龐甲雷，張芳

（中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003）

擴展青霉是蘋果、梨果和柑橘等水果貯運及銷售環(huán)節(jié)的主要病原真菌之一，普遍存在于空氣和土壤中， 環(huán)境適應(yīng)性極好，在溫度25 ℃、濕度90%的環(huán)境下生長最為旺盛。擴展青霉侵染水果可引發(fā)青霉病，并伴隨產(chǎn)生具有細(xì)胞毒性、遺傳毒性的次級代謝產(chǎn)物棒曲霉素，降低水果品質(zhì)[1]，損害機體健康[2]。因此，亟需針對擴展青霉誘發(fā)水果病害和毒素分泌情況，開發(fā)新型靶向殺菌技術(shù)，保證水果產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。

光動力技術(shù)的原理是依靠可見光、光敏劑及氧氣，通過誘導(dǎo)細(xì)菌、真菌等微生物細(xì)胞內(nèi)氧化失衡而引發(fā)細(xì)胞死亡[3]。以姜黃素、核黃素、葉綠素等天然植物提取物作為外源光敏劑的光動力技術(shù)，在食品領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊[4]。其中，姜黃素是南非、印度等國家主要的食品著色劑，其具有光敏活性，經(jīng)420 nm藍(lán)光激發(fā)，可通過能量傳遞和/或電子轉(zhuǎn)移產(chǎn)生ROS，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)生物大分子如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及核酸等發(fā)生不可逆性氧化損傷，最終誘發(fā)微生物死亡[5]。

姜黃素介導(dǎo)的光動力技術(shù)已被證明能滅活食品基質(zhì)表面細(xì)菌，如鮮切梨[6]和雞皮[7]上的單增李斯特菌；同時有效延長鮮棗[8]、哈密瓜[9]、銀耳[10]和草莓[11]等食品保質(zhì)期。此外，該技術(shù)可有效抵抗真菌病害，如抑制食品中黃曲霉[12]及灰霉孢子[13]生長，控制蘋果青霉病[14]、灰霉病[15]，然而光動力技術(shù)對毒素消減與控制的研究尚未報道。因此，本文將從體外及活體實驗探究姜黃素介導(dǎo)的光動力技術(shù)對擴展青霉生長及棒曲霉素分泌的抑制效果，為進(jìn)一步開發(fā)果實抑菌保鮮技術(shù)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

擴展青霉菌株，本實驗室從腐爛蘋果中分離純化并鑒定得到；紅富士蘋果，同批次采購于山東省煙臺市福山區(qū)蘋果種植戶，選取成熟度相似、大小均一且無損傷的蘋果用于實驗；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）、查氏液體（CY）培養(yǎng)基，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；棒曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品（純度：99.7%），上海源葉生物科技有限公司；乙腈和冰乙酸（色譜級），德國Merck公司；果膠酶，北京索萊寶科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-LS-100A立式壓力蒸汽滅菌器、BMJ-250C霉菌培養(yǎng)箱、ZQTY-70S振蕩培養(yǎng)箱，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；HCB-900V潔凈工作臺、HYC-390冷藏箱，青島海爾電器有限公司；Legend Micro 21R微量離心機、ST 16R高速離心機，賽默飛科技（中國）有限公司；Agilent-1260高效液相色譜儀（HPLC），美國安捷倫科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基和試劑配制

PDA培養(yǎng)基：稱取40 g PDA粉末加入0.8 L蒸餾水，超聲水浴輔助溶解，定容至1 L，滅菌備用。CY培養(yǎng)基：稱取35 g CY粉末加入0.8 L蒸餾水，再加入5.0 g酵母提取物，超聲水浴輔助溶解，調(diào)pH值為5.2，定容至1 L，滅菌備用。棒曲霉素標(biāo)液：乙腈（色譜純）溶解5 mg棒曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品，定容至5 mL，制得1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，棕色小瓶分裝后冷藏待用。乙酸水溶液：冰乙酸（色譜純）調(diào)整水溶液pH值至4.0，定容至1 L后備用。姜黃素儲備液：稱取粉末36.8 mg置于50 mL燒杯，分別加入1 mL的吐溫80和二甲基亞砜，超聲水浴輔助溶解，定容至0.1 L，得到1 mol/L母液冷藏備用。實驗時，蒸餾水稀釋至所需濃度。

1.3.2 菌種活化和菌絲制備

接種擴展青霉孢子至PDA平板，溫度25 ℃、濕度90%霉菌培養(yǎng)箱中倒置7 d。小心刮取生理鹽水預(yù)孵育的孢子，以平板計數(shù)法，生理鹽水調(diào)節(jié)孢子懸液至1×107CFU/mL，移取1 mL等份添加到20 mL CY培養(yǎng)基，25 ℃ 130 r/min 培養(yǎng)3 d，獲得大小均一的球狀菌絲。

1.3.3 固體再培養(yǎng)生長情況

裁剪透析玻璃紙為1×1 cm，捆扎后滅菌。將玻璃紙置于PDA平板，確保兩者之間無氣泡，接種菌絲球，溫度25 ℃、濕度90%霉菌培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，每天3次測量菌落直徑并拍照觀察。結(jié)束后，分離玻璃紙與培養(yǎng)基，稱重3次并記錄。

1.3.4 棒曲霉素檢測

棒曲霉素標(biāo)液：于40 ℃的氮吹儀中吹干標(biāo)液，乙酸水溶液梯度稀釋制作標(biāo)曲，0.22 μm孔過濾，注入高效液相色譜儀的C18柱20 μL溶液，重復(fù)3次，每次3次平行。

參照Li等[16]的方法，使用5 mL乙酸水溶液孵育固體培養(yǎng)基表面菌絲30 min，充分溶解固體培養(yǎng)基中棒曲霉素；收集病斑處果實，均質(zhì)10 min確保果肉和果皮均一，轉(zhuǎn)移果漿至50 mL離心管后5 000 r/min離心10 min，提取蘋果中棒曲霉素，移取1 mL上清液與1.5 mg果膠酶粉末混勻，靜置5 min，確保果膠降解以防堵塞C18柱，離心過濾后高效液相色譜儀分析，重復(fù)3次。高效液相色譜儀的洗脫條件：流動相為水和乙腈（90:10，V/V），0.5 mL/min流速等度洗脫，柱溫30 ℃，檢測波長276 nm。

1.3.5 不同姜黃素濃度處理擴展青霉菌絲

本實驗室設(shè)計了由420 nm發(fā)光二極管陣列組成的多功能光源儀。單因素實驗中使用50 W功率 （0.275 W/cm2能量），方程（1）計算光劑量：

式中：

E——劑量，單位J/cm2；

P——功率，單位W/cm2；

t——時間，單位s。

將50、100、200、300 μmol/L濃度的姜黃素溶液和菌絲球置于96孔板中，黑暗孵育30 min后置于光源儀中（時間20 min，功率50 W）。處理后，生理鹽水洗去多余姜黃素，接種菌絲球至覆蓋玻璃紙的PDA平板中培養(yǎng)5 d，以菌落直徑、菌絲質(zhì)量、棒曲霉素含量為指標(biāo)，評價菌絲在固體培養(yǎng)基上再培養(yǎng)的生長情況，重復(fù)3次。未光照及未添加姜黃素樣本設(shè)為對照組（L-P-），其中，L：光照；P：光敏劑（姜黃素），-：未光照或未添加；+：光照或添加。

1.3.6 不同姜黃素濃度處理接種擴展青霉菌絲的蘋果

光動力處理蘋果流程圖（圖1）。2%次氯酸鈉溶液消毒紅富士蘋果，無菌臺晾干，在正反面赤道周圍3×5 mm人為處理傷口并接種等量菌絲球。光動力處理組，以50、100、300 μmol/L濃度姜黃素溶液孵育30 min，光源儀中40 W照射20 min。隨后將蘋果置于長、寬、高30×20×10 cm塑料箱，溫度25 ℃、濕度90%霉菌培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d，第4、6、8天以十字交叉法測定病斑直徑，第10天測量病斑質(zhì)量及棒曲霉素含量。結(jié)果以病斑/果實質(zhì)量作為病斑比重表示果實病害程度。每組10個果實，重復(fù)3次。

圖1 姜黃素光動力處理接種擴展青霉菌絲的蘋果流程圖Fig.1 Flow chart of CUR-PDT treatment of apple inoculated with P.expansum mycelium

1.4 數(shù)據(jù)分析

SPSS18.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n≥3）表示。Origin Lab（Origin Pro 8.0）軟件分析方差（ANOVA），P＜0.05認(rèn)為存在顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)時間對擴展青霉菌絲生長及PAT分泌的影響

探究菌絲球在固體培養(yǎng)基再培養(yǎng)的生長與棒曲霉素分泌的關(guān)系，由圖2可知，菌落呈規(guī)則圓盤狀，其直徑、菌絲質(zhì)量、棒曲霉素含量均與培養(yǎng)時間呈正相關(guān)。營養(yǎng)充足時，菌絲生長旺盛伴隨棒曲霉素分泌量增大；在第5~6天產(chǎn)毒期，棒曲霉素由6.58 μg/mL大幅上升至43.02 μg/mL，這與葡萄糖、蔗糖等碳源含量減少有關(guān)[17]，而菌落直徑與菌絲質(zhì)量仍緩慢增長，分別為0.25 cm和103.63 mg。同時圖2明顯觀察到6 d后菌絲表面出現(xiàn)綠色孢子，且平板呈現(xiàn)深褐色，這可能與有機酸的分泌或利用NH4+將其表面pH降至3.6~4，以使采后果實有利于自身生長有關(guān)[18]。因此選擇第5天作后續(xù)實驗條件。

圖2 球狀菌絲在固體培養(yǎng)基中再培養(yǎng)后菌落直徑、菌絲質(zhì)量及PAT含量Fig.2 The diameter of colony, the weight of mycelium, and the content of PATafter the spherical mycelium

2.2 不同姜黃素濃度對擴展青霉菌絲的生長抑制

觀察光動力處理后培養(yǎng)5 d的菌絲，顯示僅添加姜黃素處理組菌落直徑和菌絲質(zhì)量輕微抑制（圖3）。有研究表明低劑量姜黃素、短時間處理不會因誘導(dǎo)灰霉菌細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生ROS而抑制生長[19]。僅光照處理組菌落直徑下降約28.14%，菌絲質(zhì)量下降約47.37%，表明純光照可輕微抑制菌絲生長；不同姜黃素濃度的光動力處理組（0.275 W/cm2）均顯著抑制菌絲生長，其菌落直徑與菌絲質(zhì)量分別降低0.84 cm、68.37 mg。我們前期發(fā)現(xiàn)光動力技術(shù)顯著抑制擴展青霉孢子活力，且與姜黃素濃度呈正相關(guān)[14]，本研究進(jìn)一步表明光動力技術(shù)對菌絲抑菌效果良好，但與姜黃素濃度關(guān)系不大。

圖3 不同姜黃素濃度對菌絲生長的影響Fig.3 Effects of different CUR concentrations on mycelial growth

2.3 不同姜黃素濃度對PAT的分泌抑制

外源ROS可抑制擴展青霉生長，降低毒素分泌[20]。圖4a顯示4.80 min為棒曲霉素的出峰時間，且峰面積差異顯著，圖4b表明棒曲霉素分泌抑制與菌落直徑和菌絲質(zhì)量相關(guān)，僅光照處理組不顯著，抑制率僅為28.86%。類似研究發(fā)現(xiàn)未光敏化的姜黃素抑菌效果較差，0.125~2 mg/mL姜黃素濃度對曲霉菌生長和黃曲霉毒素B1抑制率在26.6%~94.9%[21]。與陰性對照組相比，僅光照組棒曲霉素分泌量為5.48 μg/mL，而 300 μmol/L姜黃素介導(dǎo)的光動力處理組為2.01 μg/mL，抑制率達(dá)83.85%，證明光動力處理可以顯著抑制菌絲的棒曲霉素分泌。

圖4 不同姜黃素濃度對菌絲分泌PAT的影響Fig.4 Effects of different CUR concentrations on PAT secretion by mycelium

2.4 光動力對蘋果青霉病的控制

利用蘋果載體探究光動力技術(shù)應(yīng)用的可行性發(fā)現(xiàn)姜黃素濃度與病斑直徑抑制率呈正比例，表明蘋果載體比體外效果更佳（圖5）。延長貯藏時間，300 μmol/L姜黃素介導(dǎo)的光動力處理組是陰性對照組平均病斑直徑的49.38%，且病斑表面孢子數(shù)量極低，進(jìn)一步證明光動力處理可顯著抑制菌絲生長及孢子產(chǎn)生。我們前期發(fā)現(xiàn)500 μmol/L姜黃素有效控制蘋果灰霉病害[15]，本研究證明果實青霉病害對光動力處理更為敏感。

圖5光動力對蘋果青霉病的控制效果Fig.5 Inhibition effect of photodynamic treatment on apple disease

2.5 光動力對蘋果載體PAT分泌的抑制

檢測果實病斑處棒曲霉素的分布，發(fā)現(xiàn)赤道中央向外1 cm處棒曲霉素較高；1~2 cm處棒曲霉素較低；2~2.5 cm處仍可有微量棒曲霉素（圖6a），表明食用剔除腐爛組織的果實仍存在安全風(fēng)險。圖6b顯示對照組與僅姜黃素處理組病斑比重差異不大（0.15%），棒曲霉素僅降低30%，表明純姜黃素?zé)o法抑制青霉病害，但低程度控制了棒曲霉素的分泌及菌絲生長。 300 μmol/L姜黃素介導(dǎo)的光動力處理組的病斑比重及棒曲霉素分別為0.09%、18.02%，顯著低于陰性對照組，證明光動力處理可有效延緩果實青霉病害、降低棒曲霉素的分泌。

圖6 光動力對蘋果PAT分泌抑制效果Fig.6 Effect of photodynamic treatment on inhibition of PAT secretion in apple

3 結(jié)論

本文利用多功能光源儀探究了姜黃素介導(dǎo)的光動力技術(shù)對擴展青霉分泌棒曲霉素的影響。結(jié)果表明，擴展青霉菌絲在固體培養(yǎng)基再培養(yǎng)后，其菌落直徑、菌絲質(zhì)量、棒曲霉素含量均與培養(yǎng)時間呈正相關(guān)，且低濃度姜黃素介導(dǎo)的光動力處理（0.275 W/cm2光劑量）就顯著抑制菌絲生長，減少棒曲霉素分泌。此外，光動力處理能有效控制蘋果青霉病害，同時顯著降低棒曲霉素的分泌。綜上，本研究證明了光動力技術(shù)可有效防控棒曲霉素污染和采后病害，為其進(jìn)一步應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。