喬西鳳，馬叢偉，張穎，林展樂，黃菁霞，林麗，張勇民，楊宜婷*，杜志云*

（1.廣東工業(yè)大學(xué)生物醫(yī)藥學(xué)院，廣東廣州 510006）（2.無限極（中國）有限公司，廣東廣州 510623） （3.佛山市康伲愛倫生物技術(shù)有限公司，廣東佛山 523281）（4.索邦大學(xué)分子化學(xué)研究所，法國巴黎 75005） （5.內(nèi)蒙古大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010021)

乳腺增生是一種以乳腺組織導(dǎo)管和小葉出現(xiàn)結(jié)構(gòu)退行性改變，以周期性乳房疼痛為主要特征的非炎癥、非腫瘤的慢性乳腺疾病[1]。因競爭壓力增加及生活習(xí)慣改變，本病以中年女性發(fā)病率較高，尤以肝郁氣滯型最常見，嚴(yán)重時可發(fā)展成乳腺癌[2-4]，西醫(yī)治療主要以激素類，如黃體酮、三苯氧胺及維生素類等為主，但這類藥物存在很大的副作用。中醫(yī)藥有著悠久且豐富的臨床治療經(jīng)驗，并以其經(jīng)濟、安全、副作用小，在治療乳腺增生中取得較好效果，已被廣大患者接受。中醫(yī)認(rèn)為乳腺增生屬于“乳癖”范疇，明代龔居中在《外科活人定本》[5]中載：“乳癖，此癥生于正乳之上，乃厥陰，陽明之經(jīng)所屬也……何謂之癖，若硬而不痛，如頑核之類”，介紹了乳癖與肝、脾間的關(guān)系。隨著多數(shù)醫(yī)學(xué)者對乳癖的逐漸認(rèn)識，發(fā)現(xiàn)其病因主要為情志、飲食和勞倦內(nèi)傷等，進而導(dǎo)致肝氣郁結(jié)、沖任不和、寒凝氣滯、瘀血阻絡(luò)，尋找具有相關(guān)功效的中草藥，對緩解乳腺增生疾病具有重要的價值。

枸杞為傳統(tǒng)的中藥材及藥食同源產(chǎn)品，近年來，作為一種具有高度優(yōu)勢的營養(yǎng)、預(yù)防和治療功能的超級功能性食品而備受矚目[6]。在中國藥典中，枸杞是一種有助于視力和長壽，以及平衡體內(nèi)陰陽協(xié)調(diào)來治療糖尿病的藥物[7,8]。同時，在抗腫瘤[9]、免疫調(diào)節(jié)[10,11]、血糖穩(wěn)態(tài)、脂質(zhì)代謝、促進男性生育等方面具有調(diào)控作用[12]。多糖、類胡蘿卜素和酚類物質(zhì)是枸杞中三種主要的活性物質(zhì)。枸杞多糖作為最重要的成分，是由6種單糖組成（葡萄糖，半乳糖，阿拉伯糖，鼠李糖，甘露糖和木糖）[13]。研究發(fā)現(xiàn)，枸杞多糖可調(diào)節(jié)雌激素代謝，抑制MCF-7細(xì)胞增殖作用[14]，還可通過激活ERK1/2通路抑制MCF-7細(xì)胞的細(xì)胞周期S期停滯、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡抑制細(xì)胞增殖作用[15]。枸杞多糖還可抑制乳腺炎小鼠組織中TNF-α表達水平[16]。研究發(fā)現(xiàn)，機體的免疫調(diào)節(jié)活性與生理功能息息相關(guān)，例如，炎癥、腫瘤及癌癥等的發(fā)生，均是機體免疫系統(tǒng)紊亂的結(jié)果。在植物多糖研究中，小鼠RAW264.7巨噬細(xì)胞常作為體外免疫調(diào)節(jié)研究的模型[17,18]，其能夠產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子，如腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β和分泌NO等炎癥介質(zhì)，來調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)[19]。

研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的原代正常人的乳腺上皮細(xì)胞仍具有體內(nèi)細(xì)胞的遺傳特性，且在體外聯(lián)合應(yīng)用E2和P可促進增殖[20]。因此，為擬構(gòu)建體內(nèi)乳腺組織良性增生模型，本研究通過體外E2+P聯(lián)合誘導(dǎo)小鼠乳腺上皮細(xì)胞增殖模型，MTT法檢測枸杞多糖對HC11細(xì)胞增殖作用，流式細(xì)胞術(shù)分析枸杞多糖對HC11細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期分布影響，ELISA檢測ERα表達水平，同時，通過LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞的炎癥模型，檢測炎癥介質(zhì)NO的產(chǎn)生，揭示枸杞多糖組分對E2+P聯(lián)合誘導(dǎo)HC11細(xì)胞增殖的抑制作用。本論文以枸杞多糖為研究對象，探索其分離純化、體外抗增殖及抗炎活性，為枸杞多糖的深度開發(fā)提供重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品試劑

枸杞，購自中國青海；小鼠乳腺上皮細(xì)胞（HC11細(xì)胞）、小鼠單核巨噬細(xì)胞（RAW264.7細(xì)胞），中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；細(xì)胞培養(yǎng)皿，美國Corning公司；MTT，美國Sigma公司；DEAE-52纖維素、大孔樹脂、G-50葡聚糖凝膠、G-25葡聚糖凝膠，北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司；乳癖消片（RPXP），遼寧恒仁藥業(yè)有限公司；黃體酮（P），浙江仙琚制藥股份有限公司蘇州分公司；苯甲酸雌二醇注射液（E2），寧波通用藥業(yè)股份有限公司；脂多糖（LPS，純度＞99%），美國Sigma公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、青霉素鏈霉素溶液、PBS緩沖液、0.25%胰蛋白酶、胎牛血清，美國Gibco公司；Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒、BCA蛋白濃度檢測試劑盒、雌激素受體（ERα）ELISA檢測試劑盒、一氧化氮（NO）檢測試劑盒，碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器

玻璃層析柱（內(nèi)徑12 mm×高度800 mm），偉業(yè)玻璃制品有限公司；N-1300V-W旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，東京理化；Infinite M200 Pro酶標(biāo)儀，美國Bio-Tek基因有限公司；TGL-16GA二氧化碳培養(yǎng)箱，美國Thermo公司；AUW120D電子分析天平，日本島津公司；VD-650超凈臺，江蘇通凈凈化設(shè)備公司；LC-2030C高效液相色譜儀，日本島津公司；ShedexOHpak HQSB 804色譜柱（8.0 mm×300 mm）與HQSB 802.5色譜柱 （8.0 mm×300 mm），日本島津公司；FACSCalibur流式細(xì)胞儀，美國Becton Dickinson公司。

1.3 枸杞多糖組分的提取與分離

稱取枸杞100 g，提取兩次，第一次加10倍量超純水，煮沸提取2 h；第二次加8倍量超純水，煮沸提取1 h[21,22]。80目篩網(wǎng)過濾，溫度65~80 ℃，真空度-0.04~0.07 MPa，濃縮至固形物含量為35%±5%，降溫出料。檢測固形物含量，先加濃縮液再邊攪拌邊緩慢加入乙醇，調(diào)至乙醇濃度為75%，靜置過夜（12 h以上）。抽取上清液，取出沉淀物。提取物在70~100 ℃烘箱烘干，獲得枸杞多糖。利用大孔樹脂，解吸已吸附的色素，洗滌大孔樹脂，使大孔樹脂再生。脫色2遍后，將多糖溶液在65 ℃的水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，濃縮后再脫色一次。采用Sevage法去除蛋白，向枸杞多糖溶液中加入氯仿:正丁醇混合溶劑（4:1，V/V），充分混勻60 min后離心取上清液。重復(fù)脫蛋白操作步驟共3次，對上清液進行濃縮，凍干后得枸杞粗多糖[23]。

依次用0.1 mol/L鹽酸、超純水、0.1 mol/L氫氧化鈉溶液，先對DEAE-52纖維素柱進行預(yù)處理；配制50 mg/mL的枸杞多糖水溶液，緩慢上樣5 mL，依次用超純水、2 mol/L氯化鈉溶液洗滌，分別收集樣品洗脫液，重復(fù)步驟多次。用超純水溶解配制50 mg/mL的枸杞多糖溶液，上樣5 mL，采用Sephadex G-50與Sephadex G-25葡聚糖凝膠柱分離純化，用超純水洗脫，按次序收集洗脫液。采用苯酚硫酸比色法檢測，以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo)，紫外分光光度法測的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制曲線。根據(jù)洗脫曲線，對同一洗脫峰的樣品進行合并，對洗脫液進行濃縮，干燥，收集單一枸杞多糖組分。

1.4 枸杞多糖組分平均相對分子量測定

取樣品2 mg，溶于0.4 mL 0.1 mol/L Na2SO4溶液中溶解（5 mg/mL），配制成 5 mg/mL的溶液，HQSB 804色譜柱與HQSB 802.5色譜柱串聯(lián)，流動相為 0.1 mol/L Na2SO4溶液，流速為0.6 mL/min，柱溫為35 ℃，進樣量為100 μL[24]。標(biāo)準(zhǔn)品為已知分子量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品，并將其將其配制成1.0 mg/mL的溶液，按上述條件測定標(biāo)準(zhǔn)品和枸杞多糖的保留時間，以葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品平均分子質(zhì)量的對數(shù)值lgMw為因變量，保留時間t為自變量，進行相關(guān)回歸分析，得到一元線性回歸方程，根據(jù)回歸方程，計算枸杞多糖樣品的平均分子量。

1.5 枸杞多糖組分對HC11細(xì)胞增殖作用

選擇對數(shù)生長期的HC11細(xì)胞傳代后，將密度調(diào)整為每毫升6×104個，取6×103個HC11細(xì)胞（100 μL）接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后，每孔替換加入含各濃度（0、5、25、125、250、500、1 000 μg/mL）枸杞多糖組分（GQ-01至GQ-07）的培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。去除舊培養(yǎng)基，用PBS清洗一遍并吸除。避光，每孔加入100 μL MTT（0.5 mg/mL）溶液，繼續(xù)孵育4 h。去除MTT溶液，加入200 μL DMSO，震蕩10 min，酶標(biāo)儀中570 nm檢測細(xì)胞存活率。

1.6 枸杞多糖組分對HC11細(xì)胞凋亡的作用

細(xì)胞鋪板至96孔板24 h后，替換加入2 mL E2（25 μg/mL）+P（250 μg/mL）誘導(dǎo)HC11細(xì)胞，及250 μg/mL枸杞粗多糖（GQ）與250 μg/mL枸杞多糖（GQ-01和GQ-06）及陽性對照乳癖消片（PRXP）濃度為500 μg/mL。組別設(shè)置為空白組，E2+P造模組，（E2+P）造模組+陽性對照組，（E2+P）造模+枸杞多糖組分組（GQ-01及GQ-06），每組設(shè)3個復(fù)孔，各多糖組分處理24 h后，收集細(xì)胞，PBS清洗一次，加入0.25%胰酶消化細(xì)胞，并加入細(xì)胞培養(yǎng)液輕吹打細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至離心管中，1 700 r/min離心5 min，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS重懸細(xì)胞并計數(shù)。各組樣品取5~10萬重懸的細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液輕重懸細(xì)胞，加5 μL Annexin V-FITC，輕混勻，再加10 μL PI染色液，室溫避光孵育10~20 min，立即用上流式細(xì)胞儀檢測。

1.7 枸杞多糖組分對HC11細(xì)胞的細(xì)胞周期作用

細(xì)胞鋪板及實驗分組同實驗步驟1.6，收集細(xì)胞后，加入預(yù)冷φ=70%乙醇4 ℃固定30 min，重懸于0.5 mL碘化丙啶（PI）溶液中，37 ℃避光溫浴30 min。利用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布。

1.8 枸杞多糖組分對HC11細(xì)胞的雌激素受體（ERα）表達水平的影響

細(xì)胞鋪板及實驗分組同實驗步驟1.6，24 h后取培養(yǎng)上清，1 200 r/min離心5 min，取上清液備用，利用BCA法測定蛋白濃度，再使用ERα試劑盒檢測其蛋白表達水平。

1.9 枸杞多糖組分對RAW264.7細(xì)胞毒性作用及NO水平檢測

根據(jù)實驗步驟1.5，檢測不同濃度枸杞多糖對RAW264.7細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用；篩選合適的濃度后，進行NO檢測實驗。將RAW264.7細(xì)胞鋪板至96孔板24 h，加入各枸杞多糖組分及LPS，組別分別設(shè)為不加藥物單加細(xì)胞組為空白組、1 μg/mL LPS組為陽性對照組、250 μg/mL枸杞多糖組分+LPS組為實驗組（GQ-01-GQ-07）。處理24 h后，檢測NO水平。

1.10 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析使用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，試驗結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，*代表P＜0.05表示數(shù)據(jù)有顯著差異，**代表P＜0.01表示數(shù)據(jù)有極顯著差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 枸杞多糖組分分離純化及平均相對分子質(zhì)量

目前在植物多糖分離純化中，通常采用離子交換色譜柱和凝膠色譜柱這兩種色譜柱對粗多糖組分進行分離，離子交換色譜柱主要通過不同多糖組分與離子交換劑間的作用力強弱不同進行分離，而凝膠色譜柱主要根據(jù)分子量大小進行分離[25]。研究發(fā)現(xiàn)采用DEAE纖維素柱和Sephadex G-150柱結(jié)合對枸杞多糖進行分離純化，最后獲得5個高純度組分[26]。

本研究采用DEAE-52離子色譜柱與Sephadex G-50、Sephadex G-25凝膠樹脂柱結(jié)合，通過對枸杞多糖的分離純化共獲得7種枸杞多糖組分，如表1所示，對DEAE纖維素柱已用超純水洗脫的枸杞多糖，通過G-50葡聚糖凝膠柱共分離純化出2種枸杞多糖組分（GQ-01、GQ-02）（表1）；對DEAE纖維素柱已用氯化鈉洗脫的枸杞多糖溶液，利用G-50葡聚糖凝膠與G-25葡聚糖凝膠柱共分離純化出5種枸杞多糖組分（GQ-03、GQ-04、GQ-05、GQ-06、GQ-07）（表1）。通過使用高效液相色譜分析其平均相對分子量，根據(jù)葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的lgMw為縱坐標(biāo)（y），保留時間t為橫坐標(biāo)（x），得線性回歸方程為y=11.17-0.234 1x（R2=0.994 3），計算枸杞多糖各組分的平均相對分子量（Mw），結(jié)果如表1所示，發(fā)現(xiàn)GQ-01相對分子質(zhì)量為113 ku，占比96.7%；GQ-02相對分子質(zhì)量為小于1 ku，占比為64.0%；GQ-03相對分子質(zhì)量分別為367 ku，占比62.08%；GQ-04相對分子質(zhì)量為613 ku，占比為70.3%；GQ-05相對分子質(zhì)量為81 ku的多糖，占比為71.2%；GQ-06相對分子質(zhì)量為110 ku的多糖，占比為52.7%；GQ-07相對分子質(zhì)量為小于1 ku的多糖，占比為53.9%。根據(jù)以上結(jié)果表明，共分離出2種分子量較大枸杞多糖組分GQ-03（367 ku）和GQ-04（613 ku）；3種中等分子量枸杞多糖組分GQ-01（113 ku）、GQ-05（81 ku）和GQ-06（110 ku）；2種小分子量的枸杞多糖組分GQ-02、GQ-07均小于1 ku。

表1 枸杞多糖組分平均相對分子質(zhì)量Table 1 Average relative molecular weights of Lyciumbarbarum polysaccharides components

2.2 枸杞多糖組分對HC11細(xì)胞增殖的影響

乳腺疾病的發(fā)生是一個漸進過程，從起初發(fā)病至嚴(yán)重癌變是乳腺上皮細(xì)胞增殖過度及細(xì)胞凋亡減弱的結(jié)果。為研究各枸杞多糖組分是否影響乳腺上皮細(xì)胞的增殖活性，利用MTT實驗檢測枸杞多糖組分對HC11細(xì)胞活力的作用。結(jié)果如圖1所示，當(dāng)用不同濃度（5、25、125、250、500、1 000 μg/mL）的枸杞多糖組分及陽性對照處理HC11細(xì)胞時，發(fā)現(xiàn)250 μg/mL（RPXP、GQ-01及GQ-06）即可極顯著抑制HC11細(xì)胞增殖（P＜0.01），HC11細(xì)胞活性分別降低了40.65%、36.74%、30.73%，且呈劑量依賴效應(yīng)。結(jié)果表明，當(dāng)用不同濃度枸杞多糖組分直接刺激HC11細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其對HC11細(xì)胞具有低濃度促進細(xì)胞增殖，高濃度抑制細(xì)胞增殖的作用。但枸杞多糖組分抑制HC11細(xì)胞增殖的濃度有所差異，僅有GQ-01及GQ-06隨著濃度的升高，會呈現(xiàn)更顯著抑制HC11細(xì)胞的過度增殖的作用。

圖1 枸杞多糖組分對HC11細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effects of Lyciumbarbarum polysaccharides components on the proliferation of HC11 cells

2.3 利用不同激素水平處理檢測枸杞多糖組分對HC11細(xì)胞增殖的影響

本研究利用E2與P聯(lián)合刺激HC11細(xì)胞，構(gòu)建HC11細(xì)胞增殖模型，結(jié)果如圖3所示，單獨用不同濃度（5~1 000 μg/mL）P處理HC11細(xì)胞，發(fā)現(xiàn) 250 μg/mL P會顯著促進HC11細(xì)胞增殖（P＜0.05），HC11細(xì)胞活性增加了11.70%（圖2a）；單獨用不同濃度（0.01~25 μg/mL）E2處理HC11細(xì)胞時，研究發(fā)現(xiàn)25 μg/mL E2可顯著促進HC11細(xì)胞增殖（P＜0.01）HC11細(xì)胞活性增加了20%（圖2b）；最后選擇不同濃度E2（0.01~25 μg/mL）與濃度為250 μg/mL P聯(lián)合處理HC11細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)當(dāng)25 μg/mL E2與250 μg/mL P聯(lián)合（濃度比為1:10）處理時，可極顯著促進HC11細(xì)胞增殖（P＜0.001），HC11細(xì)胞活性增加了36.25% （圖2c），結(jié)果表明，當(dāng)單獨使用P濃度為250 μg/mL或E2濃度為25 μg/mL時，均可顯著促進乳腺上皮細(xì)胞增殖。然而，當(dāng)25 μg/mL E2與250 μg/mL P聯(lián)合使用時，也可極顯著促進乳腺上皮細(xì)胞增殖，提示E2與P聯(lián)合使用比單獨使用E2或P，具有較好地促進乳腺上皮細(xì)胞增殖的作用。表明E2+P聯(lián)合誘導(dǎo)可在體外成功構(gòu)建小鼠乳腺上皮細(xì)胞增殖模型。

圖2 E2+P聯(lián)合誘導(dǎo)HC11細(xì)胞增殖Fig.2 E2+P joint induced HC11 cell proliferation

2.4 枸杞多糖組分對激素造模后的HC11細(xì)胞增殖的影響

為檢測枸杞多糖組分是否對E2+P聯(lián)合造模HC11細(xì)胞增殖的影響，利用MTT實驗檢測枸杞多糖組分處理造模后HC11細(xì)胞增殖活性。結(jié)果如圖3所示，與對照組比較，E2+P聯(lián)合處理HC11細(xì)胞模型組，可顯著促進HC11細(xì)胞增殖（P＜0.01）；與模型組比較，250 μg/mL（GQ-01，GQ-03，GQ-04，GQ-06）可顯著抑制E2+P聯(lián)合誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞增殖作用（P＜0.01），HC11細(xì)胞活性分別降低了28.13%、22.15%、26.74%、30.83%，其中隨著濃度增加，GQ-01、GQ-04及GQ-06對HC11細(xì)胞的抑制作用增強，存在統(tǒng)計學(xué)意義，并具有劑量依賴效應(yīng)，尤其，GQ-01與GQ-06對HC11細(xì)胞的抑制率更高，表明250 μg/mL枸杞多糖組分（GQ-01及GQ-06）可顯著抑制HC11細(xì)胞增殖作用。

圖3 枸杞多糖組分抑制E2+P聯(lián)合誘導(dǎo)HC11細(xì)胞增殖Fig.3 Lyciumbarbarum polysaccharides components inhibited (E2+P)-induced the proliferation of HC11 cells

2.5 枸杞多糖組分對HC11細(xì)胞凋亡的影響

乳腺增生的發(fā)病主要由雌、孕激素比例失調(diào)，雌激素水平較高，導(dǎo)致Bcl-2蛋白（抗凋亡因子）的大量表達，抑制線粒體細(xì)胞色素C的釋放，無法激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase），抑制細(xì)胞凋亡，進而造成乳腺上皮細(xì)胞的過度增殖，使乳腺組織過度增生和復(fù)舊不全[27,28]。組織細(xì)胞凋亡也叫程序性死亡，是一種由遺傳控制的有序的死亡形式[29]。本研究利用流式細(xì)胞儀檢測枸杞多糖組分對HC11細(xì)胞凋亡作用。結(jié)合2.2及2.4實驗結(jié)果，選擇GQ-01及GQ-06用于流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡作用。結(jié)果如圖5所示，與正常組（圖4a）相比，E2+P誘導(dǎo)模型組中凋亡細(xì)胞未見明顯增多（圖4b）；與模型組比較，GQ-01及GQ-06處理后，未見明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象 （圖4e、4f）。結(jié)果表明，在體外，枸杞多糖可能不是通過影響細(xì)胞凋亡來抑制HC11細(xì)胞增殖作用，具體機制還需進一步探究。

圖4 枸杞多糖對E2+P聯(lián)合誘導(dǎo)HC11細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effect of Lyciumbarbarum polysaccharides components on (E2+P)-induced apoptosis in HC11 cells

2.6 枸杞多糖組分對HC11細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞周期是由G0/G1期向S期過渡，使細(xì)胞由靜止的G0/G1期向DNA合成器（S期）即S轉(zhuǎn)化，并為細(xì)胞由S期向活躍的有絲分裂期G2/M期轉(zhuǎn)化提供有利條件，而增強細(xì)胞增殖[30]。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測枸杞多糖組分對細(xì)胞周期分布的影響，結(jié)果如圖5所示，與對照組比較，模型組（E2+P）可降低G0/G1的比例，G2/M期的HC11細(xì)胞比例增加；與模型組比較，GQ、GQ-01、GQ-06組的G2/M期的細(xì)胞比例降低，G0/G1期比例逐漸增加。此結(jié)果表明枸杞多糖組分在體外可能通過調(diào)節(jié)G0/G1、G2/M期的轉(zhuǎn)變，影響細(xì)胞周期分布及進程，進而抑制乳腺上皮細(xì)胞的過度增殖，但具體的作用機制還需進一步研究。

圖5 枸杞多糖組分對E2+P誘導(dǎo)HC11細(xì)胞的細(xì)胞周期分布的 影響Fig.5 Effect of Lyciumbarbarum polysaccharides components on (E2+P)-induced cell cycle distribution in HC11 cells

2.7 枸杞多糖組分對HC11細(xì)胞中雌激素受體（ERα）水平的影響

在前期研究中發(fā)現(xiàn)，枸杞粗多糖可顯著抑制乳腺增生小鼠中ERα的表達水平[22]。本研究通過ELISA實驗檢測乳腺增生小鼠中ERα的表達水平。結(jié)果如 圖6所示，與空白組比較，枸杞多糖組分極顯著抑制E2+P誘導(dǎo)的ERα的水平（P＜0.01）；與模型組比較，GQ-01顯著抑制E2+P誘導(dǎo)的ERα的水平，ERα水平降低了4.90%（P＜0.05），而RPXP與GQ-06極顯著抑制E2+P誘導(dǎo)的ERα的水平，ERα水平分別降低了6.36%、5.54%（P＜0.01）。研究發(fā)現(xiàn)E2升高或P缺乏會引起E2/P比例失調(diào)而引起乳腺上皮細(xì)胞的過度增殖。增殖細(xì)胞又會通過激素受體系統(tǒng)促進ER和孕激素受體（PR）的合成，形成病理性的增殖循環(huán)。ER和PR可結(jié)合E2和P。ER含有ERα和ERβ兩個亞基，可與E2結(jié)合形成激素受體復(fù)合物[31]。E2可促進乳腺上皮細(xì)胞中ER和PR的表達，增加乳腺組織對激素的敏感性而誘導(dǎo)乳腺增生的產(chǎn)生[32]。因此，結(jié)果表明GQ-06能通過抑制ERα的水平，抑制乳腺上皮細(xì)胞的表達，緩解乳腺增生的癥狀。

圖6 枸杞多糖組分抑制E2+P誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞的ERα的產(chǎn)生Fig.6 Lyciumbarbarum polysaccharides components inhibited (E2+P)-induced the production of ERα in HC11 cells

2.8 枸杞多糖組分對RAW264.7細(xì)胞的NO水平的影響

RAW264.7細(xì)胞為小鼠體內(nèi)的單核巨噬細(xì)胞，能對外界刺激產(chǎn)生促炎因子，如IL-6、TNF-α及分泌NO等炎癥介質(zhì)，間接殺死病原體[19]。NO是由iNOS合成，是許多器官引起炎癥的炎癥調(diào)節(jié)子，可調(diào)節(jié)許多生理與病理條件，包括神經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)與炎癥反應(yīng)。盡管NO在抗腫瘤，抗病毒復(fù)制及其他疾病中發(fā)揮重要作用，但過量NO的產(chǎn)生會危害宿主的健康[33]。因此，抑制過量的NO，可抑制炎癥作用。巨噬細(xì)胞可通過LPS誘導(dǎo)活化，產(chǎn)生大量NO等炎癥介質(zhì)，適量的炎癥介質(zhì)可提高機體免疫反應(yīng)及修復(fù)機體損傷，而過量或持續(xù)產(chǎn)生NO等炎癥介質(zhì)則會引起細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷和凋亡[34]。因此，本文檢測了枸杞多糖組分對RAW264.7巨噬細(xì)胞中NO水平的調(diào)節(jié)，結(jié)果如圖7所示，隨著枸杞多糖濃度升高，細(xì)胞增殖率越高，表明細(xì)胞毒性越?。▓D7a），因此，選擇250 μg/mL的枸杞多糖進行后續(xù)實驗。利用NO檢測試劑盒發(fā)現(xiàn)，與空白組比較，LPS可誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞的NO水平的產(chǎn)生（P＜0.001）；與LPS組比較，RPXP、GQ、GQ-04及GQ-06可顯著抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞中NO水平的產(chǎn)生、其巨噬細(xì)胞中NO水平分別降低了12.82%、29.46%、13.43%、12.65%（P＜0.05）（圖7b）。王瑩等[25]發(fā)現(xiàn)兩種枸杞多糖組分可促進巨噬細(xì)胞的增殖與吞噬能力。楊青等[35]發(fā)現(xiàn)枸杞多糖可顯著促進巨噬細(xì)胞由M2向M1的極化狀態(tài)轉(zhuǎn)變，有助于促進巨噬細(xì)胞來抵抗小鼠胰腺癌細(xì)胞的毒性作用，從而達到抗炎及抗腫瘤的作用。因此，本結(jié)果表明GQ-04及GQ-06可抑制LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)機體的免疫反應(yīng)。

圖7 枸杞多糖組分調(diào)節(jié)RAW264.7巨噬細(xì)胞中NO水平的產(chǎn)生Fig.7 Lyciumbarbarum polysaccharide components regulates the production of NO in RAW264.7 macrophages

3 結(jié)論

本研究共分離純化7種不同分子量的枸杞多糖組分，2種為枸杞中性多糖，5種為枸杞酸性多糖。在體外實驗中，通過E2+P聯(lián)合誘導(dǎo)HC11細(xì)胞增殖模型發(fā)現(xiàn)GQ-01，GQ-03，GQ-06對E2+P誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞增殖具有明顯抑制作用，GQ-01及GQ-06可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期分布影響HC11細(xì)胞增殖，但其對細(xì)胞凋亡作用無影響；GQ-06可顯著抑制E2+P聯(lián)合誘導(dǎo)的HC11細(xì)胞產(chǎn)生ERα的水平；同時，發(fā)現(xiàn)GQ-04和GQ-06可顯著抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞的NO水平的產(chǎn)生。綜上，發(fā)現(xiàn)GQ-06（Mw=110 ku）可能主要通過抑制乳腺上皮細(xì)胞的過度增殖，及抑制巨噬細(xì)胞的炎癥作用，而發(fā)揮抗乳腺細(xì)胞增殖及抗炎癥活性。隨著多糖研究的不斷深入，枸杞多糖作為一種天然產(chǎn)物，也將為功能性食品的開發(fā)與應(yīng)用提供重要的理論依據(jù)。