桑燕菲，楊立，錢鑫萍，姜紹通,3，陸劍鋒,3,4，林琳,3,4*

（1.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽合肥 230601）（2.安徽富煌三珍食品集團(tuán)有限公司，安徽巢湖 238000）（3.安徽省農(nóng)產(chǎn)品精深加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230601） （4.農(nóng)產(chǎn)品生物化工教育部工程研究中心，安徽合肥 230601）

小龍蝦，學(xué)名克氏原螯蝦（Procambarusclarkii），最近十幾年已成為我國(guó)淡水蝦類中的一種重要資源。2020年和2019年我國(guó)小龍蝦產(chǎn)量分別239.37萬t和208.96萬t，與2018年相比，分別增加了46.07%和27.52%[1]。小龍蝦養(yǎng)殖量的快速增長(zhǎng)，為小龍蝦加工提供了充足的原料，2020年我國(guó)小龍蝦總加工量為5.66萬t，較2019年增加了11.01%[1]。新鮮小龍蝦營(yíng)養(yǎng)豐富且水分含量高，容易腐敗變質(zhì)且季節(jié)性很強(qiáng)，市場(chǎng)價(jià)格隨季節(jié)呈巨大波動(dòng)。目前小龍蝦多以鮮銷或冷凍粗加工為主，產(chǎn)品主要有蝦仁、整蝦、蝦尾等，附加值低，導(dǎo)致加工企業(yè)效益較低，與小龍蝦養(yǎng)殖量的快速增長(zhǎng)不匹配。

冷凍加工和貯藏在食品工業(yè)中普遍應(yīng)用，成本較低、效果好。在冷凍過程中，冷凍速度和溫度直接影響冰晶大小和數(shù)量以及冰晶在細(xì)胞和細(xì)胞間的分布。凍藏過程中的蝦肉質(zhì)量下降主要是冰晶的升華和重結(jié)晶的形成，引起蛋白質(zhì)的氧化、變性，表現(xiàn)為蝦肉脫水、質(zhì)量損失、變硬、微生物污染、風(fēng)味變壞和自溶等[2]。水產(chǎn)品在冷凍貯藏過程中受到溫度變化的影響，會(huì)發(fā)生生化反應(yīng)，如氨基酸側(cè)鏈殘基的修飾、巰基的氧化、細(xì)胞質(zhì)的濃度增加等[3]，這些將導(dǎo)致產(chǎn)品的脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的氧化或變性[4]，而這些變化一般會(huì)隨著冷凍貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)而加劇。最近關(guān)于新鮮小龍蝦冷凍的研究表明，冷凍和儲(chǔ)存的溫差以及冷凍速度都對(duì)小龍蝦產(chǎn)品的最終質(zhì)量有影響。實(shí)驗(yàn)室先前的工作也發(fā)現(xiàn)了小龍蝦短期凍藏過程中蛋白質(zhì)的氧化，腐敗以及質(zhì)構(gòu)的變差[4]。在實(shí)際生產(chǎn)過程中，原料供給、加工能力、市場(chǎng)銷售以及疫情等突發(fā)事件會(huì)不同程度延長(zhǎng)小龍蝦的冷凍貯藏時(shí)間，而長(zhǎng)期凍藏過程中水產(chǎn)蛋白的變化目前研究較少。本論文研究了鮮活與蒸煮預(yù)加工后的小龍蝦，在48周（1年左右）冷凍貯藏過程中蝦肉蛋白質(zhì)相關(guān)指標(biāo)的變化情況，并初步探討凍藏期間的蝦肉肉質(zhì)改變及蛋白冷凍變性機(jī)理，為小龍蝦的加工和貯藏提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市售鮮活小龍蝦，產(chǎn)區(qū)為江蘇省泗洪縣，?；钸\(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。

鹽酸、三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸、EDTA、1,1,3,3-四乙氧基丙烷、硼酸、氧化鎂、溴酚藍(lán)、考馬斯亮藍(lán)、冰醋酸、甲醇、戊二醛、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、無水乙醇等，均為分析純；總巰基含量檢測(cè)試劑盒，羰基含量試劑盒，購自Solarbio公司；HEPES體系預(yù)制膠C621104，5x上樣緩沖液（含少量DTT），購自生工生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FJ-200高速分散均質(zhì)機(jī)，上海標(biāo)本模型廠；K9840自動(dòng)凱氏定氮儀，山東海能科學(xué)儀器有限公司；CT15RT臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)，上海天美生化儀器設(shè)備工程有限公司；JEM1400透射電鏡，日本電子；TA-XT plus物性儀，英國(guó)Stable Micro System公司；Epoch全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀，BioTek Instruments；Nicolet 6700傅里葉紅外光譜儀，美國(guó)Thermoelectric Group。

1.3 樣品處理

選取新鮮小龍蝦，體質(zhì)量（30.00±5.00）g/只，隨機(jī)分為兩組（每組350只）：鮮活蝦直接冷凍組（FX）和蒸煮預(yù)處理后冷凍組（FS），冷凍溫度-18 ℃。FX組直接將鮮活蝦清洗后瀝干表面水分，裝入包裝袋置于-18 ℃冰箱冷凍貯藏；FS組將活蝦清洗后，置于沸水中煮制4 min，流水冷卻至室溫，瀝干表面水分，放入冰箱凍藏。定時(shí)取樣品檢測(cè)，通過實(shí)驗(yàn)室之前的工作[4]，發(fā)現(xiàn)短期凍藏蝦肉變化較快。故而本次試驗(yàn)前期檢測(cè)更為頻繁，而后檢測(cè)間隔逐步拉長(zhǎng)。檢測(cè)時(shí)，將蝦肉流水解凍后去頭、去蝦線，取蝦肉測(cè)定各指標(biāo)。

1.4 指標(biāo)測(cè)定

1.4.1 揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）

TVB-N測(cè)定參照GB 5009.228-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中揮發(fā)性鹽基氮》[5]的測(cè)定進(jìn)行。

1.4.2 肌肉微觀結(jié)構(gòu)觀察

使用蘇木精-伊紅染色（H&E）和透射電鏡（TEM）來比較和評(píng)估凍藏過程中小龍蝦肌肉組織的微觀結(jié)構(gòu)變化。H&E染色是根據(jù)Davidovich等[6]的方法進(jìn)行的，TEM參考Alvarez-Cirerol等[7]的方法進(jìn)行。

1.4.3 質(zhì)構(gòu)

參照江楊陽[8]的方法。取小龍蝦蝦尾的2~3節(jié)，將其切割成8 mm×8 mm×6 mm的方塊，用物性儀對(duì)樣品的TPA指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。參數(shù)設(shè)定為：觸發(fā)類型Auto（自動(dòng)）、測(cè)試速率為1 mm/s、返回速率為1 mm/s、測(cè)試形變量50%、觸發(fā)力5 g，兩次壓縮之間的停留時(shí)間為5 s。使用不銹鋼P(yáng)/36R圓柱形壓縮探頭。每個(gè)樣品做6次重復(fù)，記錄硬度、彈性、咀嚼性、內(nèi)聚力。

1.4.4 SDS-PAGE電泳

參考江楊陽[8]的方法。

1.4.5 硫代巴比妥酸值（TBARS）

參照GB 5009.181-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中丙二醛的測(cè)定》[9]執(zhí)行，TBARS值以每千克脂質(zhì)氧化樣品溶液中丙二醛（MDA）的質(zhì)量表示（mg/kg）。

1.4.6 羰基含量測(cè)定

稱取約0.4 g蝦肉，加入4 mL試劑盒內(nèi)蛋白提取液，充分勻漿后于4 ℃，5 000 r/min離心10 min，取上清，采用試劑盒給定方法測(cè)定。

1.4.7 表面疏水度測(cè)定

參考Park等[10]的方法。向小龍蝦蝦肉糜中加入4倍體積蛋白提取液（0.1 mol/L NaCl、0.002 mol/L MgCl2、0.001 mol/L EDTA-2Na、0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH值7.0），11 000 r/min勻漿25 s，4 ℃、 5 000 r/min離心15 min，棄上清液，留沉淀，再加入蛋白提取液重復(fù)上述操作2次得粗蛋白。將所得粗蛋白與4倍體積0.1 mol/L NaCl溶液混合，勻漿25 s，4 ℃、5 000 r/min離心15 min，棄上清液，留沉淀，再加入NaCl溶液重復(fù)上述操作2次，沉淀即為小龍蝦蝦肌原纖維蛋白分散液。用適量0.6 mol/L NaCl溶解蛋白，過濾，取濾液。采用雙縮脲法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品。

參考Chelh等[11]的方法。向1 mL肌原纖維蛋白分散液（5 mg/mL）中加入200 μL 1 mg/mL溴酚藍(lán)（Bromophenol Blue，BPB）（去離子水溶解）。空白組用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH值6.0）替代。室溫下充分振蕩10 min，5 000 r/min離心15 min。取上清液稀釋10倍后在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度A。疏水性用BPB結(jié)合量表示，計(jì)算如下式所示。

式中：

B——BPB結(jié)合量，μg；

A0——空白組在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)得的吸光度；

A1——樣品組在595 nm波長(zhǎng)處測(cè)得的吸光度。

1.4.8 傅立葉紅外光譜

參考Kaewprachu等[12]的方法。先將蝦肉樣品冷凍干燥，研磨成粉末，然后使用壓片機(jī)將其壓在透明載玻片上，并放置在ATR晶體的表面。消除背景干擾后，收集了400~4 000 cm-1之間的光譜，4 cm-1分辨率下掃描32次。測(cè)試后，對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行傅立葉去卷積，并使用多重高斯曲線擬合及二階導(dǎo)數(shù)計(jì)算。根據(jù)其相應(yīng)峰的面積的相對(duì)百分比，計(jì)算不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的組成。使用軟件OMNIC 8.2.0.387分析圖譜。

1.4.9 總巰基含量

稱取約0.5 g蝦肉，制備成10%的勻漿，8 000g常溫離心10 min，取上清液，按試劑盒微量法進(jìn)行測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)分析

每組試驗(yàn)至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，質(zhì)構(gòu)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，用Microsoft Excel 2019和Graphpad Prism 8進(jìn)行數(shù)據(jù)分析、繪圖和Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 凍藏期間小龍蝦蝦肉揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）的變化

TVB-N是蛋白質(zhì)在酶和微生物的作用下被分解產(chǎn)生氨類堿性含氮揮發(fā)性物質(zhì)，可用于評(píng)價(jià)水產(chǎn)品新鮮度[8]。如圖1，F(xiàn)X組和FS組的蝦肉TVB-N值在冷凍貯藏期間均呈逐漸增長(zhǎng)的趨勢(shì)。FX和FS組蝦肉凍藏48周時(shí)的TVB-N值分別為22.93和11.90 mg/100 g，均未超過我國(guó)的水產(chǎn)品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)30 mg/100 g的限 量[13]，仍可安全食用。整個(gè)貯藏期內(nèi)，F(xiàn)X組與FS組小龍蝦的TVB-N值，分別上升332%和62.57%。FS組增幅更小，是因?yàn)樾↓埼r經(jīng)熱燙預(yù)處理后能夠有效地殺死一定量微生物，進(jìn)而減緩蛋白質(zhì)被破壞速率[14]。

圖1 小龍蝦凍藏過程中揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）含量的變化Fig.1 The change of total volatile basic nitrogen (TVB-N) content during the frozen storage of crayfish

2.2 凍藏期間小龍蝦蝦肉微觀結(jié)構(gòu)變化

從蝦肉組織切片的HE染色圖和TEM圖（圖2）可以看出，新鮮蝦肉（X0）的肌絲緊密，肌絲間隔小，肌節(jié)結(jié)構(gòu)清晰，Z線、M線完整。經(jīng)煮制后的蝦肉（S0）肌節(jié)排列紊亂，融合，Z線、M線消失，結(jié)構(gòu)破壞比較嚴(yán)重，肌絲略微水腫，這是由于蒸煮后，肌絲膨潤(rùn)，蛋白發(fā)生不均勻聚集，三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)無序，致密。相比于新鮮蝦肉（X0），經(jīng)煮制后的蝦肉（S0）的肌絲間隔更小，表明蒸煮處理會(huì)使肌絲膨潤(rùn)。

凍結(jié)過程中，主要形成胞外冰晶，一方面通過肌膜兩側(cè)滲透壓的改變來促進(jìn)細(xì)胞脫水[15]（圖2a白色區(qū)域），另一方面，冰晶的體積膨脹[16]，擠壓破壞肌球蛋白頭部[17]，蝦肉肌節(jié)Z線、M線降解，肌節(jié)縮短（圖2b），也表現(xiàn)為蝦肉彈性在前四周顯著降低 （P＜0.05）（圖3）。蒸煮后凍藏48周的蝦肉（FS48），蝦肉肌節(jié)破壞嚴(yán)重，肌絲間隔更大，是由于蒸煮使蛋白分子間的靜電斥力減小，不利于維持原有蛋白三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致肌絲密度下降，結(jié)構(gòu)松散。另外，冷凍貯藏期間肌節(jié)的縮短（圖2b），會(huì)對(duì)高溫蒸煮后蛋白的變性造成影響[18]，導(dǎo)致凍藏過的蝦烹飪后口感變差。

圖2 小龍蝦凍藏0周和48周的微觀結(jié)構(gòu)的變化Fig.2 Changes in microstructure of crayfish frozen for 0 and 48 weeks

2.3 凍藏期間小龍蝦蝦肉質(zhì)構(gòu)的變化

如圖3為凍藏過程中小龍蝦的質(zhì)構(gòu)變化情況，從圖中可以看出，隨著凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)，F(xiàn)X組的彈性、咀嚼性、凝聚性均有顯著性降低，在0~4周下降速度較快，硬度有所降低，但變化不顯著性。FS組蝦肉質(zhì)構(gòu)變化波動(dòng)較大，彈性在0~4周顯著性降低，硬度在36周開始顯著性降低，同時(shí)伴隨著彈性降低，凝聚力升高，咀嚼性無顯著性變化。

圖3 小龍蝦凍藏過程中質(zhì)構(gòu)的變化Fig.3 Changes in texture of crayfish during frozen storage

凍藏對(duì)新鮮蝦肉的形變影響不明顯，但對(duì)煮熟蝦肉有明顯影響，可能因?yàn)槭熘莆r肉蛋白間靜電作用斥力減小，凍結(jié)后，肌肉結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性變差[3]。Shi等[19]研究?jī)霾匦↓埼r，24周時(shí)發(fā)現(xiàn)肌肉組織在解凍后變成令人不快的糊狀。本實(shí)驗(yàn)觀察到FX組蝦肉經(jīng)長(zhǎng)期凍藏后外表發(fā)白，出現(xiàn)水分的不均勻干耗（圖4），可能對(duì)蝦肉凝聚力下降有影響，但對(duì)硬度影響不明顯。凝聚力被定義為內(nèi)部鍵的強(qiáng)度，凝聚力和彈性有相同趨勢(shì)，值越高，口感更好[20]。有研究指出，在短期冷凍儲(chǔ)存期間，肌原纖維蛋白會(huì)從規(guī)則的絲狀網(wǎng)絡(luò)轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨染奂慕Y(jié)構(gòu)，變性的肌原纖維蛋白會(huì)產(chǎn)生具有更多球狀微觀結(jié)構(gòu)的凝膠[21]，這種蛋白間靜電作用斥力降低的表現(xiàn)，可能是凍藏過程中FX組凝聚力顯著降低的原因。當(dāng)?shù)鞍鬃冃猿潭雀邥r(shí)，解凍后的冰晶不會(huì)被重新吸收，肌肉細(xì)胞也不會(huì)恢復(fù)[22,23]。FX組的咀嚼性在0~2周下降最快，其后較為穩(wěn)定，表明凍藏初期蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞較大；而煮熟后凍藏的FS組，由于熱變性使蛋白亞基重新結(jié)合，三級(jí)結(jié)構(gòu)更致密，并且酶被高溫滅活，所以凍藏對(duì)其結(jié)構(gòu)影響較小[16]。

圖4 小龍蝦凍藏過程中肌肉損傷模式圖Fig.4 Damage pattern during freezing and storage of crayfish

2.4 凍藏期間小龍蝦蝦肉蛋白質(zhì)成分變化

小龍蝦蝦肉蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜中主要包括7個(gè)條帶（圖5）：肌球蛋白重鏈（MHC，200 ku）、副肌球蛋白（Paramyosin，105 ku）、未知蛋白（75 ku）、肌動(dòng)蛋白（Actin，48 ku）、肌鈣蛋白亞基（原肌球蛋白結(jié)合亞基）（Troponin T，TnT，37 ku）、原肌球蛋白（Tropomysin，Tm，35 ku）、肌球蛋白輕鏈（MLC，17~20 ku）。從圖4中可以看出，凍藏期間肌球蛋白頭部（MHC和MLC）條帶變窄，表明其發(fā)生降解或者交聯(lián)[8]，同時(shí)發(fā)現(xiàn)上樣孔處蛋白聚集。FX鮮蝦組170 ku左右的條帶，在凍藏后消失，表明該處蛋白可能對(duì)冷敏感；副肌球蛋白可能降解成87 ku左右的新條帶；75 ku蛋白也發(fā)生降解。FS熟蝦組MHC有輕微降解；170 ku條帶也消失，說明該處蛋白可能同時(shí)具有熱敏感性，在加熱蒸煮過程中消失。

圖5 小龍蝦凍藏不同天數(shù)的全蛋白條帶變化Fig.5 Changes in protein fraction of crayfish frozen for different days

綜合來看，冷凍使蝦肉肌纖維的細(xì)絲和粗絲蛋白變性，導(dǎo)致高分子量蛋白聚集，或水解成小分子蛋白。MHC通過共價(jià)鍵和非共價(jià)鍵發(fā)生交聯(lián)，并且蛋白質(zhì)的交聯(lián)會(huì)增加水分損失和使肉質(zhì)口感變差[24]。Kaewprachu等[12]研究發(fā)現(xiàn)凍藏期間肌原纖維蛋白可能通過二硫鍵交聯(lián)，MLC的SHa亞基團(tuán)也會(huì)參與MHC的氧化和其二聚體的形成[25]。肌動(dòng)蛋白與肌球蛋白頸部（Tm，TnT）在凍藏期間較為穩(wěn)定。蒸煮后冷凍的熟蝦肉蛋白質(zhì)電泳條帶變化不明顯，可能是由于上樣緩沖液中DTT對(duì)二硫鍵的還原作用導(dǎo)致無法觀察到交聯(lián)作用。

2.5 凍藏期間小龍蝦蝦肉脂質(zhì)氧化變化

肌肉凍藏過程中，發(fā)生的脂肪氧化會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能性產(chǎn)生不利的影響。冷凍會(huì)損害細(xì)胞結(jié)構(gòu)，尤其是膜脂，從而造成肉類氧化，并且脂質(zhì)氧化是一種自催化反應(yīng)，其中一些中間和最終氧化產(chǎn)物自由基具有促氧化作用，能促進(jìn)蛋白氧化。如圖6所示，F(xiàn)X組蝦肉的TBARS值在0~5周呈上升趨勢(shì)（0.07~ 0.24 mg/kg樣品），特別是在凍藏前2周，上升速度較快，在2~5周期間變化不顯著，第5周達(dá)到最大值后開始下降（0.24~0.11 mg/kg樣品）。FS組蝦肉的TBARS值在前5周保持緩慢增加，同樣在第5周達(dá)到最高值（0.33 mg/kg樣品）。丙二醛（MDA）是脂質(zhì)氧化過程中的中間副產(chǎn)品，隨脂肪氧化，MDA逐漸增多，然后被進(jìn)一步氧化成其他有機(jī)酸和醇，導(dǎo)致TBARS值下降[26]。

圖6 小龍蝦凍藏過程中硫代巴比妥酸值(TBARS)的變化Fig.6 Changes in thiobarbituric acid values (TBARS) during frozen storage of crayfish

2.6 凍藏期間小龍蝦蝦肉蛋白羰基含量的變化

如圖7所示，凍藏過程中，F(xiàn)X組和FS組蝦肉的蛋白氧化持續(xù)發(fā)生，F(xiàn)X組蝦肉羰基含量從0.028增加至0.094 μmol/g，F(xiàn)S組蝦肉羰基含量從0.009增加至0.042 μmol/g。FX組羰基含量增長(zhǎng)速率高于FS組，且在0~4周上升速率較快，后期較為平穩(wěn)。FS組增長(zhǎng)速度較為穩(wěn)定。說明鮮蝦組初期蛋白氧化變性較快，后期氧化變性更為緩慢，熟蝦組的氧化變性恒速進(jìn)行[3]。熟制后凍藏的蝦肉羰基增量小于鮮蝦凍藏組，可能是由于熟蝦蛋白聚集嚴(yán)重，大部分羰基被包裹與蛋白疏水性內(nèi)側(cè)。

圖7 小龍蝦凍藏過程中羰基含量的變化Fig.7 Changes in carbonyl content of crayfish during frozen storage

2.7 凍藏期間小龍蝦蝦肉蛋白質(zhì)表面疏水性變化

疏水相互作用在維持蛋白質(zhì)構(gòu)象中起著主要的作用，由于蒸煮后的蝦肉蛋白發(fā)生嚴(yán)重不可逆變性，而無法提取肌原纖維蛋白[14]，沒有測(cè)得其表面疏水性變化。如圖8，在凍藏前3周，F(xiàn)X組蝦肉蛋白質(zhì)的表面疏水度緩慢上升，然后緩慢下降，整個(gè)凍藏期，表面疏水度下降了44.25%（97.09~54.13 BPB結(jié)合量/μg）（P＜0.05)。凍結(jié)使疏水相互作用變?nèi)醵鴼滏I變強(qiáng)[5]，蛋白質(zhì)內(nèi)核中埋藏非極性殘基的穩(wěn)定降低是蛋白冷變性的原因[27]。凍藏期間，蝦肉蛋白首先解折疊，然后聚集。凍藏前3周，蛋白質(zhì)的展開占主導(dǎo)地位，蛋白與水的氫鍵作用增強(qiáng)，蛋白質(zhì)分子空間結(jié)構(gòu)打開并逐漸伸展，使埋藏在分子內(nèi)部的疏水性氨基酸殘基暴 露[28]，例如疏水性脂肪族和芳香族氨基酸的暴露[14]。隨后，蛋白質(zhì)的聚集占主導(dǎo)地位。一方面，活性基團(tuán)的暴露引起蛋白分子間作用增強(qiáng)，蛋白質(zhì)分子的再聚集導(dǎo)致更多疏水性殘基被包裹于更加疏水的分子內(nèi)部，從而引起肌原纖維蛋白的表面疏水度下降[29]。另一方面，凍藏過程發(fā)生的蛋白質(zhì)側(cè)鏈氧化，這引起蛋白中極性和非極性基團(tuán)數(shù)量改變，減少了靜電作用力[30]，蛋白與蛋白的氫鍵作用增強(qiáng)，疏水作用力增強(qiáng)，使得蛋白表面疏水度和溶解度下降[31]。

圖8 小龍蝦凍藏過程中表面疏水度的變化Fig.8 Changes in surface hydrophobicity of crayfish during frozen storage

2.8 凍藏期間小龍蝦蝦肉蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化

酰胺Ⅰ帶被認(rèn)為是研究蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)中最有價(jià)值的區(qū)域，其中1 600~1 639 cm-1被認(rèn)為歸屬于β-折疊結(jié)構(gòu)，1 640~1 650 cm-1歸屬于無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)，1 651~1 660 cm-1歸屬于α-螺旋結(jié)構(gòu)，1 661~1 700 cm-1歸屬于β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)[32]。從圖9可以看出，凍藏期間，F(xiàn)X組和FS組蝦肉蛋白質(zhì)的α-螺旋和無規(guī)卷曲有向β-折疊與β-轉(zhuǎn)角轉(zhuǎn)變的趨勢(shì)。肌球蛋白主要由α-螺旋構(gòu)成，α-螺旋的降低和疏水基團(tuán)的暴露，常伴隨著β-折疊的增加[33]。α-螺旋結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定主要由單肽鏈上羰基（C=O）與氨基（N-H）間形成的鏈內(nèi)氫鍵維持，β-折疊結(jié)構(gòu)則依賴蛋白質(zhì)分子肽鏈間的氫鍵形成[34]。凍藏過程中，α-螺旋的減少和β-折疊的增多，對(duì)應(yīng)說明蛋白分子間靜電斥力減小，疏水相互作用增強(qiáng)，蛋白與水間的氫鍵作用力變小，蛋白與蛋白分子間氫鍵增多，蛋白可能發(fā)生聚集[35]。相對(duì)來看，F(xiàn)S組的β-結(jié)構(gòu)波動(dòng)較小，僅在4和8周明顯體現(xiàn)，程麗娜 等[34]研究認(rèn)為冷凍對(duì)分子間作用力，如疏水作用力影響較大，可能是由于高溫蒸煮使蛋白不可逆變性，蛋白與蛋白間的氫鍵作用很強(qiáng)，所以凍藏對(duì)熟制蝦肉的分子間疏水作用力改變較小。

圖9 小龍蝦凍藏過程中蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化Fig.9 Changes in protein secondary structure during frozen storage of crayfish

2.9 凍藏期間小龍蝦蝦肉蛋白質(zhì)總巰基含量變化

巰基氧化是以自由基為媒介的蛋白質(zhì)氧化反應(yīng)。如圖10所示，F(xiàn)X組蝦肉蛋白質(zhì)在凍藏48周后，總巰基的含量降低41%。巰基含量降低表明蛋白發(fā)生了變性，或者通過形成分子間的二硫鍵而聚集，或者發(fā)生了氧化。二硫鍵主要參與蛋白質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的形成，它可以在凍結(jié)、冷凍儲(chǔ)存或解凍過程中形成，然后蛋白質(zhì)的疏水鍵和親水鍵再在分子內(nèi)和分子間發(fā)生重排形成穩(wěn)定的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[15]。凍藏期間，F(xiàn)S組的總巰基含量在0.26~0.81 μmol/g樣品范圍波動(dòng)變化，可能是因?yàn)槭烊庵锌値€基含量較低，初始值僅為0.61 μmol/g樣品，多數(shù)已經(jīng)通過高溫氧化交聯(lián)，并由于蛋白變性而被埋藏在蛋白疏水內(nèi)部，DTNB不能進(jìn)入內(nèi)部與游離巰基反應(yīng)，因此在整個(gè)凍藏期間，總巰基含量在較低的范圍內(nèi)波動(dòng)，這與Dai等[16]研究短期凍藏預(yù)蒸煮豬肉，巰基穩(wěn)定下降結(jié)果不同。

圖10 小龍蝦凍藏過程中總巰基含量的變化Fig.10 Changes in total sulfhydryl content during frozen storage of crayfish

2.10 凍藏期間小龍蝦蝦肉蛋白質(zhì)不同指標(biāo)間的相關(guān)性分析

由圖11可見，F(xiàn)X鮮蝦組，羰基含量與內(nèi)聚力呈極顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.01），與咀嚼性、硬度呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），表明蛋白氧化顯著影響蝦肉口感；TVB-N和表面疏水性呈著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；質(zhì)構(gòu)參數(shù)之間有相互影響，表現(xiàn)為內(nèi)聚力與硬度呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與硬度呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），咀嚼性與硬度呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與硬度呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。

圖11 小龍蝦凍藏過程中不同測(cè)定指標(biāo)之間Pearson相關(guān)系數(shù)熱圖Fig.11 Heat map of Pearson correlation coefficients between different measured indicators during frozen storage of crayfish

FS熟蝦組，硬度與內(nèi)聚力呈極顯著負(fù)相關(guān) （P＜0.01），表明細(xì)胞間作用力顯著影響蝦肉硬度；羰基含量與內(nèi)聚力、TVB-N呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與咀嚼性呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05），表明蛋白氧化顯著影響蛋白降解和蛋白間作用力；TVB-N與TBARS呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），表明脂質(zhì)氧化顯著影響蛋白降解。

3 結(jié)論

鮮活凍結(jié)和蒸煮后凍結(jié)的小龍蝦在冷凍貯藏48周后，TVB-N值分別為22.93和11.90 mg/100 g，均未超過安全限值，但蝦肉質(zhì)構(gòu)相關(guān)指標(biāo)的顯著變化。隨著凍藏時(shí)間的延長(zhǎng)，肌原纖維蛋白發(fā)生降解和聚集，蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化，α-螺旋和無規(guī)卷曲向β-折疊與β-轉(zhuǎn)角發(fā)生轉(zhuǎn)變。蛋白疏水相互作用變?nèi)醵鴼滏I變強(qiáng)，蛋白質(zhì)側(cè)鏈和脂肪的氧化也改變了體系的靜電作用力，表面疏水度從97.09升至122.16 BPB結(jié)合量/μg，再下降至82.79 BPB結(jié)合量/μg，蛋白質(zhì)和脂肪的氧化作用持續(xù)發(fā)生。

鮮活凍結(jié)和蒸煮后凍結(jié)的小龍蝦相比，各項(xiàng)指標(biāo)的變化趨勢(shì)相似，蝦肉在凍藏期間的質(zhì)構(gòu)劣化和TVB-N值上升與肌肉蛋白質(zhì)的羰基含量、表面疏水性、TBARS值具有顯著相關(guān)性。熟蝦在長(zhǎng)期冷凍貯藏期間蛋白質(zhì)理化指標(biāo)與活蝦冷凍組相比波動(dòng)較小，主要是因?yàn)檎糁笫刮r肉蛋白完全變性，蝦肉脫水、滅酶，減少了凍藏期間冰晶對(duì)肌肉纖維的機(jī)械損傷和氧化作用。所以建議小龍蝦進(jìn)行蒸煮處理后再進(jìn)行冷凍貯藏。