合理解釋了小鼠在SNI 后出現(xiàn)正常痛覺向痛覺超敏的轉(zhuǎn)換現(xiàn)象。

在SNS-mGFP 小鼠中，mGFP 標(biāo)記的大多是細(xì)纖維，終止于表皮中微小的游離神經(jīng)末梢，這是傷害性感受器的特征。正常情況下，表皮內(nèi)有豐富的游離神經(jīng)末梢支配，而脛骨區(qū)域側(cè)枝生芽的傷害性感受器被限制在表皮和真皮之間的基底膜中，直到SNI 后42 周實(shí)驗(yàn)終止也沒有進(jìn)入表皮。這說明神經(jīng)再支配引起的神經(jīng)病理性痛覺超敏與傷害性感受器侵入的去神經(jīng)區(qū)域缺乏表皮內(nèi)游離神經(jīng)末梢有關(guān)。這種缺失再現(xiàn)了人類幾種疼痛超敏的C-纖維病的一個(gè)顯著特征。

另外，還觀察到傳入神經(jīng)終止于傳遞觸覺的Meissner 小體上，并發(fā)現(xiàn)YFP 標(biāo)記的大直徑Aβ 傳入神經(jīng)在無毛皮膚中以橢圓形終端呈現(xiàn)出來，這是Meissner 小體的特征（通過標(biāo)記邁斯納神經(jīng)膠質(zhì)鞘的蛋白質(zhì)S100 證實(shí)）；同時(shí)，也發(fā)現(xiàn)一些mGFP標(biāo)記的傷害感受纖維終止于表皮和真皮之間的交界處，并直接與表達(dá)S100 的Meissner 小體相對(duì)；Aβ纖維支配Meissner 小體是通過盤繞在其神經(jīng)膠質(zhì)鞘上，而傷害性感受器則形成了一個(gè)稀疏的橫向終末網(wǎng)絡(luò)并與Meissner 小體膠質(zhì)細(xì)胞共存。幾十年來，大多認(rèn)為Meissner 小體是由有髓鞘的低閾值傳入神經(jīng)專一支配，但這種傳入神經(jīng)最近被報(bào)道分成兩個(gè)在系統(tǒng)發(fā)育上截然不同的Aβ 神經(jīng)元種群；雖然，也有少部分報(bào)道人類皮膚中小直徑無髓鞘纖維定位在Meissner 小體內(nèi)，但這些纖維還沒有受到關(guān)注，其功能重要性也完全不知。

為了證實(shí)終末器官的異常連接的問題，在SNI后24 周使用序列塊面掃描電鏡成像技術(shù)生成脛骨區(qū)域內(nèi)終末連接的高分辨率圖像。與對(duì)照組小鼠相比，SNI 小鼠的真皮中明顯缺乏有髓鞘纖維，無髓鞘軸突構(gòu)成了神經(jīng)支配后唯一存在的神經(jīng)，這進(jìn)一步驗(yàn)證了前面的光學(xué)顯微鏡結(jié)果。在對(duì)照組小鼠的Meissner 小體中，有髓鞘傳入神經(jīng)的末端被膠質(zhì)細(xì)胞板層的同心圖案所包圍，這個(gè)部位對(duì)機(jī)械壓力的感知至關(guān)重要；無髓鞘C 纖維的末端則位于這些板層墊的外緣。相比之下，在SNI 后的脛骨區(qū)域，顯示側(cè)枝生芽的無髓鞘傳入神經(jīng)纖維的多個(gè)末端散布在松散圖案的板層之間，并與板層緊密接觸；其中有一些占據(jù)板層墊的中心，這一位置在對(duì)照組小鼠中只被Aβ 纖維末端占據(jù)。

對(duì)照組和SNI 小鼠Meissner 小體的3D 高分辨率重建進(jìn)一步證實(shí)了這個(gè)發(fā)現(xiàn)：在對(duì)照組小鼠中，有髓鞘傳入神經(jīng)顯示出經(jīng)典的纏繞在整個(gè)Meissner小體上的模式，并被膠質(zhì)細(xì)胞片層完全覆蓋；而無髓鞘傳入神經(jīng)在Meissner 小體內(nèi)沒有廣泛分支，也沒有被同心圓板包圍。而在SNI 小鼠的脛骨區(qū)，在沒有Aβ 纖維末端的情況下，觀察到側(cè)枝發(fā)芽的無髓鞘傳入纖維侵入整個(gè)觸覺小體，蜿蜒到中間部位，并被神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞板層包圍。這種形態(tài)模式顯示了終末器官連接的異常，即無髓鞘傳入神經(jīng)作為Meissner 小體內(nèi)唯一傳入神經(jīng)成分，其功能可能是用于感受機(jī)械刺激后板層的物理凹陷引起的變化。

5. C-纖維觸覺響應(yīng)性發(fā)生改變

緊接著，研究了周圍神經(jīng)連接的重塑是否會(huì)使侵入去神經(jīng)組織的傷害性感受器功能發(fā)生異常。在SNI 后24 周，使用皮膚神經(jīng)標(biāo)本（包含無毛腓腸和脛骨區(qū)域）對(duì)Aβ-LTMRs 和C-纖維傷害性感受器進(jìn)行電生理記錄。在假手術(shù)組小鼠中，只有刺激腓腸區(qū)域才能引起腓腸神經(jīng)纖維的反應(yīng)；而在SNI后24 周的小鼠中，當(dāng)機(jī)械刺激脛骨區(qū)域時(shí)，腓腸神經(jīng)纖維產(chǎn)生了顯著的反應(yīng)。同時(shí)，在SNI 小鼠中，發(fā)現(xiàn)這些新獲得腓腸傳入神經(jīng)的脛骨區(qū)域內(nèi)只有傷害性感受器，而沒有Aβ-LTMRs。因此，這些數(shù)據(jù)證實(shí)了來自腓腸神經(jīng)的是傷害性感受器，而非Aβ-LTMRs。此外，通過測(cè)量C-纖維的傳導(dǎo)速度來確定其激活閾值。觀察到從SNI 小鼠的脛骨區(qū)域由機(jī)械刺激誘發(fā)的腓腸神經(jīng)C-纖維反應(yīng)與生理神經(jīng)支配的（即來自無神經(jīng)損傷小鼠的脛骨神經(jīng)C-纖維反應(yīng)）相比，其激活閾值顯著降低。這表明，側(cè)枝生芽的傷害性感受器已經(jīng)改變了其激活特性，使它們像低閾值傳入神經(jīng)一樣，對(duì)無害的機(jī)械刺激做出反應(yīng)，也表明它們?cè)诿劰菂^(qū)域的神經(jīng)再支配期間獲得了這種特性。

去神經(jīng)支配的脛骨區(qū)域的炎性環(huán)境和持續(xù)的外周敏感化可能是神經(jīng)再支配期間傷害性感受器敏感性改變的原因，但下面的觀察結(jié)果否定了這種可能性。首先，當(dāng)24 周后出現(xiàn)神經(jīng)病理性疼痛時(shí)，在脛骨區(qū)域沒有發(fā)現(xiàn)任何免疫細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞或T細(xì)胞）的聚集；其次，對(duì)經(jīng)典致敏相關(guān)介質(zhì)（如前列腺素、TRPV1 和TRPA1）的藥理抑制，或神經(jīng)生長因子 (NGF) 的分離，并沒有阻止神經(jīng)病理性痛覺超敏；最后，在SNI 后24 周的脛骨區(qū)域，通過對(duì)逆行標(biāo)記識(shí)別的側(cè)枝生芽的傷害性感受器的DRG胞體進(jìn)行無偏倚基因轉(zhuǎn)錄分析，沒有顯示關(guān)鍵敏化相關(guān)基因的調(diào)控。這些結(jié)果表明：具有其他類型疼痛特征的傷害性感受器敏化并不會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)再支配所觀察到的機(jī)械激活閾值的變化（如急性和慢性炎癥性疼痛）；然而與對(duì)照組相比，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)在側(cè)枝生芽的傷害性感受器中，表達(dá)發(fā)生變化的基因（如NGF 依賴的軸突生長、軸突路徑尋找、神經(jīng)保護(hù)和軸突存活）與結(jié)構(gòu)變化有關(guān)，從而進(jìn)一步表明了外周敏化是神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)重塑的結(jié)果。

6.傷害性感受器介導(dǎo)神經(jīng)再支配引發(fā)的疼痛

最后，使用白喉毒素 (DTX) 介導(dǎo)去神經(jīng)和不敏感區(qū)域的傷害性感受器消融，探討傷害性感受器是否與神經(jīng)再支配誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性疼痛發(fā)展有關(guān)。與消融傷害性感受器結(jié)果一致，在沒有神經(jīng)損傷(sham) 的情況下，DTX 處理的小鼠對(duì)機(jī)械vonFrey傷害刺激的基礎(chǔ)反應(yīng)性顯著降低。SNI 后，機(jī)械閾值測(cè)量顯示，傷害性感受器的消融逆轉(zhuǎn)了去神經(jīng)脛骨區(qū)域的機(jī)械性超敏反應(yīng)，但在未損傷的腓腸神經(jīng)支配區(qū)域沒有出現(xiàn)這種情況。

為了排除觀察到的表型差異是由于SNS-Cre 小鼠背根神經(jīng)節(jié)(DRG)神經(jīng)元以外的其他部位的細(xì)胞被消融所致，在SNI 后24 周將表達(dá)caspase-3 的腺相關(guān)病毒以Cre 依賴的方式直接注射到SNS-Cre 小鼠的L3-L4DRG 中，注射綠色熒光蛋白 (EGFP) 到同一部位作為對(duì)照組，與表達(dá)EGFP 的小鼠相比，caspase-3 介導(dǎo)的傷害性感受器消融完全消除了脛骨區(qū)域的機(jī)械性超敏反應(yīng)，而腓腸區(qū)的超敏反應(yīng)僅有部分短暫減輕。因此，這些發(fā)現(xiàn)最終證明，神經(jīng)再支配誘導(dǎo)的神經(jīng)病理性痛覺超敏是由傷害性感受器介導(dǎo)的。

7.小結(jié)

前期研究通過“功能喪失”或“功能獲得”的實(shí)驗(yàn)表明，Aβ 傳入神經(jīng)是誘導(dǎo)機(jī)械性痛覺超敏的必要條件和充分條件，即使在傷害性感受器被基因消融的情況下也會(huì)發(fā)生。顯然，該研究的發(fā)現(xiàn)揭示了神經(jīng)損傷后存在兩種完全不同的形式和機(jī)制，即：①傳統(tǒng)模式：是一種研究較清楚、早發(fā)性、慢性Aβ 纖維依賴的形式，由未損傷的神經(jīng)區(qū)域引起；②嶄新模式：是在神經(jīng)受損的去神經(jīng)區(qū)域、依賴傷害性感受器、遲發(fā)性地在神經(jīng)再支配過程中表現(xiàn)出來的一種新形式，而這種模式在大多數(shù)神經(jīng)病理性疼痛的臨床前工作中被忽視。因此，這項(xiàng)新發(fā)現(xiàn)填補(bǔ)了神經(jīng)病理性疼痛復(fù)雜臨床癥狀表現(xiàn)方面的長期空白。臨床上更常見的混合性神經(jīng)擠壓損傷與慢性神經(jīng)病理性疼痛有關(guān)，在研究神經(jīng)損傷引起疼痛的機(jī)制和治療時(shí)，應(yīng)結(jié)合引起痛覺超敏的這兩種形式進(jìn)行考慮。

值得注意的是，再生和慢性疼痛領(lǐng)域的研究在主流文獻(xiàn)中大多是相互獨(dú)立的，而該研究的發(fā)現(xiàn)將兩個(gè)獨(dú)立的領(lǐng)域進(jìn)行了整合，并強(qiáng)調(diào)結(jié)構(gòu)可塑性和神經(jīng)再支配過程中的錯(cuò)誤連接的重要性，為闡明神經(jīng)病理性疼痛形成機(jī)制開辟了新方向。此外，本文作者對(duì)神經(jīng)再支配過程中非典型Meissner 小體連接的超微結(jié)構(gòu)形態(tài)觀察后也提出新概念，即Meissner小體的重構(gòu)在解剖學(xué)上將輕柔觸摸與神經(jīng)病理性疼痛中的傷害性感受器激活聯(lián)系起來，本質(zhì)上是將傷害性感受器“轉(zhuǎn)換”為低閾值傳入神經(jīng)，感覺的特異性是由皮膚中專門的感官‘細(xì)胞器’的屬性決定，而不是由神經(jīng)纖維本身決定?？偟膩碚f，該研究對(duì)導(dǎo)致不同類型感覺傳入神經(jīng)出現(xiàn)錯(cuò)配的細(xì)胞和分子機(jī)制的發(fā)現(xiàn)將有助于預(yù)防或逆轉(zhuǎn)神經(jīng)損傷后的慢性神經(jīng)病理性疼痛。