彭歡，黃子健，吳濤，劉亮秀，陳國浚，楊翕淼，廖振林，方祥，王潔

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東廣州 510642）

刺梨(Rosa roxburghiiTratt)又稱為刺石榴、木梨子、送春歸，是一種表面帶刺、果肉酸甜可口的薔薇科植物，主要分布在四川、貴州和湖南等地，少量分布于云南[1]。刺梨果肉不僅具含有豐富的維生素C、氨基酸和微量元素，享有“三王水果”美譽(yù)[2]，而且含有豐富刺梨多糖、類黃酮、多酚和有機(jī)酸等，具有抗氧化性、增強(qiáng)免疫力、防治癌癥和預(yù)防粥動(dòng)脈硬化等保健功能[3-6]。由于潛在的“藥食兩用”價(jià)值，刺梨作為國內(nèi)飲料、酒類以及營養(yǎng)保健品產(chǎn)業(yè)的一種重要原料，已被開發(fā)研制成多種產(chǎn)品，如刺梨果脯、刺梨果酒、刺梨糕膠、刺梨口服液、刺梨凍干粉膠囊以及刺梨復(fù)合維生素C等[7]。

刺梨果酒是對(duì)刺梨進(jìn)行一定的發(fā)酵加工而制成的，保留了刺梨原有的維生素、氨基酸和礦物質(zhì)，使其既有悅?cè)说拇汤嬖阌钟袇f(xié)調(diào)的酒香，同時(shí)還能增強(qiáng)免疫力，起到保健、養(yǎng)生、健體作用。目前關(guān)于刺梨果酒的研究主要集中在刺梨果酒的工藝優(yōu)化方面，如趙馳等[8]以刺梨原汁為原料，蜂蜜為微生物碳源進(jìn)行發(fā)酵，通過感官評(píng)定和理化性質(zhì)來優(yōu)化發(fā)酵工藝；韋唯等[9]以理化成分和感官評(píng)價(jià)為刺梨果酒品質(zhì)的評(píng)價(jià)指標(biāo)，結(jié)果表明不同發(fā)酵因素和不同發(fā)酵方式對(duì)刺梨酒品質(zhì)有較大影響；賀紅早等[10]對(duì)全果發(fā)酵、無籽刺梨果汁發(fā)酵以及無籽刺梨汁渣混合發(fā)酵的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了定量測(cè)定，結(jié)合感官指標(biāo)對(duì)3個(gè)處理的發(fā)酵產(chǎn)品進(jìn)行綜合分析。然而，刺梨酒發(fā)酵過程中的理化性質(zhì)、抗氧化活性、微生物多樣性等研究較少。

自然發(fā)酵是利用天然微生物發(fā)酵來獲得最終產(chǎn)物，是一種歷史比較悠久的傳統(tǒng)發(fā)酵方式；通過自然發(fā)酵后，食品中的多數(shù)營養(yǎng)成分和活性功能會(huì)得到提高和改善[11]。新鮮刺梨果實(shí)在自然條件下釀制成刺梨果酒，不僅能最大限度的保留刺梨本身的營養(yǎng)價(jià)值，還能改善刺梨原本的苦澀味。鑒于此，本文監(jiān)控刺梨自然發(fā)酵制酒過程中的總酸、還原糖、酒精度等理化指標(biāo)及總酚、總黃酮等抗氧化成分的含量及抗氧化能力的動(dòng)態(tài)變化，并對(duì)抗氧化成分與抗氧化能力進(jìn)行相關(guān)性分析，為進(jìn)一步闡明刺梨果酒保健功能機(jī)理和綜合開發(fā)提供理論基礎(chǔ)；與此同時(shí)，進(jìn)一步深入研究刺梨自然發(fā)酵制酒過程中微生物群落動(dòng)態(tài)變化，明確刺梨果酒發(fā)酵的主要優(yōu)勢(shì)菌株，對(duì)刺梨釀酒適制性菌種的選育及刺梨果酒品質(zhì)的控制具有重要的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

刺梨，購買于貴州貴陽市；蔗糖、白醋，市購；甲醇、乙腈，色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（含量＞98%）、鞣花酸標(biāo)準(zhǔn)品（含量＞98%），阿拉??；葡萄糖、亞硝酸鈉、碳酸鈉、硝酸鋁、硫酸鐵、過硫酸鉀、瓊脂、氫氧化鈉、LB肉湯培養(yǎng)基，分析純，廣州化學(xué)試劑廠；微生物檢測(cè)配套試劑（革蘭氏染色液）、MRS肉湯培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物有限公司；通用引物ITS1、ITS4、27F、1492R、Taq酶，生工生物工程（上海）股份有限公司；真菌基因組DNA提取試劑盒，杭州博日科技有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

BSM-2200.2型電子天平，上海卓精電子科技有限公司；e2695型高效液相色譜儀，美國Waters公司；TG-16W臺(tái)式高速離心機(jī)，長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；TP600型PCR儀，德國Eppendorf公司；DYY-8C電泳儀，北京六一生物科技有限公司；WB-2000型水浴鍋，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；YXQ-LS-50A立式壓力蒸汽滅菌鍋，合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司；SPX-250BⅢ生化培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司；THZ-300C恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；BA310-T電子顯微鏡，麥克奧迪（成都）儀器有限公司。

1.3 主要試驗(yàn)方法

1.3.1 刺梨自然發(fā)酵

稱取1 kg新鮮刺梨，去除表面小刺，洗凈后陽光暴曬2 h，使其表面水分蒸干。將處理好的刺梨放入已滅菌2 L發(fā)酵壇中，加入1 500 mL 40%蔗糖溶液和50 g白醋，水封后進(jìn)行自然發(fā)酵。每隔3 d從發(fā)酵壇中分別取3份發(fā)酵液，每份800~1 000 μL置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 微生物的分離與鑒定

1.3.2.1 微生物的分離

每隔4 d取10 mL刺梨自然發(fā)酵液，用無菌生理鹽水進(jìn)行不同梯度稀釋，并將合適梯度的稀釋液分別與MRS、PDA培養(yǎng)基及LB培養(yǎng)基混勻傾注于平板，將平板倒置于厭氧袋，放入37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。48 h后，計(jì)算各個(gè)平板菌落總數(shù)[12]，挑取不同形態(tài)的菌落進(jìn)行劃線純化。

1.3.2.2 微生物的鑒定

將（1.3.2.1）純化的菌落革蘭氏染色[13,14]。同時(shí)將菌落液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，取菌液800 μL于1.5 mL EP管中，10 000 r/min離心10 min，吸凈上清液。細(xì)菌就在沉淀中加無菌的1% SDS 20 μL，振蕩6 min，65 ℃水浴5 min，加入480 μL無菌水混勻即為該菌的基因組,以基因組為模板，使用通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）和1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’）PCR擴(kuò)增 16s rDNA序列[15]；真菌則用真菌基因組DNA提取試劑盒提取該菌的基因組，以基因組為模板，使用通用引物ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）、ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）PCR擴(kuò)增ITS序列[16]。將提取的細(xì)菌和真菌DNA送至擎科生物科技有限公司測(cè)序，通過與NCBI數(shù)據(jù)庫比對(duì)，建立進(jìn)化樹分析菌株親緣關(guān)系。

1.3.3 感官評(píng)定

參考韋唯等[9]的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行適當(dāng)修改，選擇10人組建感官評(píng)定小組，依據(jù)感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)刺梨酒進(jìn)行感官評(píng)定，取其平均值作為最終評(píng)分結(jié)果。感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表1。

表1 刺梨果酒的感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Rosa roxburghiiTratt wine sensory scoring criteria

1.3.4 化學(xué)成分含量測(cè)定

1.3.4.1 基本成分測(cè)定

采用pH計(jì)和糖度儀分別測(cè)定刺梨果酒的pH值和還原糖度；采用酒精計(jì)法測(cè)定刺梨果酒酒精度，參考國標(biāo)GB 5009.225-2016；采用酸堿滴定法測(cè)定總酸含量，參考國標(biāo)GB 12456-2021。

1.3.4.2 總酚含量測(cè)定

分別準(zhǔn)確吸取10 μL的樣品、不同含量的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（0、100、200、300、400、500 μL）于不同10 mL的容量瓶中，加入2.5 mL的φ=50%福林酚溶液和2 mL的m=7.5% Na2CO3溶液，定容后37 ℃水浴30 min，測(cè)量其在765 nm的吸光度值。以沒食子酸含量為橫坐標(biāo)，吸光度值OD765為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算刺梨果酒中總酚含 量[17]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4.3 總黃酮含量測(cè)定

分別準(zhǔn)確吸取0.5 mL的樣品、不同含量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 mL）于10 mL的容量瓶中，迅速加入m=5% NaNO2溶液和m=10% Al(NO3)3溶液各0.5 mL混勻后靜置5 min；加入m=4% NaOH溶液4 mL，用φ=60%乙醇定容，搖勻后靜置5 min，測(cè)量在510 nm處的吸光度值。以蘆丁含量為橫坐標(biāo)，吸光度值OD510為縱坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算刺梨果酒中總黃酮含 量[18]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4.4 抗壞血酸含量測(cè)定

高效液相色譜條件為C18色譜柱(250×4.6 mm， 5 μm)，柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長為265 nm，進(jìn)樣量為10 μL；流動(dòng)相為0.05 mol/L KH2PO4溶液（pH值2.0）:乙腈=97:3,流速1 mL/min。準(zhǔn)確吸取250、125、50、25、5 μL的20 mg/mL抗壞血酸母液，超純水制得5.0、2.5、1.0、0.5、0.1 mg/mL的抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。記錄抗壞血酸（Vc）的色譜峰面積，以Vc色譜峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)Vc濃度作圖，繪制抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中Vc的含量[19]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 抗氧化能力的測(cè)定

1.3.5.1 DPPH自由基清除率的測(cè)定

取待測(cè)酒液2 μL，加入3 mL DPPH·溶液 （0.2 mmol/L），加φ=95%乙醇至4 mL反應(yīng)體系。渦旋震蕩混勻后，置于室溫下避光反應(yīng)30 min后測(cè)其在517 nm處的吸光度[20,21]。蒸餾水代替樣品作為空白對(duì)照，φ=95%乙醇代替DPPH·溶液用作自身對(duì)照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：

B——DPPH自由基清除率，%；

At——樣品反應(yīng)溶液的吸光度；

Ar——自身對(duì)照溶液的吸光度，其中包括3.998 mL 95%乙醇溶液和2 μL樣品溶液；

A0——空白對(duì)照溶液的吸光度，其中包括3 mL DPPH和 2 μL 50%乙醇溶液。

1.3.5.2 ABTS自由基清除率的測(cè)定

準(zhǔn)確吸取2.5 mL ABTS·溶液和2.5 mL過硫酸鉀溶液（5 mmol/L）于同一試管中，混合均勻，在室溫黑暗中靜置12 h，用PBS緩沖液（pH值7.4）稀釋至吸光度為0.7的工作液，備用。取1 μL的樣品及3 mL ABTS·工作液于試管中，蒸餾水調(diào)至總體積為4 mL。振蕩混勻后放入30 ℃恒溫?zé)崴≈徐o置5 min，在波長 734 nm，測(cè)定在波長734 nm處樣品溶液的吸光度[20,21]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。ABTS自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：

C——ABTS自由基清除率，%；

At——樣品反應(yīng)溶液的吸光度；

Ar——自身對(duì)照溶液的吸光度，其中包括1 μL的樣品補(bǔ)加蒸餾水至4 mL；

A0——空白對(duì)照溶液的吸光度，其中包括3 mL的ABTS工作液和用1 mL的蒸餾水。

1.3.5.3 羥基自由基清除率的測(cè)定

無菌水將H2O2溶液（8.8 mmol/L）稀釋10倍備用。取10 μL待測(cè)液，依次加入H2O2工作液、9 mmol/L乙醇水楊酸和9 mmol/L FeSO4溶液各1 mL，蒸餾水調(diào)至總體積為4 mL反應(yīng)體系。充分振蕩混勻，置于37 ℃恒溫水浴鍋中，靜置30 min，測(cè)定其在波長510 nm處的吸光度[20,21]。蒸餾水代替待測(cè)液作為空白對(duì)照組，蒸餾水代替H2O2溶液作為自身對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。羥基自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：

D——羥基自由基清除率，%；

At——樣品反應(yīng)溶液的吸光度；

Ar——自身對(duì)照溶液的吸光度；

A0——空白對(duì)照溶液的吸光度。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，利用Graph Pad Prism 7統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行繪圖。采用DPS 9.01分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析及相關(guān)性分析，以P＜0.05為樣本間有顯著差異。利用MEGA 7繪制進(jìn)化樹，分析菌株的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近。

2 結(jié)果與討論

2.1 刺梨果酒的感官評(píng)定

刺梨發(fā)酵液的感官評(píng)定依據(jù)同一個(gè)感官評(píng)價(jià)表作為評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，從外觀、滋味和香氣等多方面來對(duì)刺梨發(fā)酵液進(jìn)行評(píng)分，得到的數(shù)據(jù)具有一定參考價(jià)值。如表2所示，發(fā)酵前23 d，隨著發(fā)酵天數(shù)的延長，刺梨果酒的綜合評(píng)價(jià)越來越好，發(fā)酵23 d和更長時(shí)間的果酒感官評(píng)定分?jǐn)?shù)無明顯差別。果酒的生產(chǎn)主要經(jīng)歷兩個(gè)階段：酒精發(fā)酵和陳釀。在酒精發(fā)酵階段，微生物將糖類分解并轉(zhuǎn)化為酒精。發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)入陳釀階段，這個(gè)階段發(fā)生的一些化學(xué)反應(yīng)不僅可以減少揮發(fā)酸、雜醇油等不良風(fēng)味物質(zhì)，提升果酒的香氣和口感，酒體更澄清，品質(zhì)更好[22]。

表2 刺梨果酒的感官評(píng)定結(jié)果Table 2 Sensory evaluation of Rosa roxburghiiTratt wine

2.2 刺梨果酒中化學(xué)成分的變化

在發(fā)酵過程中，刺梨果酒總酸、pH值、還原糖、酒精度等理化指標(biāo)均發(fā)生了變化。隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，總酸含量總體呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)（圖1a），發(fā)酵23 d時(shí)的總酸含量較初始值上升了2.01倍，隨后趨于穩(wěn)定；發(fā)酵液pH值呈現(xiàn)上升趨勢(shì)（圖1b），pH值在30 d僅從3.20增加至3.50，變化不大，說明刺梨果實(shí)發(fā)酵過程中有效酸的變化幅度較小[23]。在發(fā)酵過程中，總酸含量增加可能是乳酸菌[24]和酵母菌[25]發(fā)酵作用產(chǎn)酸導(dǎo)致的；在刺梨果實(shí)發(fā)育過程中由于抗壞血酸的不斷積累，導(dǎo)致總酸含量隨著果實(shí)發(fā)育不斷增加[26]，因此刺梨發(fā)酵過程中總酸含量變化也可能部分來源于發(fā)酵過程產(chǎn)生的抗壞血酸含量的增加。 發(fā)酵過程中還原糖的含量隨著發(fā)酵天數(shù)的延長，呈現(xiàn)出總體下降的趨勢(shì)（圖1c），而酒精度則呈現(xiàn)出上升趨勢(shì)（圖1d）。在第13天，發(fā)酵液還原糖含量迅速下降50.88%，第29天發(fā)酵液還原糖含量緩慢下降23.58%；在發(fā)酵第20天，酒精含量快速上升至9.63%vol，但第29天，酒精含量僅上升1.76%，接近發(fā)酵終點(diǎn)。發(fā)酵過程中還原糖和酒精度的含量與酵母菌的生長有關(guān)[23]。在發(fā)酵初期，酵母菌處于對(duì)數(shù)生長期，需要消耗大量的糖來用于自身生長代謝，而在發(fā)酵后期，隨著酒精含量升高，酵母菌生長速度下降，耗糖量也下降，所以還原糖含量下降趨勢(shì)變緩。

圖1 刺梨發(fā)酵制酒過程中總酸(a)、pH值(b)、還原糖(c)及酒精度(d)含量的變化Fig.1 Changes in the contents of total acid (a), pH (b), total sugar (c) and alcohol (d) during the fermentation of Rosa roxburghiiTratt

2.3 刺梨果酒中抗氧化成分的變化

在發(fā)酵過程中，刺梨果酒中總酚、總黃酮和抗壞血酸含量均發(fā)生了變化。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，總酚、總黃酮和抗壞血酸含量呈現(xiàn)顯著先升高后降低的趨勢(shì)（圖2）?？偡雍康?天上升5.05倍，隨后下降16.91%（圖2a）；總黃酮含量第9天上升10.37倍，隨后下降1.91%（圖2b）；抗壞血酸含量第9天上升2.53倍，隨后下降5.73%（圖2c）。Filannino等[27]研究乳酸菌發(fā)酵櫻桃汁和西蘭花濃漿過程中酚酸和類黃酮的代謝時(shí)發(fā)現(xiàn)乳酸菌在代謝過程中將大分子的酚類物質(zhì)水解成小分子酚類，使總酚含量增加；Danyue Zhao等[28]研究乳酸菌代謝茶酚類物質(zhì)的能力時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)菌改變酚類的成分以及使總酚含量的升高；有文獻(xiàn)報(bào)道細(xì)菌酶能夠?qū)⒍喾哟x成酚酸和其他小分子[29]。因此，我們推測(cè)刺梨自然發(fā)酵前期總酚含量增加可能是微生物將大分子酚類物質(zhì)轉(zhuǎn)化成小分子酚類物質(zhì)而導(dǎo)致的。第9天總酚含量下降，可能是酒精發(fā)酵過程中酚類化合物與蛋白質(zhì)甚至酵母菌的結(jié)合或吸附，誘導(dǎo)了這些化合物的損失[30]。總黃酮含量的變化與Escudero-López等[31]的研究一致：發(fā)酵過程中乙醇的存在有助于從刺梨的果肉中提取類黃酮；在第9天總黃酮含量降低可能是由于長時(shí)間發(fā)酵導(dǎo)致黃酮類化合物的分解。在刺梨果實(shí)中，抗壞血酸含量非常高[32]，發(fā)酵過程中酒精使其溶解在發(fā)酵液中，因此抗壞血酸含量增加；發(fā)酵后期抗壞血酸含量下降，可能有一些維生素發(fā)生了降解[33]。

圖2 刺梨發(fā)酵制酒過程中總酚(a)、總黃酮(b)、抗壞血酸(c)含量的變化Fig.2 Changes in the contents of total phenol (a), total flavonoid (b) and ascorbic acid (c) during the fermentation of Rosa roxburghiiTratt

2.4 刺梨果酒抗氧化活性能力的變化

DPPH、ABTS自由基清除能力和羥基自由基清除率變化趨勢(shì)能夠反映抗氧化活性能力的變化趨勢(shì)[34]。隨著發(fā)酵天數(shù)延長，刺梨自然發(fā)酵液的DPPH自由基清除率（圖3a）、ABTS自由基清除率（圖3b）和羥基自由基清除率（圖3c）呈現(xiàn)顯著先上升后降低的趨勢(shì)。在第9天時(shí)各清除率達(dá)到最高值，DPPH自由基清除率為30.82%，ABTS自由基清除率為89.80%，羥基自由基清除率為22.90%，隨后各清除率逐漸下降，這種趨勢(shì)與付龍威等[35]的研究結(jié)果一致：這可能與酚類物質(zhì)的變化趨勢(shì)有關(guān)。另外，刺梨發(fā)酵后的自由基清除能力增加這一變化與侯金麗等[36]研究刺梨植物乳桿菌飲料時(shí)結(jié)果相同。

圖3 刺梨發(fā)酵制酒過程中DPPH自由基清除率(a)、ABTS自由基清除率(b)、羥基自由基清除率(c)變化Fig.3 Changes in DPPH free radical scavenging rate (a), ABTS free radical scavenging rate (b), hydroxyl free radical scavenging rate (c) during the fermentation of Rosa roxburghiiTratt

2.5 抗氧化物質(zhì)含量變化與抗氧化活性變化的相關(guān)性分析

研究表明刺梨果實(shí)的抗氧化能力是多物質(zhì)協(xié)同作用的結(jié)果，其中總酚、總黃酮和Vc起著決定性作用，且總酚和總黃酮的貢獻(xiàn)大于Vc[37,38]。我們發(fā)現(xiàn)：刺梨自然發(fā)酵制酒過程中總酚含量和抗壞血酸含量的變化與三種自由基清除率的變化都呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系（表3），其中，總酚含量與三種自由基清除率的變化相關(guān)系數(shù)都大于0.90以上（P＜0.01），說明酚類物質(zhì)含量的變化是影響刺梨發(fā)酵酒發(fā)酵過程中抗氧化活性變化的主要因素[39,40]。此外，總黃酮含量的變化與DPPH、ABTS和羥基自由基清除率的變化都有顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），說明黃酮類化合物對(duì)刺梨發(fā)酵酒中抗氧化活性起著重要作用[41]。綜上所述說明發(fā)酵過程中抗氧化活性的變化與刺梨果酒中多酚、總黃酮和抗壞血酸含量變化有一定相關(guān)性。

表3 刺梨果酒中抗氧化物質(zhì)含量變化與抗氧化活性變化的相關(guān)性Table 3 Correlation between changes in the contents of antioxidant substance and antioxidant activity in Rosa roxburghiiTratt wine

2.6 刺梨發(fā)酵過程中的微生物分析

2.6.1 發(fā)酵過程中的優(yōu)勢(shì)菌菌落總數(shù)變化

在發(fā)酵過程中進(jìn)行代謝的微生物種類繁多，發(fā)酵過程中的主要微生物包括乳酸菌類和各類酵母菌 等[42,43]。刺梨發(fā)酵過程中，如圖4所示，酵母菌菌落總數(shù)在發(fā)酵前17 d增長至1.70×105CFU/mL，第17天后下降80%；乳酸菌菌落總數(shù)在第0~9天內(nèi)迅速增長至4.27×105CFU/mL，而第9~13天乳酸菌減少75.19%，后13 d緩慢減少。在發(fā)酵前期，發(fā)酵液中營養(yǎng)物和還原糖含量豐富，酵母菌和乳酸菌繁殖快，且乳酸菌的生長速率比酵母菌快，這是因?yàn)槿樗峋奶谴x能力比酵母菌的強(qiáng)[44]；第9天酵母菌產(chǎn)生酒精使發(fā)酵液中酒精度濃度增大，抑制了乳酸菌的生長繁殖，而酵母菌的酒精耐受性比乳酸菌的強(qiáng)，酵母菌生長繁殖數(shù)量依然增加。隨著發(fā)酵液中的營養(yǎng)成分不斷減少，酵母菌和乳酸菌生長進(jìn)入衰亡期。

圖4 刺梨發(fā)酵制酒過程中酵母菌(a)和乳酸菌(b)菌落總數(shù)Fig.4 Changes in total number of yeast (a) and lactic acid bacteria (b) during the fermentation of Rosa roxburghiiTratt

2.6.2 特定優(yōu)勢(shì)菌的菌種鑒定

從刺梨發(fā)酵制酒樣品中分離到的1株真菌及2株細(xì)菌，真菌菌落形態(tài)為圓形隆起、直徑為（3±1）mm、表面光滑、濕潤粘稠、邊緣整齊、乳白色、不透明、菌落背面為黃色、革蘭氏染色試驗(yàn)呈紫色（圖5a~b），ITS序列與釀酒酵母SH-4菌株同源性達(dá)99.75%（圖5c），因此確定該菌為釀酒酵母，命名為WP20201；細(xì)菌1菌落形態(tài)為圓形，顏色呈白色（圖5d），革蘭氏染色試驗(yàn)呈紫色（圖5e），16s rDNA序列比對(duì)與乳酸片球菌8471同源性達(dá)99.79%（圖5f），鑒定該菌為乳酸片球菌，命名為WP20202；細(xì)菌2菌落形態(tài)為呈圓形，中等大小，凸起，白色，邊緣整齊，直徑（3±1）mm，菌落背面為白色（圖5g），革蘭氏染色為紅色（圖5h），16s rDNA序列與棘皮鞘氨醇單胞菌MT89的同源性達(dá)100%（圖5i），將該菌定為棘皮鞘氨醇單胞菌，命名為WP20203。

圖5 刺梨發(fā)酵制酒樣品中的1株真菌及2株細(xì)菌的鑒定Fig.5 Identification of one fungus and two bacteria from the fermentation of Rosa roxburghiiTratt

3 結(jié)論

本文以刺梨為原料，經(jīng)過23 d自然發(fā)酵后果酒有最佳的品質(zhì)，酒體顏色金黃，有比較悅?cè)说墓闩c酒香，味道醇美柔和爽口，酸甜適中，具有刺梨果酒的典型風(fēng)格。發(fā)酵過程中，總酸含量呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，pH值呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，還原糖含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，酒精度總體呈上升趨勢(shì)；總酚、總黃酮和抗壞血酸含量先升高后降低；DPPH自由基清除率、ABTS自由基清除率和羥基自由基清除率呈顯著先上升后降低的趨勢(shì)，這與樣品中的總酚、總黃酮和抗壞血酸含量變化呈顯著相關(guān)；酵母菌和乳酸菌總數(shù)先上升后下降，其優(yōu)勢(shì)酵母為釀酒酵母，優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為乳酸片球菌和棘皮鞘氨醇單胞菌。研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明刺梨果酒保健功能機(jī)理和綜合性開發(fā)提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)依據(jù)，同時(shí)為優(yōu)化刺梨發(fā)酵工藝提供依據(jù)。然而，刺梨發(fā)酵制酒過程中釀酒酵母/乳酸片球菌/棘皮鞘氨醇單胞菌數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化、營養(yǎng)成分變化等特征還有待于后續(xù)進(jìn)一步研究。