劉軍軍，劉單陽，李達(dá)容，王慧，趙勇,2,3，孫曉紅,2,3*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室，上海，201306)3(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306)

副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是一種革蘭氏陰性、嗜鹽菌，廣泛存在于海洋、河口和淡水環(huán)境中，人類感染V.parahaemolyticus可引起腹瀉、腸胃炎等[1]。據(jù)中國食源性疾病監(jiān)測系統(tǒng)和美國疾病控制中心統(tǒng)計，V.parahaemolyticus是食源性細(xì)菌中毒的主要原因之一[2]。聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，2019年全球人均水產(chǎn)品消費量為20.5 kg，其中水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量高于捕撈量[3]。據(jù)文獻(xiàn)統(tǒng)計，V.parahaemolyticus在養(yǎng)殖蝦類中檢出率為50%～100%[4]，在養(yǎng)殖淡水魚類中檢出率為5.80%～13.13%[5]。V.parahaemolyticus在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的高污染率增加了人類致病風(fēng)險。

水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中抗生素的使用及殘留易導(dǎo)致V.parahaemolyticus產(chǎn)生耐藥性。國內(nèi)對流通環(huán)節(jié)、餐飲和臨床中V.parahaemolyticus耐藥性研究較多，而對養(yǎng)殖水產(chǎn)品中V.parahaemolyticus耐藥性研究較少。目前研究發(fā)現(xiàn)分離自養(yǎng)殖水產(chǎn)品中的V.parahaemolyticus對四環(huán)素類、喹諾酮類、頭孢菌素和氯霉素類等臨床藥物具有耐藥性[6-7]。其中，四環(huán)素和環(huán)丙沙星作為臨床用于治療V.parahaemolyticus引起的重癥或長期疾病[8]，其耐藥性的產(chǎn)生將對臨床治療造成不良影響。因此，耐藥菌株的出現(xiàn)對臨床和水產(chǎn)養(yǎng)殖中有效治療V.parahaemolyticus感染存在安全隱患。

持續(xù)監(jiān)測養(yǎng)殖水產(chǎn)品中V.parahaemolyticus致病性和耐藥性對保障人類健康和水產(chǎn)品質(zhì)量及指導(dǎo)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)合理使用抗生素具有重要意義。本研究分離了上海市主要養(yǎng)殖水產(chǎn)品及養(yǎng)殖環(huán)境中的V.parahaemolyticus，分析其血清型、毒力基因、耐藥表型和遺傳多樣性，為上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖中V.parahaemolyticus的深入研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗菌株

大腸埃希菌(ATCC 25922)、副溶血性弧菌(ATCC 17802、ATCC 33847)，美國菌種保藏中心。

1.1.2 藥品試劑

3% NaCl堿性蛋白胨水(alkaline peptone water, APW)、TCBS培養(yǎng)基、陽離子調(diào)節(jié)肉湯，北京陸橋技術(shù)股份有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒-TIANamp Bacteria DNA Kit，天根生化科技有限公司；瓊脂糖、Gelred核酸染料、1×TAE粉末顆粒、DNA Marker L2000，上海擎科生物股份有限公司；PremixTaqDNA聚合酶，南京諾唯贊股份有限公司；引物由上海生工生物股份有限公司合成；氨芐西林(ampicillin，AMP)、美羅培南(meropenem，MEM)、頭孢唑啉(cefazolin，CZ)、頭孢吡肟(cefepime，F(xiàn)EP)、四環(huán)素(tetracycline，TE)、環(huán)丙沙星(ciprofloxacin，CIP)、磺胺甲惡唑(sulfamethoxazole，SMZ)、甲氧芐啶(trimethoprim，TMP)、阿奇霉素(azithromycin，AZ)、氯霉素(chloramphenicol，C)和呋喃妥因(nitrofurantoin，NIT)，上海麥克林生化科技有限公司；亞胺培南(imipenem，IPM)、頭孢西丁(cefoxitin，F(xiàn)OX)，上海源葉生物科技有限公司；頭孢噻肟鈉(cefotaxime，CTX)、強(qiáng)力霉素鹽酸鹽(doxycycline，DOX)、氧氟沙星(ofloxacin，OFL)、紅霉素(erythromycin，E)、硫酸卡那霉素(kanamycin，K)、硫酸慶大霉素(gentamicin，CN)，上海生工生物股份有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

Airstream?A2型二級生物安全柜，Esco China公司；TProfessional Standard Thermocyler，Biometra公司；Bio-Tek酶標(biāo)儀，美國伯騰儀器有限公司；凝膠電泳儀，蘇州賽恩斯儀器有限公司；Bio-Rad凝膠成像分析儀，美國伯樂公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 水產(chǎn)樣品采集

2020年6月—2021年10月，從上海市27家養(yǎng)殖場共采集水產(chǎn)品(南美白對蝦、草魚、鯽魚、河蟹)及養(yǎng)殖環(huán)境樣本(養(yǎng)殖水和底泥)234份。樣品置于4 ℃采樣箱運回實驗室，當(dāng)天進(jìn)行處理。

1.2.2 副溶血性弧菌的分離純化與鑒定

V.parahaemolyticus分離參照GB 4789.7—2013進(jìn)行，疑似菌株進(jìn)一步通過PCR擴(kuò)增V.parahaemolyticus種特異性基因tlh[9]，引物如表1所示。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中120 V電泳30 min后，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)分析。陽性擴(kuò)增產(chǎn)物測序后，與NCBI上Blast數(shù)據(jù)庫比對確定。分離的V.parahaemolyticus菌株與25%(體積分?jǐn)?shù))甘油混合凍存于-80 ℃中。

1.2.3 副溶血性弧菌毒力基因檢測

挑取凍存管中菌液分別于3% NaCl APW肉湯中，200 r/min 37 ℃培養(yǎng)6～12 h，根據(jù)細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株基因組DNA。參考NARAYANAN等[10]和郭書林等[11]方法，通過PCR檢測V.parahaemolyticus熱穩(wěn)定性直接溶血素基因(tdh)和熱穩(wěn)定性相關(guān)溶血素基因(trh)，急性肝胰腺壞死編碼基因pirA，引物及退火溫度如表1所示。25 μL反應(yīng)體系為Mix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、模板1 μL。擴(kuò)增條件：95 ℃，5 min；94 ℃ 30 s，58/55/53 ℃(依次對應(yīng)tdh、trh、pirA)30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)，72 ℃ 7 min。以ATCC 17802(tdh-、trh+、pirA-)、ATCC 33847(tdh+、trh-、pirA-)為陽性對照菌株。

1.2.4 副溶血性弧菌血清型檢測

V.parahaemolyticus的O群血清型檢測參考NARAYANAN等[10]方法，多重PCR分別為，組1：O1、O2、O4、O5、O6、O10；組2：O3/O13、O7、O8、O9、O11、O12。反應(yīng)體系為Mix 12.5 μL、10 μmol/L上下游引物各0.5 μL、模板1 μL，以ddH2O補(bǔ)足25 μL反應(yīng)體系。多重PCR程序優(yōu)化后，進(jìn)行血清型檢測。引物及退火溫度如表1所示。

表1 實驗所用引物

1.2.5 副溶血性弧菌抗生素敏感性分析

參考美國臨床與實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)規(guī)定，使用微量肉湯稀釋法檢測V.parahaemolyticus對10類19種抗生素敏感性?？股販y試濃度范圍及判斷標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。大腸埃希氏菌ATCC 25922為質(zhì)控菌株，依據(jù)CLSI M45 2015版藥敏準(zhǔn)則進(jìn)行結(jié)果判定，分別為敏感(susceptible，S)、中介(intermediate，I)和耐藥(resistant，R)。根據(jù)結(jié)果計算V.parahaemolyticus抗生素多重耐藥(multiple antibiotic resistance，MAR)指數(shù)[12]。

表2 抗生素測試濃度范圍及敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.6 腸桿菌基因間重復(fù)序列(enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence, ERIC)-PCR聚類分析

ERIC-PCR引物序列及反應(yīng)條件參照謝騰飛[13]的方法，ERIC-PCR擴(kuò)增引物：Eric1：5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3′；Eric1：5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′；25 μL反應(yīng)體系為Mix 12.5 μL、ddH2O 8.5 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、模板2 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃，5 min；94 ℃ 45 s，52 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)，72 ℃ 10 min。取8 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中100 V電泳45 min，經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)得到電泳圖進(jìn)行分析，有條帶記為1，無條帶記為0。輸出結(jié)果經(jīng)NTsys-pc軟件使用非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA)進(jìn)行聚類分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗重復(fù)平行3次，使用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，P<0.05認(rèn)為統(tǒng)計學(xué)上有差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 水產(chǎn)品中副溶血性弧菌污染分析

234份養(yǎng)殖水產(chǎn)品及環(huán)境樣本中V.parahaemolyticus總檢出率為30.8%。如表3所示，不同水產(chǎn)品養(yǎng)殖類型中南美白對蝦養(yǎng)殖中V.parahaemolyticus檢出率最高，為53.2%，其次為河蟹和淡水魚養(yǎng)殖，檢出率分別為21.1%、6.9%。南美白對蝦、草魚、鯽魚和河蟹4種水產(chǎn)品中南美白對蝦中V.parahaemolyticus檢出率最高(78.4%)，且不同水產(chǎn)品檢出率之間存在顯著性差異(χ2=27.686，P<0.05)。不同類型水產(chǎn)品中V.parahaemolyticus檢出率高于對應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境樣本。

表3 上海市水產(chǎn)樣本中副溶血性弧菌的檢出率

2.2 不同季節(jié)樣本中副溶血性弧菌污染分析

為進(jìn)一步表征V.parahaemolyticus的豐度是否受季節(jié)溫度影響，對水產(chǎn)養(yǎng)殖中V.parahaemolyticus在不同季節(jié)的分布進(jìn)行統(tǒng)計分析。如表4所示，夏季檢出率最高，為51.4%，其次為秋季、春季，檢出率分別為35.6%、9.5%，冬季未檢出，不同季節(jié)V.parahaemolyticus檢出率之間存在顯著差異(χ2=59.005，P<0.05)。

表4 不同季節(jié)樣本中副溶血性弧菌檢出率

2.3 副溶血性弧菌毒力基因檢測結(jié)果

毒力基因tdh、trh和pirA分別是判斷V.parahaemolyticus對人類和水產(chǎn)品是否具有致病潛力的指標(biāo)。采用PCR法分別對分離的V.parahaemolyticus進(jìn)行tdh、trh和pirA基因擴(kuò)增。檢測結(jié)果表明，所有分離株均未檢出相關(guān)毒力基因。

2.4 副溶血性弧菌血清型檢測結(jié)果

為了解水產(chǎn)養(yǎng)殖中V.parahaemolyticus血清型分布，采用多重PCR檢測V.parahaemolyticus血清型。如表5所示，72株V.parahaemolyticus可分為10種血清型，血清型分布具有多樣性。其中，O1血清群為優(yōu)勢血清群(66.7%)，其次為O3/O13血清群(9.7%)，其他7種血清群檢出菌株數(shù)均<5株。南美白對蝦養(yǎng)殖中V.parahaemolyticus血清型多樣性最高，共檢出8種。

表5 不同樣本類型中副溶血性弧菌血清型分布

2.5 藥敏試驗結(jié)果

2.5.1 抗生素敏感性實驗結(jié)果

采用微量肉湯法檢測72株V.parahaemolyticus對10類19種抗生素的敏感性。如圖1所示，V.parahaemolyticus對青霉素類、碳青霉烯類、頭孢菌素類、氯霉素類、磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類抗生素均有抗性，其中對AMP和SMZ耐藥率均為100.0%，所有菌株對一代頭孢菌素CZ和大環(huán)內(nèi)酯類E均耐藥(CZ：93.1%；E：72.2%)或中介(CZ：6.9%；E：27.8%)。除一代頭孢菌素CZ外，V.parahaemolyticus對三代(CTX)、四代(FEP)頭孢菌素也有耐藥或中介(<5%)。對磺胺類SXT的耐藥率為18.1%。此外，分別有1株V.parahaemolyticus對IPM(V.parahaemolyticus321)和C(V.parahaemolyticus188)耐藥，3株對K中介的V.parahaemolyticus分別分離自南美白對蝦、南美白對蝦養(yǎng)殖底泥和草魚。72株V.parahaemolyticus對包括碳青霉烯類、四環(huán)素類、氯霉素類、喹諾酮類、氨基糖苷類和硝基呋喃類的6類抗生素高度敏感(>90%)，所有菌株對MEM、FOX、TE、DOX、CIP、OFL、AZ、CN和NIT敏感。

圖1 副溶血性弧菌抗生素敏感性實驗結(jié)果

2.5.2 耐藥譜分析

為研究水產(chǎn)養(yǎng)殖中V.parahaemolyticus耐藥模式分布及多樣性，對菌株耐藥譜進(jìn)行統(tǒng)計分析。如表6所示，所有菌株至少耐2類抗生素，耐3類、4類、5類抗生素的菌株分別有22.2%(16/72)、72.2%(52/72)、1.4%(1/72)。72株V.parahaemolyticus表現(xiàn)為10種耐藥譜，主要耐藥譜型為AMP-SMZ-CZ-E，菌株占比54.2%。菌株MAR指數(shù)介于0.11～0.37，其中73.6%的菌株MAR指數(shù)高于0.2。

表6 副溶血性弧菌抗生素耐藥譜

2.5.3 不同養(yǎng)殖類型水產(chǎn)品中抗生素耐藥水平比較

為對比不同水產(chǎn)品中V.parahaemolyticus是否存在耐藥水平差異，分析了3類水產(chǎn)樣本中V.parahaemolyticus抗生素耐藥水平。如表7所示，不同類型水產(chǎn)樣本中V.parahaemolyticus均對AMP、CZ、SMZ和E高耐藥(69%～100%)。南美白對蝦養(yǎng)殖中V.parahaemolyticus耐抗生素種類最多，耐6類8種抗生素，其中包括耐IPM(n=1)、FEP(n=3)和C(n=1)菌株。淡水魚養(yǎng)殖和河蟹養(yǎng)殖均耐5種抗生素，其中河蟹養(yǎng)殖中V.parahaemolyticus對SXT耐藥率(37.5%)高于南美白對蝦養(yǎng)殖和淡水魚養(yǎng)殖，但與南美白對蝦和淡水魚養(yǎng)殖無統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=2.305，P>0.05)。

表7 三類養(yǎng)殖水產(chǎn)品中副溶血性弧菌耐藥水平比較

2.6 ERIC-PCR聚類分析結(jié)果

根據(jù)不同菌株所含腸桿菌基因間重復(fù)序列的分布和拷貝數(shù)不同，ERIC-PCR得到具有不同位置和數(shù)量的指紋圖譜，聚類分析結(jié)果如圖2所示。72株V.parahaemolyticus擴(kuò)增條帶為2～8條，條帶大小分布在100～5 000 bp，聚類為52個ERIC基因型(E01～E52)，帶型相似度為7%～100%，帶型分散，無明顯優(yōu)勢群組，基因型多樣性高。不同水產(chǎn)品養(yǎng)殖類型、采樣季節(jié)、采樣地區(qū)與V.parahaemolyticus基因型之間均存在顯著差異性(P<0.05)。

圖2 副溶血性弧菌ERIC-PCR聚類指紋圖譜

3 討論

本研究分析了上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖中V.parahaemolyticus污染情況，總檢出率為30.8%，高于大部分淡水養(yǎng)殖[8,14-15]，低于咸/海水養(yǎng)殖[4,6,16]。其中，高養(yǎng)殖鹽度的南美白對蝦中V.parahaemolyticus檢出率高于淡水魚和河蟹，夏、秋季節(jié)檢出率高于春、冬，表明V.parahaemolyticus的豐度和分布受鹽度、水溫等環(huán)境因素影響，與文獻(xiàn)[4,17-18]報道一致。不同水產(chǎn)品V.parahaemolyticus檢出率高于對應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境樣本，表明水產(chǎn)品更易富集V.parahaemolyticus[18-19]。JIANG等[6]對浙江養(yǎng)殖場和市場水產(chǎn)品中V.parahaemolyticus污染情況分析發(fā)現(xiàn)，不同水產(chǎn)品或人為交叉污染會進(jìn)一步增加V.parahaemolyticus污染，增加人類感染風(fēng)險。因此，應(yīng)繼續(xù)監(jiān)測水產(chǎn)品中V.parahaemolyticus污染情況，尤其是夏季、以南美白對蝦為代表的水產(chǎn)品，以預(yù)防V.parahaemolyticus感染。

自1996年O3∶K6血清型V.parahaemolyticus引起大流行被報道以來，近年來中國臨床分離V.parahaemolyticus菌株仍以O(shè)3∶K6血清型為主，而環(huán)境源V.parahaemolyticus血清型分布具有多樣性[20-23]。與本研究結(jié)果類似，72株V.parahaemolyticus血清型分布為10種，以O(shè)1血清型為主。值得注意的是，O1群V.parahaemolyticus中O1∶K20血清型曾在1982年引起大流行[24]，盡管近年來該血清型不在臨床致病V.parahaemolyticus菌株中流行，但也應(yīng)對其加以警惕，尤其是V.parahaemolyticus感染發(fā)生集中的夏季。

抗生素耐藥性的出現(xiàn)可能與水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)以及人類和農(nóng)業(yè)中抗生素濫用有關(guān)[4]。因此，了解水產(chǎn)養(yǎng)殖中V.parahaemolyticus耐藥性對養(yǎng)殖業(yè)和臨床治療V.parahaemolyticus感染具有重要意義。本研究中，V.parahaemolyticus對AMP、CZ、SMZ和E表現(xiàn)為高耐藥率，與魏文娟[25]、JIANG等[5]研究結(jié)果一致。AMP、CZ、SMZ和E在臨床和養(yǎng)殖業(yè)的長期使用可能是導(dǎo)致V.parahaemolyticus對其產(chǎn)生普遍耐藥的原因[26]。本研究中V.parahaemolyticus對SXT耐藥率(18.1%)高于XIE等[27]和SILVA等[18]報道的臨床源和環(huán)境源V.parahaemolyticus對SXT的耐藥率。頭孢菌素是廣泛用于臨床中的一類抗生素，其中第三、四代頭孢菌素可有效治療V.parahaemolyticus引起的嚴(yán)重感染[21]，本研究中V.parahaemolyticus對三代頭孢CTX和四代頭孢FEP有低耐藥率(<5%)。水產(chǎn)養(yǎng)殖中出現(xiàn)對SXT和第三、四代頭孢菌素等抗生素耐藥的菌株，表明臨床抗生素和耐藥菌正在環(huán)境中逐漸積累，已對養(yǎng)殖環(huán)境造成污染，并存在成為耐藥基因貯存庫的風(fēng)險。

ERIC-PCR由于其便捷、快速等優(yōu)點，相比脈沖場凝膠電泳更適用于大量菌株分型研究。ERIC-PCR結(jié)果表明養(yǎng)殖水產(chǎn)品中分離的V.parahaemolyticus具有高度遺傳多樣性，幾乎所有菌株都聚類在不同的分支中，與SU等[28]和XIE等[29]研究結(jié)果一致，表明不同來源分離株在基因型上具有較大的差異性。此外，XIE等[27]對臨床和水產(chǎn)分離的V.parahaemolyticus聚類結(jié)果表明，不論臨床還是環(huán)境分離株，V.parahaemolyticus均表現(xiàn)為遺傳多樣性。

綜上，上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖中V.parahaemolyticus污染嚴(yán)重，菌株檢出率受季節(jié)溫度和鹽度影響，致病潛力較低，并有較高的遺傳多樣性。水產(chǎn)養(yǎng)殖中V.parahaemolyticus主要對臨床和水產(chǎn)養(yǎng)殖常用抗生素AMP、CZ、SMZ和E耐藥，應(yīng)加強(qiáng)對磺胺類SXT和頭孢菌素類等抗生素的使用監(jiān)測，以預(yù)防菌株廣泛耐藥性的產(chǎn)生。