周錦燕，張 蕓，劉良燕，阮流洋，張 慧，曾千春

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，昆明 650201）

0 引言

‘紫加1號’源于云南省哀牢山南麓墨江縣境內(nèi)的野生刺五加(Acanthopanax senticosus)，由本課題組選育（云林園植新登第20220011號，云南省林業(yè)和草原局園藝植物新品種登記http://lcj.yn.gov.cn/html/2021/gongshigonggao_1209/64776.html），為五加科五加屬多年生常綠植物，可作為特色木本蔬菜，因其幼嫩莖葉為灰紫色，花色苷含量高而得名[1]?！霞?號’幼嫩莖葉可食用、生津回甘，少了普通刺五加的苦味。其根可入藥，具有生津止渴、安神補(bǔ)腦、提高免疫力的功效，其嫩莖葉富含蛋白質(zhì)、纖維素、維生素，是一種高鉀、高鈣、高鎂、低鈉的養(yǎng)生蔬菜[2]?；ㄉ赵谧匀唤缰写嬖趶V泛，作為天然色素和抗氧化添加劑[3]，不像具有一定毒性的合成色素，花色苷作為天然抗氧化劑更加綠色、健康，將其添加到食品中，會延長食品的保質(zhì)期，減少食品內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的氧化[4]，保護(hù)人體免受自由基的損傷，增加細(xì)胞對氧自由基的吸收、增強(qiáng)一些天然抗氧化酶活性[5]，是抗氧領(lǐng)域的研究熱點。

花色苷(Anthocyanin)是花色素(Anthocyanidin)與糖以糖苷鍵結(jié)合而成的一類化合物[6]，主要存在于植物花瓣及果實中的天然水溶性色素，屬黃酮類多酚化合物[7]?；ㄉ战Y(jié)構(gòu)中的酚羥基是賦予其抗氧化性的基礎(chǔ)[8]，其分子結(jié)構(gòu)中存在的酸性和堿性基團(tuán)具有高度共軛關(guān)系，因此，用酸性的提取劑來提取效果較好。天然色素的提取方法常用的有微波輔助提取法、超聲波輔助提取法、酶提取法和有機(jī)溶劑提取法等。微波提取設(shè)備昂貴，僅限于實驗研究；超聲波在提取過程中噪聲大，功率過高會破壞花色苷的結(jié)構(gòu)[9]；酶輔助提取在酶解時間長、成本高，易生成新物質(zhì)，從而增加分離純化難度[10]；目前溶劑浸提法提取色素中，以酸化的乙醇提取法最為常用，具有提取條件溫和，操作簡單以及節(jié)能環(huán)保等特點，已廣泛用于植物色素的提取。

本試驗以‘紫加1號’嫩莖葉為材料，采用溶劑浸提法提取其嫩莖葉的花色苷，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用正交試驗優(yōu)化提取工藝。以Vc為對照，研究所提取花色苷對·OH、O2-·和DPPH自由基的清除效果，明確其抗氧化活性，為‘紫加1號’的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

材料與試劑：‘紫加1號’嫩莖葉來源于云南省墨江縣，為其枝條頂端7～15 cm幼嫩部分，70℃烘干至恒重，揉碎，分裝于自封袋中，常溫干燥環(huán)境下避光保存?zhèn)溆?。無水乙醇（分析純）、鹽酸（分析純）、維生素C(Vc)、水楊酸、Tris、硫酸亞鐵等均為國產(chǎn)分析純，花青素/總花色苷試劑盒購自于蘇州格銳思生物科技有限公司。試驗在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省高校作物種質(zhì)創(chuàng)新與可持續(xù)利用重點實驗室，于2021年5月—2022年1月份完成。

儀器：HH-S數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州翔天實驗儀器廠）、電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海-恒科技有限公司）、真空冷凍干燥機(jī)（北京博勱行儀器有限公司）、UV-6100S紫外可見光光度計（上海元析儀器有限公司）。

1.2 花色苷的提取

1.2.1 單因素試驗

（1）浸提時間對提取率的影響。稱取試驗材料0.5 g于錐形瓶中，先用pH為2.0的45%乙醇浸泡1.0 h，料液比定為1:70 g/mL，提取次數(shù)為1次，然后在45℃的條件下分別提取1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 h，濾液于4℃，12000 r/min離心10 min，取上清。

（2）浸提溫度對提取率的影響。稱取試驗材料0.5 g于錐形瓶中，先用pH為2.0的45%乙醇浸泡1.0 h，料液比定為1:70 g/mL，提取次數(shù)為1次，然后在溫度為35℃、40℃、45℃、50℃和55℃的條件下提取2.5 h，濾液于4℃，12000 r/min離心10 min，取上清。

（3）料液比對提取率的影響。稱取試驗材料0.5 g于錐形瓶中，先用pH為2.0的45%乙醇浸泡1.0 h，提取次數(shù)為1次，在料液比為1:80 g/mL、1:90 g/mL、1:100 g/mL、1:110 g/mL和1:120 g/mL的條件下以45℃的溫度提取2.5 h，濾液減壓濃縮后，于4℃，12000 r/min離心10 min，取上清。

（4）乙醇濃度對提取率的影響。稱取試驗材料0.5 g于錐形瓶中，用pH為2.0的35%、45%、55%、65%和75%乙醇浸泡1.0 h，料液比定為1:70 g/mL，提取次數(shù)為1次，在45℃的溫度下提取2.5 h，濾液于4℃，12000 r/min離心10 min，取上清。

（5）提取次數(shù)對提取率的影響。稱取試驗材料0.5 g于錐形瓶中，先用pH為2.0的45%乙醇浸泡1.0 h，料液比定為1:70 g/mL，在提取次數(shù)為1次、2次、3次、4次和5次的條件下，以45℃的溫度每次提取2.5 h，合并濾液減壓濃縮，4℃，12000 r/min離心10 min，取上清。

1.2.2 正交試驗 在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用正交試驗L16(35)對提取工藝進(jìn)行優(yōu)化。浸提時間、浸提溫度、乙醇濃度、料液比、提取次數(shù)為自變量，最優(yōu)水平兩側(cè)各取1個水平，以提取率作為試驗指標(biāo)，每組重復(fù)讀數(shù)3次，求平均值。設(shè)計方案見表1。

表1 ‘紫加1號’花色苷提取正交試驗因素和水平

1.2.3 驗證試驗 稱取試驗材料0.5 g于錐形瓶中，在正交試驗所得的最優(yōu)組合下提取花色苷，與正交表中提取率最高組合進(jìn)行比較，檢驗最優(yōu)組合的穩(wěn)定性。

1.3 花色苷提取率測定

采用pH示差法進(jìn)行花色苷含量的測定，參考文獻(xiàn)[11]并稍作改動，花色苷的顏色隨pH值的改變而改變，而干擾物質(zhì)的特征光譜不隨pH的改變而變化。結(jié)合朗伯比耳定律可得出，在2個不同pH下，花色苷溶液吸光值的差值與花青素的含量成比例，參考T Fuleki的經(jīng)驗公式計算出花色苷含量[12]。取上清液200 μL，分別加入pH 1.0和pH 4.5的緩沖液600 μL，平衡60 min，于530 nm和700 nm下測定其吸光度值，平行測定3次，以下公式計算花色苷的含量。

式中：ε：矢車菊-3-葡萄糖苷消光系數(shù)，26900L/(mol·cm)；Mr：矢車菊素-3-葡萄糖苷分子量，449.2；d為光程，1 cm；D：稀釋倍數(shù)，本試驗取1；V：樣本提取液，mL；W：樣本重量，g；V1：檢測操作表里上清液加樣體積，mL；V2：檢測總體積，L。

1.4 ‘紫加1號’花色苷的抗氧化活性分析

1.4.1 羥基自由基清除活性的測定 采用水楊酸法來測定花色苷對羥基自由基(·OH)清除能力，參考文獻(xiàn)[13]并稍加修改。將提取的花色苷溶液凍干后稱取適量溶于純水，配制成不同質(zhì)量濃度(0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5)mg/mL的溶液，分別吸取2 mL于試管中，加入9 mmol/L的硫酸亞鐵溶液和8.8 mmol/L過氧化氫溶液(3%，v/v)各1 mL，搖勻后加入9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1 mL，混合溶液于37℃的條件下反應(yīng)1.0 h后，在波長為510 nm處測定吸光度，以純水和相同濃度的Vc溶液分別為空白對照組和陽性對照組。

對·OH的清除能力按下式計算：

式中，A1：樣品溶液被純水替代的A值；A2：加入樣品溶液的A值；A3：不加過氧化氫溶液的A值。

1.4.2 超氧陰離子自由基清除活性測定 采用鄰苯三酚自氧化法測定花色苷對超氧陰離子自由基(O2-·)的清除能力，參考文獻(xiàn)[14]并稍加修改。將提取的花色苷溶液凍干后稱取適量溶于純水，配制成不同質(zhì)量濃度(0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.2)mg/mL的溶液，分別吸取2 mL于試管中，加入50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 8.2)4.5 mL，25℃的條件下反應(yīng)20 min，在相同溫度條件下立即加入25 mmol/L鄰苯三酚溶液0.5 mL，反應(yīng)5 min后，加入10 mmol/L HCl溶液1 mL終止反應(yīng)，于325 nm處測定反應(yīng)產(chǎn)物的吸光度。以相同濃度的Vc作陽性對照，10 mmol/L HCl作空白對照。

對O2-·的清除能力按下列公式計算：

式中：A1：樣品溶液被純水替代的吸光度；A2：加入樣品溶液的吸光度；A3：鄰苯三酚溶液被純水代替的吸光度。

1.4.3 DPPH自由基清除活性測定 測定花色苷對DPPH自由基的清除[15-16]，將提取的花色苷溶液凍干后稱取適量溶于純水，配置成不同質(zhì)量濃度(0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5)mg/mL的溶液，分別吸取2 mL于試管中，加入2 mmol/L的DPPH-無水乙醇溶液2 mL，25℃避光條件下放置30 min，在波長為517 nm的條件下測吸光度。以相同濃度的Vc溶液作陽性對照，純水做空白對照。

對DPPH的清除能力計算公式如下：

式中：A0：樣本被純水代替的吸光度；A1：樣本與DPPH·無水乙醇溶液混合吸光度；A2：DPPH-無水乙醇溶液被純水代替的吸光度。

1.5 數(shù)據(jù)處理

Excel 2010和SPSS 2012進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計、繪圖等處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 浸提時間對花色苷提取率的影響 浸提時間對花色苷提取率的影響見圖1，在浸提時間為1.5～2.5 h時，隨著時間的延長，花色苷的提取率不斷增加，在浸提時間為2.5 h時達(dá)到峰值，在2.5～3.5 h隨著提取時間的增加，花色苷的提取率反而降低，原因可能是長時間的提取，花色苷的溶出率已達(dá)到最大，但由于光照、溫度等外界因素的影響，導(dǎo)致花色苷發(fā)生降解，提取率隨之降低。考慮到節(jié)能以及后續(xù)的實驗操作，因此，選擇浸提時間為2.5 h時最佳。

圖1 浸提時間對花色苷提取率的影響

2.1.2 浸提溫度對花色苷提取率的影響 浸提溫度對花色苷提取率的影響見圖2，當(dāng)浸提溫度為35～45℃時，隨著溫度的不斷升高，花色苷的溶出率不斷增加，在溫度為45℃時達(dá)到最大值。在45℃之后，花色苷的提取率會隨著溫度的升高而降低，這說明適當(dāng)提高溫度有助于花色苷的提取率，但是隨著溫度過高，花色苷的分子結(jié)構(gòu)遭到破壞，從而使提取率降低[17]。因此，浸提溫度控制在45℃為宜。

圖2 浸提溫度對花色苷提取率的影響

2.1.3 料液比對花色苷提取率的影響 料液比對花色苷提取率的影響見圖3，當(dāng)料液比為1:80～1:100 g/mL時，花色苷的提取率不斷增長，原因可能是花色苷是極性很強(qiáng)的物質(zhì)，增加料液比可以擴(kuò)大料液接觸面積并加速花色苷的擴(kuò)散。隨著料液比的增加，花色苷提取率呈現(xiàn)增加后減小的趨勢，原因可能是料液比增加時相同溫度下需加熱更多液體，所以材料內(nèi)部升溫緩慢，導(dǎo)致花色苷溶出緩慢，提取率降低。因此，花色苷提取時料液比控制在1:100 g/mL為宜。

圖3 料液比對花色苷提取率的影響

2.1.4 乙醇濃度對花色苷提取率的影響 乙醇濃度對花色苷提取率的影響見圖4，當(dāng)乙醇濃度為35%～55%時，隨著乙醇濃度的增加，花色苷的提取率不斷升高，在濃度為55%時達(dá)到峰值。在乙醇濃度為55%～65%時，隨著乙醇濃度的增加，花色苷提取率反而降低，原因可能是花色苷為極性物質(zhì)，乙醇濃度增大可加快花色苷的溶解，隨著乙醇濃度不斷增加，導(dǎo)致材料中的非極性分子溶出[18]，從而影響花色苷的提取率。因此，應(yīng)選擇乙醇濃度為55%時最佳。

圖4 乙醇濃度對花色苷提取率的影響

2.1.5 提取次數(shù)對花色苷提取率的影響 提取次數(shù)對花色苷提取率的影響見圖5，在提取3次時得到花色苷提取率最大，隨著提取次數(shù)的增多，提取率不斷下降，原因可能是隨著次數(shù)的增加材料中的其它物質(zhì)溶出，導(dǎo)致提取率降低，應(yīng)選用提取3次為宜。

圖5 提取次數(shù)對花色苷提取率的影響

2.2 正交試驗結(jié)果

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選用浸提時間(A)、浸提溫度(B)、料液比(C)、乙醇濃度(D)、提取次數(shù)(E)為影響因素，花色苷提取率作為評價指標(biāo)，正交試驗優(yōu)化提取工藝，利用極差分析確定花色苷最佳提取工藝條件。結(jié)果見表2。

表2 ‘紫加1號’花色苷提取的正交試驗設(shè)計及結(jié)果

續(xù)表2

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗優(yōu)化結(jié)果表明，根據(jù)R值，各提取因素對花色苷提取率的影響順序為E＞D＞B＞C＞A，即提取次數(shù)＞乙醇濃度＞料液比＞浸提溫度＞浸提時間。提取次數(shù)為提高提取率的重要決定因素，其最佳水平的提取條件為A2B3C2D2E1，即浸提時間2.5 h、浸提溫度為50℃、料液比為1:100 g/mL、乙醇濃度為55%、提取2次。

2.3 驗證試驗

根據(jù)正交試驗所得的最優(yōu)組合A2B3C2D2E1與正交表中結(jié)果最高組合A2B1C1D3E2進(jìn)行比較，經(jīng)過3次重復(fù)后得到優(yōu)化組合中花色苷提取率為62.34 mg/100g接近正交表中56.23 mg/100g，說明該結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.4 ‘紫加1號’花色苷的抗氧化活性

2.4.1 羥基自由基的清除活性 羥基自由基是具有極強(qiáng)得電子能力的活性氧，能夠?qū)е录?xì)胞內(nèi)生物大分子遭受損傷、壞死或突變等[19]。如圖6所示，花色苷對·OH的清除率隨著花色苷濃度的增加而增加，當(dāng)濃度達(dá)到2.5 mg/mL時對·OH的清除率達(dá)到95.68%，接近Vc的清除效果，花色苷和Vc的IC50分別為0.488 mg/mL和0.068 mg/mL，由此推測，花色苷中可能含有能夠提供電子的化合物從而抑制·OH的產(chǎn)生。

圖6 花色苷和Vc對·OH的清除活性

2.4.2 超氧自由基的清除活性 超氧自由基(O2-·)是生物體代謝過程中產(chǎn)生的，它能攻擊生物大分子，使其交聯(lián)或斷裂，從而破壞生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[20]。如圖7所示，隨著花色苷濃度的增加，O2-·的清除率也不斷增加，當(dāng)花色苷濃度在0.5～1.2 mg/mL時，O2-·的清除率從10.87%增長至92.19%，并且花色苷濃度為1.2 mg/mL時與Vc的清除能力相當(dāng)，花色苷和Vc的IC50分別為0.764 mg/mL和0.096 mg/mL，表明花色苷對O2-·具有良好的清除能力。

圖7 花色苷和Vc對O2-·的清除活性

2.4.3 DPPH自由基的清除活性 DPPH自由基是存在孤對電子的穩(wěn)定自由基，可從抗氧化劑中獲取電子或氫自由基進(jìn)行配對，爭奪人體正常細(xì)胞蛋白，從而使健康細(xì)胞發(fā)生畸變，誘發(fā)各種疾病，加速機(jī)體衰老，當(dāng)自由基清除劑存在時，DPPH溶液由深紫色變?yōu)榈S色，在517 nm下吸光度變低，吸光度的變化與接受電子數(shù)量成定量關(guān)系，因而可對抗氧化能力進(jìn)行分析[21]。如圖8所示，花色苷對DPPH自由基具有呈劑量依賴性的清除效果，當(dāng)質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時花色苷和Vc對DPPH自由基的清除率分別為86.36%和96.22%，其IC50為0.032 mg/mL。表明花色苷對DPPH自由基具有一定的清除能力，但低于陽性對照Vc。

圖8 花色苷和Vc對DPPH自由基的清除活性

3 討論

本研究采用浸提法提取花色苷，酸化的乙醇能有效的降低花色苷分解速率，提高溶出率，有效避免雜質(zhì)的干擾，易回收，減少環(huán)境污染。這與蘇成付等[22]的酸化乙醇作為提取溶劑提取轉(zhuǎn)心烏馬鈴薯花青素工藝上有相似之處。采用正交試驗優(yōu)化提取工藝，能夠合理安排試驗，減少試驗次數(shù)，最大限度減少試驗誤差。本研究在最佳工藝下得到花色苷含量為62.34 mg/100g高于許忠等[23]從紫五加制品（紫五加茶）中測得的花色苷含量42.20 mg/100g和管穎等[24]從紫五加嫩莖葉鮮樣中得到的花色苷23.38 mg/100g，原因可能是花色苷含量易受溫度和光照等外界環(huán)境影響，不同采摘時期和含水量對花色苷的含量也會有影響。通過溶劑浸提法提取‘紫加1號’花色苷在一定程度上能夠提高花色苷提取率，但對材料的充分提取還有提升空間，采用新技術(shù)提高花色苷提取率有待進(jìn)一步研究。

生物體在代謝過程中會產(chǎn)生大量的活性氧自由基，這些自由基具有極強(qiáng)得電子的能力，它能攻擊生物大分子，破壞生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，從而誘發(fā)各種疾病[25]。植物所含的活性成分是天然抗氧化劑的主要來源，其中花色苷的抗氧化活性十分明顯[26]?！霞?號’花色苷對·OH和O2-·均具有清除活性，與劉金文等[27]研究刺五加果花青素的自由基清除活性相似，但是‘紫加1號’花色苷和刺五加果花青素對·OH清除活性差異較大，原因可能是‘紫加1號’嫩莖葉中具有抗氧化活性的多糖、皂苷等物質(zhì)[28-29]‘；紫加1號’花色苷清除DPPH自由基的IC50值0.032 mg/mL低于管穎等[24]報道的紫五加超微粉花色苷的IC50值0.111 mg/mL，原因可能是紫五加嫩莖葉烘干溫度為95℃，而花色苷在高溫的條件下可能會導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)改變，并且在制作超微粉的過程中，pH、溫度和水分等因素對花色苷含量造成影響[30]，從而抗氧化作用有所差異。本研究中‘紫加1號’花色苷對·OH、O2·-和DPPH自由基的清除效果較好，且呈濃度依賴性，說明‘紫加1號’花色苷有作為天然抗氧化劑應(yīng)用于食品、保健品和化妝品等行業(yè)的潛力，但并未探討其分子機(jī)制，同時應(yīng)進(jìn)行動物實驗，加強(qiáng)對體內(nèi)抗氧化活性的關(guān)注。

4 結(jié)論

提取‘紫加1號’花色苷的最佳參數(shù)為2.5 h、50℃、料液比1:100g/mL、乙醇濃度55%、提取2次，依此條件得到的提取率為62.34 mg/100g，與實際值56.23 mg/100g相近，該法適用于其他植物花色苷提取。

體外抗氧化試驗表明，‘紫加1號’花色苷對·OH、O2-·和DPPH自由基的IC50值依次為0.488 mg/mL、0.764 mg/mL和0.032 mg/mL，說明‘紫加1號’花色苷具有一定的抗氧化活性，為進(jìn)一步開發(fā)利用‘紫加1號’奠定一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。