郭 鳳，黃 偉，王佩紅，趙 莉

(漢中市中心醫(yī)院1.婦科；2.神經(jīng)外科，陜西 漢中 723000)

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，僅在美國，每年就有大約13 000例新診斷宮頸癌[1]。中國宮頸癌的發(fā)病率遠(yuǎn)高于美國或其他發(fā)達(dá)國家，并且很多婦女初次診斷就已是宮頸癌晚期，嚴(yán)重影響患者的治療效果及預(yù)后[2]。人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)16、HPV18感染是宮頸癌發(fā)生的主要原因之一[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類20～22nt、非編碼的RNA，其通過完全或不完全堿基互補(bǔ)結(jié)合靶基因mRNA 的3′非編碼區(qū)(3′ UTR)，從轉(zhuǎn)錄水平或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因表達(dá)，進(jìn)而影響各項(xiàng)生命活動(dòng)[4]。研究表明，miRNA可以作為致癌或腫瘤抑制因子廣泛調(diào)節(jié)宮頸癌細(xì)胞的增殖、遷移或凋亡[5]。但是miRNA與高危型HPV相關(guān)宮頸癌的相互作用還需進(jìn)一步的探討；本研究旨在探索miR-944在HPV16陽性宮頸癌患者組織中的表達(dá)情況，及其對(duì)于宮頸癌的早期診斷價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2020年12月在漢中市中心醫(yī)院就診的宮頸癌患者113例作為實(shí)驗(yàn)組，其中HPV16陽性70例，HPV 16陰性43例；并將同期在我院進(jìn)行良性腫瘤切除術(shù)的78例患者作為對(duì)照組。兩組患者年齡、分娩史、絕經(jīng)比例等差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

實(shí)驗(yàn)組納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)后病理診斷為宮頸癌；②術(shù)前檢測HPV16呈陽性或陰性；③病理資料完整；④術(shù)前未接受放化療且治療前半年內(nèi)未服用激素類藥物。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前診斷HPV16為陰性；②良性疾病行子宮切除患者，排除宮頸病變。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他惡性腫瘤；②嚴(yán)重心肝腎功能不全者；③患有嚴(yán)重感染性疾病患者。參加本研究的所有患者及家屬均簽署知情同意書；本研究已通過我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 HE染色

宮頸癌患者接受根治性子宮切除術(shù)+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)獲取腫瘤組織和癌旁組織；良性腫瘤患者行子宮全切術(shù)或?qū)m頸活檢。獲取組織后，即置于液氮或-80℃冰箱保存。組織經(jīng)10%福爾馬林固定后，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋并切片，切片厚度為4μm。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，并經(jīng)無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇和蒸餾水水化后，使用蘇木素染色5～10min，1%鹽酸乙醇分化5～10s，并使用1%氨水反藍(lán)，伊紅染色1～3min，脫水透明，干燥后加滴中性橡膠封固，鏡檢。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測miR-944組織表達(dá)情況

將組織標(biāo)本采用液氮研磨，并采用TRIzol法提取組織總RNA，并通過Nanodrop 2000及瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的濃度和純度，A260/A280處于1.8～2.1時(shí)可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；取1μg總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real time fluorescent quantitative PCR，qRT-PCR)檢測miR-944表達(dá)，嚴(yán)格按照SYBR Green PCR試劑盒操作。引物序列為：miR-944上游引物：5′-CGCGAGCAGGAAATTATTGTA-3′，下游引物：5′-TATGCTTGTTCTCGTCTCTGTGTC-3′；內(nèi)參為U6，上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′，所有引物由上海生工合成。擴(kuò)增程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5min，95℃變性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)結(jié)束后采用2-ΔΔCt計(jì)算miR-944的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組患者病理切片對(duì)比

兩組患者的組織切片進(jìn)行HE染色后，對(duì)照組未見上皮細(xì)胞惡性病變組織，宮頸組織上皮層均為分化成熟的上皮細(xì)胞，細(xì)胞胞漿豐富，且上皮層未見挖空細(xì)胞，無核分裂現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)組宮頸癌組織顯示上皮大部分細(xì)胞異型性明顯，有挖空細(xì)胞，基底細(xì)胞非典型性，成熟結(jié)構(gòu)紊亂，核分裂現(xiàn)象明顯，見圖1。

注：A.對(duì)照組；B.實(shí)驗(yàn)組。

2.2 兩組患者miR-944表達(dá)差異

miR-944在實(shí)驗(yàn)組HPV16陽性患者的相對(duì)表達(dá)量為2.55±0.34；在實(shí)驗(yàn)組HPV16陰性患者中的相對(duì)表達(dá)量為1.88±0.43，在對(duì)照組中的相對(duì)表達(dá)量為1.38±0.41，miR-944表達(dá)在實(shí)驗(yàn)組HPV16陽性患者、實(shí)驗(yàn)組HPV16陰性患者及對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=189.516，P<0.05)。兩兩比較顯示，實(shí)驗(yàn)組患者miR-944的相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組中HPV16陽性患者 miR-944的相對(duì)表達(dá)量顯著高于HPV16陰性患者(P<0.05)。見圖2。

圖2 不同患者miR-944的表達(dá)差異Fig.2 Differences in expression of miR-944 in different groups of patients

2.3 宮頸癌組織與癌旁組織miR-944表達(dá)差異

比較實(shí)驗(yàn)組患者腫瘤組織與癌旁組織miR-944表達(dá)差異，結(jié)果見圖3。腫瘤組織miR-944的相對(duì)表達(dá)量為2.26±0.46，明顯高于癌旁組織的1.32±0.39，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=17.392，P<0.05)。

圖3 宮頸癌患者腫瘤組織與癌旁組織miR-944的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative expressions of miR-944 in the cancer tissues and the adjacent tissues

2.4 ROC曲線評(píng)估m(xù)iR-944對(duì)宮頸癌的診斷價(jià)值

ROC曲線評(píng)估m(xù)iR-944對(duì)宮頸癌的診斷價(jià)值，結(jié)果見圖4。ROC曲線下面積AUC為0.855，95%CI為0.790～0.921，敏感度為71.40%，特異度為97.30%，Youden指數(shù)為0.688，截?cái)嘀禐?.54。

圖4 miR-944對(duì)宮頸癌診斷的ROC曲線Fig.4 ROC curve of miR-944 for diagnosing cervical cancer

2.5 miR-944與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)相關(guān)性

按照miR-944相對(duì)表達(dá)量的中位數(shù)(2.24)將實(shí)驗(yàn)組又分為miR-944低表達(dá)組(n=55)和miR-944高表達(dá)組(n=58)。分析miR-944與實(shí)驗(yàn)組患者臨床病理學(xué)參數(shù)的相關(guān)性，結(jié)果顯示miR-944與年齡、腫瘤大小無明顯關(guān)系(P>0.05)；與HPV16感染、組織分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯相關(guān)(P<0.05)，見表1。

表1 miR-944與宮頸癌患者臨床病理參數(shù)相關(guān)性[n(%)]Table 1 Correlations of miR-944 with clinicopathological parameters of the patients with cervical cancer [n(%)]

3 討論

3.1 HPV16陽性與宮頸癌發(fā)生的相關(guān)性

HPV與高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)和宮頸癌的發(fā)生密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)40%～80%的宮頸癌患者屬于單一HPV類型。HPV根據(jù)生物學(xué)特性分為高危型和低危型，其中高危型的E6和E7基因是宮頸癌發(fā)生的重要因子，E6通過泛素化水解途徑降解轉(zhuǎn)錄因子p53，E7可介導(dǎo)腫瘤抑制因子pRB的降解；進(jìn)而促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生[6]。Tao等[7]人調(diào)查了上海人群所有類型宮頸癌細(xì)胞學(xué)標(biāo)本中個(gè)體高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)的患病率和致癌風(fēng)險(xiǎn)，發(fā)現(xiàn)HPV16/18在高級(jí)別的宮頸病變和鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞學(xué)中分別有53.6%和66.7%的表達(dá)，由此可見，HPV16在宮頸癌變中是最常見的HPV亞型，需要引起臨床工作者重視。

3.2 MiR-944在惡性腫瘤中的作用機(jī)制

MiRNAs參與調(diào)節(jié)多種生理活動(dòng)，并且miRNAs在多種腫瘤組織中呈異常表達(dá)，作為調(diào)控基因影響腫瘤進(jìn)展，也可作為癌癥的診斷和預(yù)后的預(yù)測標(biāo)志物。已有多個(gè)研究表明miR-944在不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展中有重要作用，Tang等[8]人在大腸癌患者的臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)miR-944可以作為腫瘤抑制因子而抑制大腸癌的發(fā)現(xiàn)，其發(fā)現(xiàn)大腸癌組織中，miR-944表達(dá)下調(diào)，并且miR-944表達(dá)與原發(fā)腫瘤、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移及TNM(tumor node metastasis )分期、浸潤程度呈明顯負(fù)相關(guān)。雙熒光素酶報(bào)告子分析表明，miR-944在結(jié)構(gòu)上與GATA結(jié)合蛋白6(GATA6)結(jié)合，并與CRC細(xì)胞中的下游蛋白(CRT和p-AKT)相互作用而抑制大腸癌細(xì)胞的生物學(xué)行為。Jiang等[9]人也發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(GSCs)外泌體miR-944通過抑制VEGFC的表達(dá)和AKT/ERK信號(hào)通路來抑制膠質(zhì)瘤的生長、進(jìn)展和血管生成。通過以上結(jié)果表明，miR-944在不同類型的腫瘤中發(fā)揮不同的作用。

3.3 MiR-944在宮頸癌中的研究進(jìn)展

MiR-944在宮頸癌進(jìn)展中的作用也有所研究，李新菊等[10]人發(fā)現(xiàn)miR-944在宮頸癌細(xì)胞和組織中表達(dá)升高，并且能通過靶向調(diào)控S100PBP基因促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖和遷移。本研究也有相似的結(jié)果，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的宮頸癌組織miR-944表達(dá)顯著升高，并且HPV16陽性患者miR-944表達(dá)顯著高于HPV16陰性。采用ROC曲線評(píng)估m(xù)iR-944的診斷價(jià)值，結(jié)果顯示AUC為0.855，95%CI為0.790～0.921，敏感度為71.4%，特異度為97.3%；miR-944與年齡、腫瘤大小無明顯關(guān)系(P>0.05)；與HPV16感染、組織分化程度、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯有關(guān)(P<0.05)。所以miR-944在宮頸癌的臨床診斷中有重要作用，并且與病理學(xué)參數(shù)關(guān)系密切，可為臨床醫(yī)生制定治療方案提供新思路。

綜上，miR-944在HPV16相關(guān)的宮頸癌組織中差異表達(dá)，并且對(duì)于宮頸癌的早期診斷具有重要價(jià)值，也可作為治療的潛在靶點(diǎn)；后期的研究中可通過體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究其在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制。