王 慧，張從合，黃艷玲，汪和廷，方 玉，楊 韋，管昌紅，楊 力，王 林，嚴(yán) 志

（1安徽荃銀高科種業(yè)股份有限公司/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部雜交稻新品種創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230088；2上海中科荃銀分子育種技術(shù)有限公司，上海 200233）

0 引言

花粉是植物種質(zhì)的主要形式之一，具有豐富的遺傳多樣性[1]，在植物有性繁殖中發(fā)揮著非常重要的作用，也是植物遺傳、雜交育種和種質(zhì)資源保存工作中最重要和最基礎(chǔ)的材料。但是大部分植物花粉在離體狀態(tài)下的壽命都很短，不利于植物的遺傳研究，同時(shí)也給雜交育種和種質(zhì)資源研究工作帶來很大難度。

將植物花粉進(jìn)行集中收集，在特殊的條件下進(jìn)行花粉保存研究，延長(zhǎng)花粉壽命，對(duì)于農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)特別是提高育種進(jìn)程，克服雜交制種花期不育或花時(shí)不同步，提高土地利用率，提高機(jī)械化水平，完善種質(zhì)資源的保存等都具有非常重要的價(jià)值。花粉活力是植物正常受精結(jié)實(shí)的關(guān)鍵因素之一，花粉能否保存成功關(guān)鍵在于花粉活力的保持，1922年KNOWLTON等[2]最早報(bào)道了將金魚草花粉儲(chǔ)藏在超低溫(-180℃)后仍然具有一定的活力后，花粉保存研究日漸興起。據(jù)統(tǒng)計(jì)，國(guó)內(nèi)外對(duì)花粉不同保存方法和保存技術(shù)的研究已從最初的果樹、主要農(nóng)作物發(fā)展到園林植物、經(jīng)濟(jì)林木、藥用作物等170多種植物材料，并開展花粉活力測(cè)定方法對(duì)花粉保存效果的檢驗(yàn)，同時(shí)也有利用保存的花粉成功應(yīng)用于雜交育種研究的報(bào)道[3-11]。為了完善種質(zhì)資源保存方法及加速育種進(jìn)程，本文通過整理上述研究，闡述了影響植物花粉生活力的主要因素、花粉生活力測(cè)定方法、花粉的收集及植物花粉的主要保存方法，以期為進(jìn)一步研究不同植物花粉的長(zhǎng)期高效保存提供參考依據(jù)。

1 影響花粉生活力的主要因素

花粉的生活力通常指維持受精時(shí)間長(zhǎng)短的能力，影響花粉生活力的因素很多，植物花粉本身的基因型、花粉類型和遺傳特性決定了不同植物花粉的生活力不同；此外，溫度、濕度、光照和氣體成分等外在因素也會(huì)對(duì)花粉生活力產(chǎn)生很大影響。

1.1 花粉類型對(duì)花粉生活力的影響

花粉的類型、結(jié)構(gòu)及所含的化學(xué)物質(zhì)對(duì)花粉生活力影響較大，成熟花粉的壁內(nèi)面包含一個(gè)營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和一個(gè)生殖細(xì)胞或由生殖細(xì)胞產(chǎn)生的兩個(gè)精子。根據(jù)花粉成熟時(shí)所含的核數(shù)目，被子植物的花粉分為二核型、三核型以及兼具兩種花粉類型的混合型花粉。前人對(duì)265科植物花粉的觀察并分類得出，包括豆科、茄科、百合科、石蒜科等179科屬于二核型花粉；包括禾本科、十字花科、菊科等54科屬于三核型花粉；其余32科為混合型花粉[3,12]。

一般認(rèn)為三核型花粉活力喪失速度是二核型花粉的2倍，與二核型花粉相比壽命較短也較難保存。因此研究二核型花粉成功保存的較多[12]。關(guān)于兩類花粉壽命差異的原因較多，有分析認(rèn)為三核型比二核型多經(jīng)歷一次減數(shù)分裂，消耗了細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的淀粉、脂肪等貯藏物質(zhì)導(dǎo)致，也有認(rèn)為三核型花粉外壁較薄，所以抗外界環(huán)境如干燥等能力較差，還有認(rèn)為三核型花粉的代謝旺盛，呼吸強(qiáng)度是二核型花粉的三倍左右，因此不易保存[13]。禾本科植物中的水稻、玉米、小麥等花粉屬于三核型，而木本科植物中的蘋果、梨、桃等屬于二核型[12]。

1.2 基因型及化學(xué)成分對(duì)花粉生活力的影響

不同物種的花粉生活力差別較大，如禾本科作物的花粉生活力在離體狀態(tài)下喪失較快，水稻花粉5分鐘基本全部失去活力，高粱花粉5 h基本全部失活，小麥花粉在5 h后授粉結(jié)實(shí)率僅為6.4%，玉米花粉生活力在離體狀態(tài)下僅維持1～2天，瓜菜類植物花粉處于自然狀態(tài)下4～5 h，花粉活力也會(huì)全部喪失[14-16]。

花粉本身是富含淀粉和脂肪及某些激素的有生命的顆粒，王金祥等[17]研究得出狼尾草相比水稻玉米花粉耐儲(chǔ)藏是由于其蛋白質(zhì)含量較高、淀粉含量較低；李要民等[18]研究幾種禾本科植物花粉的生理比較表明花粉在貯藏過程中，花粉活力保存的時(shí)間長(zhǎng)短與花粉的化學(xué)成分的變化有關(guān)，花粉活力保存較短的花粉中生長(zhǎng)素、赤霉素、玉米素含量比活力保存時(shí)間長(zhǎng)的花粉高，抑制生長(zhǎng)的脫落酸含量則相對(duì)較低[19]。

同一物種不同品種間花粉生活力也有不同[20]，J.科佩等[21]研究玉米的8種不同遺傳背景之間花粉的生活力差異，通過花粉采集后置于4℃下80 min進(jìn)行體外萌發(fā)實(shí)驗(yàn)得出，8種玉米花粉的體外萌發(fā)百分比在28%～63%之間，相差兩倍多；同時(shí)研究了2種水稻基因型的花粉在相同環(huán)境下20 h后，花粉萌發(fā)率相差25倍?？梢娀蛐蛯?duì)花粉生活力影響較大。

1.3 環(huán)境因素對(duì)花粉生活力的影響

花粉生活力除受遺傳因素影響外，受環(huán)境條件特別是溫度和相對(duì)濕度的影響很大，同時(shí)，氣壓和氣體對(duì)花粉的貯藏壽命也會(huì)產(chǎn)生影響。王業(yè)遴等[22]研究表明濕度是影響桃花儲(chǔ)藏花粉生活力的主要因素，溫度次之，光照影響較小。李要民等[18]研究得出低溫高濕條件有利于禾本科作物花粉活力的保存，在低溫(5℃)高濕(80%)條件下，水稻和玉米花粉活力分別為46.4%和83.3%。J.科佩等[21]研究在減壓/減氧水平保存時(shí)，玉米花粉生活力保持時(shí)間更長(zhǎng)，玉米最佳條件是67k～84 kPa，得出如果離體花粉在低于大氣壓下的狀態(tài)下，在高濕度和低溫儲(chǔ)存期間的花粉生活力通常會(huì)得到改善。在不損傷離體花粉原生質(zhì)的前提下，保存花粉活力的有利環(huán)境是最大限度地降低花粉的代謝活性。

2 花粉生活力的測(cè)定方法

通常用染色法、離體萌發(fā)率測(cè)定法、基于微流控芯片技術(shù)檢測(cè)活力法及雜交授粉測(cè)定結(jié)實(shí)率法等檢測(cè)花粉生活力，進(jìn)行花粉生活力測(cè)定，選擇適宜的活力檢測(cè)方法顯得尤為重要。

2.1 染色法

花粉染色法主要包括I2-IK法、四唑染色法（TTC法）、聯(lián)苯胺染色法、FDA熒光染色法等[23-24]。其中I2-IK法是根據(jù)淀粉遇碘變藍(lán)的深淺程度來判斷花粉的活力，對(duì)于菊屬植物等淀粉含量低的花粉不適宜用該方法[25]，對(duì)于細(xì)胞壁厚的花粉粒該方法染色很淺，而棉花花粉則不著色[13]。四唑染色法（TTC法）是利用無色的四唑（氯化三苯基四氮唑的簡(jiǎn)稱）滲入細(xì)胞后與脫氫酶反應(yīng)后的顏色來判斷花粉活性，有生活力的花粉為紅色。胡君艷等[26]得出TTC法測(cè)得銀杏花粉的活力最接近離體萌發(fā)測(cè)的花粉活力；但是該法染色后顏色差別較小不易分辨。聯(lián)苯胺染色法主要由花粉細(xì)胞壁上的過氧化物酶將聯(lián)苯胺氧化成藍(lán)褐色，進(jìn)而判斷花粉的活性，番茄和馬鈴薯等由于花粉壁缺乏過氧化物酶，用聯(lián)苯胺不染色，禾本科作物的花粉用聯(lián)苯胺均能著色[14]。FDA熒光染色法能測(cè)試花粉中酶活性及質(zhì)膜的完整性，通過熒光染料進(jìn)入原生質(zhì)后，被醋酶作用形成一種能產(chǎn)生熒光的熒光素并根據(jù)花粉產(chǎn)生熒光的情況判斷花粉活性[27-28]，該方法可以表征油茶花粉潛在的活力[28]，目前在國(guó)內(nèi)少有報(bào)道。

2.2 離體萌發(fā)測(cè)定法

花粉離體萌發(fā)測(cè)定法是測(cè)定植物花粉活性較為直觀和準(zhǔn)確的方法，指將花粉置于特定成分的培養(yǎng)基上進(jìn)行離體培養(yǎng)，通過在顯微鏡下觀察花粉管伸長(zhǎng)的長(zhǎng)度來確定花粉活力的大小[13,29]。常用的培養(yǎng)基有液態(tài)和固態(tài)兩種，均是在一定的人工控制條件下培養(yǎng)，但離體萌發(fā)測(cè)定法應(yīng)用過程中培養(yǎng)基中礦質(zhì)元素、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及培養(yǎng)溫度和時(shí)間等萌發(fā)條件等都會(huì)影響花粉萌發(fā)率進(jìn)而影響花粉的活力[30]，胡君燕等[31]認(rèn)為固體培養(yǎng)基法比較適宜測(cè)定銀杏花粉生活力，在培養(yǎng)基中添加少量的硼和鈣對(duì)銀杏花粉萌發(fā)有一定的促進(jìn)作用。有研究表明玉米的花粉較難在培養(yǎng)基上萌發(fā)，石思信等[15]研究配制15%的蔗糖、0.01%的硼酸、0.03%的硝酸鈣、0.7%的瓊脂配制成的固體培養(yǎng)基可以是玉米花粉的萌發(fā)率達(dá)到74%。袁德義等[32]研究得出離體萌發(fā)法是山茶屬植物花粉最為理想的快速測(cè)定法。

2.3 基于微流控芯片技術(shù)檢測(cè)活力法

隨著科技的不斷發(fā)展，近年來快速測(cè)定花粉活力也會(huì)用到基于微流控芯片技術(shù)的花粉活力分析儀，主要原理是當(dāng)細(xì)胞流經(jīng)施加了高頻交流電壓的微電極，高靈敏傳感器即刻捕捉到兩電極間的阻抗變化，得到流經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量、大小、以及其他物理特征，進(jìn)而快速分析出花粉活力。該方法檢測(cè)縮短了樣品預(yù)處理的時(shí)間，無需染色、操作簡(jiǎn)單、測(cè)定快速，并且不會(huì)破壞花粉，大大節(jié)省了科研工作者的時(shí)間及勞動(dòng)支出，并可得到大量可供分析的信息和實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)。J.科佩等[21]利用花粉活力分析儀快速分析玉米、水稻等離體花粉活力。但由于活力分析儀價(jià)格昂貴而沒有被廣泛應(yīng)用。

2.4 雜交授粉測(cè)定結(jié)實(shí)率

雜交授粉測(cè)定結(jié)實(shí)率主要通過將花粉授予母本柱頭，成熟期計(jì)算母本結(jié)實(shí)率來測(cè)定花粉的生活力，是最真實(shí)也是最具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的方法，在進(jìn)行田間授粉時(shí)需要注意隔離母本花粉，防止其他花粉干擾，在進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)也要避免由于遺傳因素導(dǎo)致的不親和，該方法檢測(cè)花粉活力的時(shí)間較長(zhǎng)，也容易受到外界因素的影響。

3 花粉的采集

不同植物花粉的特性不同，花粉采集的時(shí)間、方法和季節(jié)也不同?；ǚ鄣漠a(chǎn)量和質(zhì)量除了受遺傳特性影響之外還會(huì)受到環(huán)境因素的限制[1]。CRADDOCK等[33]得出剛開裂的花藥保存花粉效果最好。梁立等[34]研究得出成熟花粉與近成熟花粉的保存效果較好，而幼嫩花粉保存效果較差。MARCHANT等[35]則認(rèn)為未開的花朵可以減少花粉污染的風(fēng)險(xiǎn)，也是可取的。通?；ǚ鄄杉x擇在晴朗的天氣，于開花盛花期采集的數(shù)量和質(zhì)量效果最好，雨天或雨后收集花藥含水量太高，導(dǎo)致花粉結(jié)團(tuán)生活力降低[29]。大多數(shù)木本科植物在中午散粉量最大，牡丹花粉根據(jù)品種特性集中在10:00—14:00采集最佳[36]，且在綻口期采集的花粉萌發(fā)率最高，采集過早，則雄蕊未完全成熟，花粉量少且積累的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足，造成花粉活力低下；采集過遲，大部分雄蕊已散粉，影響花粉采集量。禾本科植物中，水稻花粉一般在晴朗的上午10:00—11:00開花高峰期進(jìn)行采集，小麥花粉適宜在10:00—12:00和15:00—18:00采集[37]。

目前花粉采集主要分為人工采集和機(jī)械采集，人工采集花粉時(shí)間較長(zhǎng)、效率較低、采粉不均勻，且人為操作可能會(huì)使花粉活力降低較快。關(guān)于機(jī)械采集，張從合等[38-40]研究保持禾本科作物離體花粉高活力的方法及裝置，可以縮短花粉采集時(shí)間，提高花粉采集效率和花粉生活力。

4 植物花粉的主要保存方法

4.1 有機(jī)溶劑保存方法

巖波洋造等[41]得出在有機(jī)溶劑中可以儲(chǔ)藏植物花粉。獼猴桃花粉、百合屬、茶梅、鳳仙花等均可以保存在有機(jī)溶劑中[11]。劉武林等[42]證實(shí)了山茶、柳、杏等植物花粉在有機(jī)溶劑中保存的可行性，認(rèn)為選擇適宜的有機(jī)溶劑是能否應(yīng)用有機(jī)溶劑貯存花粉的關(guān)鍵。常用的有機(jī)溶劑包括醚類、苯類、酮類、醇類等等。王郁民等[43]研究獼猴桃花粉的有機(jī)溶劑保存可行性，得出花粉在二甲苯、甲苯、苯、1-戊醇、乙酸乙酯和己烷等有機(jī)溶劑中能維持較久的生活力，但需要花粉含水量適中，中華獼猴桃和美味獼猴桃在有機(jī)溶劑中保存的適宜含水量分別為8.46%和8.71%。劉國(guó)儉等[44]將山荊子、桃、山杏3種果樹新鮮干燥花粉分別浸于丙酮、苯、二甲苯和乙酸乙酯4種有機(jī)溶劑中保存1天后都具有正?；ǚ鄣氖诰芰?。至今為止，用有機(jī)溶劑長(zhǎng)期保存花粉的技術(shù)還鮮有報(bào)道。

4.2 低壓保存方法

通過提高CO2濃度，降低O2濃度有利于植物花粉的保存[11]，王金祥等[45]通過研究在不同分壓CO2和O2條件下，水稻、玉米和狼尾草花粉的活力，得出含2×104PaCO2的氣體條件有利于3種花粉的貯藏。李瑞嘉等[46]進(jìn)行杏花粉的低壓保存研究，得出在5℃±2℃和79.7 kPa的低壓環(huán)境下可有效保存花粉1年。

4.3 低溫保存方法

低溫能夠明顯的延長(zhǎng)花粉的壽命，低溫可以降低花粉呼吸強(qiáng)度和酶活性，一般來說，溫度越低，花粉保存的時(shí)間越長(zhǎng)[11]。楊帆等[47]研究得出澳洲堅(jiān)果花粉在4℃冰箱中保存30天，其萌發(fā)率仍然有10.79%。陳雅等[28]采用低溫(4℃)儲(chǔ)藏油茶“三華系列”花粉30天以上，花粉活力保持在40%～70%。胡君燕等[22]得出4℃冰箱干燥保存利于保持銀杏花粉生活力。陶麗等[48]研究澳洲堅(jiān)果花粉的儲(chǔ)藏方式，認(rèn)為4℃、濕度50%人工氣候箱貯藏花粉5天后的花粉萌發(fā)率與對(duì)照相當(dāng)，貯藏效果最好。小麥花粉在3～4℃低溫環(huán)境下保存兩周后依然有很好的授粉結(jié)實(shí)率。而張保才等[49]認(rèn)為低溫干燥法有利于保持辣椒花粉的活力，在4±1℃低溫環(huán)境下，干燥處理較未干燥處理延長(zhǎng)20天左右。

4.4 超低溫保存方法

目前普遍認(rèn)為最長(zhǎng)久保存花粉的方法是超低溫保存。1922年KNOWLTON等[2]最早報(bào)道了將金魚草花粉儲(chǔ)藏在超低溫(-180℃)后仍然具有一定的活力。江雨生等[50]首次將桃、梨4個(gè)品種的花粉在超低溫儲(chǔ)藏365天，研究花粉的授粉結(jié)實(shí)率、離體萌發(fā)率等與新鮮花粉進(jìn)行比較，均無明顯差異。王琳等[51]研究扁桃花粉可在超低溫環(huán)境下保存，且保存后仍具有較高的活力。王彩虹等[52]對(duì)杏的兩個(gè)栽培種花粉的低溫和超低溫儲(chǔ)藏進(jìn)行了研究，得出在適宜含水量下兩種溫度保存一年后花粉的授粉結(jié)實(shí)率變化不大。陳霜瑩等[53]進(jìn)行了39個(gè)樹種包括蘋果、梨和桃等花粉的超低溫保存。張金梅等[54]研究得出桃花花粉在超低溫下可保存至少4年。相關(guān)研究報(bào)道美國(guó)山核桃的花粉可超低溫保存長(zhǎng)達(dá)10年時(shí)間[55]。目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了鱷梨、巴旦木、桃、梨、杏、李、核桃、葡萄、枇杷、榆葉梅和海棠等果樹作物的花粉超低溫保存。

在農(nóng)作物花粉的研究中，石思信等[15]得出玉米花粉經(jīng)超低溫保存1～2年后授粉有結(jié)實(shí)；孫果忠等[16]研究得出花粉含水量在11.3%～14.7%范圍是玉米花粉超低溫保存成功的關(guān)鍵。胡晉等[14]研究水稻花粉超低溫保存7天后依然有一定的活力，得出花粉含水量在9.11%和13.24%含水量較適宜水稻恢復(fù)系花粉的超低溫保存。張保才等[49]將辣椒花粉在超低溫貯藏1年后仍具有較高的花粉生活力。李秉玲等[56]研究17個(gè)芍藥品種花粉超低溫保存方法，得出花粉在經(jīng)超低溫保存4年后仍具有較高的萌發(fā)率，用其授粉可獲得種子。常維霞等[57]得出山茶屬3種植物茶梅、攸縣油茶及多齒紅山茶花藥花粉經(jīng)超低溫保存半年后仍具較高的活力，甚至超過保存前的水平。已見報(bào)道的農(nóng)作物花粉超低溫保存研究還涉及瓜菜、經(jīng)濟(jì)作物、藥用植物和牧草等幾大類物種，包括洋蔥、芹菜、橄欖型油菜、番茄等蔬菜作物；杜仲、鵝掌楸等經(jīng)濟(jì)林木；魔芋、甘蔗、茶樹、諸葛菜、人參、西洋參、枸杞等藥用植物；象草、無芒麥草、等牧草[1,3-10]。

5 展望

近年來，隨著分子生物學(xué)和多學(xué)科交叉研究技術(shù)的迅速發(fā)展，花粉保存技術(shù)的研究也在不斷深入?？蒲泄ぷ髡咔捌趯?duì)植物花粉進(jìn)行了大量研究，特別是在花粉保存方法和技術(shù)程序方面取得了很好的效果，但是依然存在一些問題：

（1）植物花粉不同的保存方法的保存機(jī)理研究較少。花粉生活力在保存前后的改變與花粉膜透性、細(xì)胞內(nèi)含物質(zhì)、植物抗氧化酶系統(tǒng)等之間的關(guān)系研究還不夠深入，花粉保存機(jī)理研究相對(duì)較少，關(guān)于花粉細(xì)胞學(xué)方面的研究報(bào)道較少。

（2）不同保存方法保存花粉后生活力的保障是關(guān)鍵。花粉經(jīng)過保存后是否保持其原有的生活力是判斷花粉保存方法是否有效的主要衡量指標(biāo)，目前大多數(shù)花粉活力通過花粉萌發(fā)率來判斷，但是能夠萌發(fā)的花粉有的活力較低，在雜交授粉時(shí)不一定能夠結(jié)實(shí)，故花粉萌發(fā)率不能真實(shí)的反映花粉的生活力。而通過染色法檢測(cè)花粉生活力的方法快速簡(jiǎn)單，主要靠人為觀察顏色，有時(shí)受到花粉顏色的干擾存在一定的誤差，也不能很精準(zhǔn)的判斷出花粉生活力。因此為了更好的研究不同物種花粉的適宜保存方法和效果，花粉生活力的判斷不僅要結(jié)合離體萌發(fā)率測(cè)定，也需要結(jié)合人工授粉結(jié)實(shí)率來計(jì)算。

（3）超低溫保存技術(shù)是進(jìn)行種質(zhì)資源保存的一條重要途徑，也將成為花粉保存和研究的重要方向。目前超低溫保存花粉技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于農(nóng)作物、瓜菜、藥用植物、木本科植物等多種植物中，具有較大的應(yīng)用價(jià)值，但是多數(shù)集中在花粉適宜含水量、花粉復(fù)蘇方式等研究上，而關(guān)于超低溫保存植物花粉的一套標(biāo)準(zhǔn)操作流程尚未建立[29]，且關(guān)于花粉保存前后的生理生化研究及保存后遺傳穩(wěn)定性研究也相對(duì)較少。

花粉的長(zhǎng)期保存具有重大的應(yīng)用潛力，尤其解決雜交制種過程中花期不遇、花時(shí)不同步、制種用工難、機(jī)械化程度低、提高制種產(chǎn)量、父本知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)以及瀕危植物種質(zhì)資源保護(hù)等方面都發(fā)揮著巨大作用。