吳瑕，劉志軍，查健，龔國利

(陜西科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 西安，710021)

蛋清溶菌酶(egg white lysozyme, EWLys)來源于雞蛋清，屬C型溶菌酶，由129個(gè)氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量為14.4 kDa[1-2]。蛋清溶菌酶作為一種細(xì)菌細(xì)胞壁水解酶，通過降解肽聚糖層N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之間的β-1,4糖苷鍵，使菌體發(fā)生溶脹、死亡，實(shí)現(xiàn)高效殺菌[3-4]。該酶因其廣譜抑菌性能[5]而具有較高商業(yè)價(jià)值[6]，在食品防腐和醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛用途[7-8]。近年來，隨著無抗養(yǎng)殖的發(fā)展，蛋清溶菌酶被視為一種低成本飼料添加劑，用于預(yù)防及治療動(dòng)物細(xì)菌感染，在畜牧養(yǎng)殖領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景[9-10]。

目前，蛋清溶菌酶的工業(yè)化生產(chǎn)主要通過化學(xué)法從雞蛋中提取，其回收率較低，生產(chǎn)成本較高[11]。利用微生物生產(chǎn)蛋清溶菌酶并配合高密度發(fā)酵，有望實(shí)現(xiàn)其低成本、高收率工業(yè)化生產(chǎn)[9]。目前，重組蛋清溶菌酶在大腸桿菌、乳酸乳球菌、釀酒酵母中得到表達(dá)，但是其分別面臨菌體裂解、酶活力喪失、分泌效率低的問題[12-14]。巴斯德畢赤酵母作為一種廣泛應(yīng)用的異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)[15-16]，具有遺傳背景清晰、分子操作簡(jiǎn)單、培養(yǎng)方便等優(yōu)點(diǎn)，可對(duì)目的蛋白進(jìn)行分泌表達(dá)及糖基化修飾[17-18]，已成功用于高效表達(dá)多種來源的蛋白質(zhì)[19-21]。蛋清溶菌酶在這一微生物中的重組分泌表達(dá)已有報(bào)道，活性收率達(dá)到667～976 U/mL[11,22]。然而，這些研究并未比較重組蛋清溶菌酶與天然蛋清溶菌酶之間的生化性質(zhì)異同?，F(xiàn)有研究表明，重組酶與天然酶的生化特性常存在不同程度的差異，且該差異隨表達(dá)系統(tǒng)及表達(dá)條件的改變而發(fā)生變化[23-25]。

為此，本研究根據(jù)畢赤酵母GS115的密碼子偏好性，合成了蛋清溶菌酶基因并將其整合至畢赤酵母基因組，構(gòu)建了分泌型重組菌株，實(shí)現(xiàn)了蛋清溶菌酶在畢赤酵母GS115中的異源表達(dá)。通過對(duì)該重組酶粗酶液的主要生化特性進(jìn)行分析及初步表征，證實(shí)其與天然蛋清溶菌酶性質(zhì)相近。這一研究為蛋清溶菌酶的工業(yè)化微生物生產(chǎn)及應(yīng)用提供了理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

藤黃微球菌Micrococcusluteus10209，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心；巴斯德畢赤酵母GS115由本實(shí)驗(yàn)室保存；pPIC9K載體由本實(shí)驗(yàn)室保存；蛋清溶菌酶基因序列的密碼子優(yōu)化及合成由南京金斯瑞生物技術(shù)股份有限公司完成；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

YPD培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，高壓滅菌后加40%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))葡萄糖使其終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。MD培養(yǎng)基：3.4 g/L YNB(無氨基酵母氮源)，10 g/L (NH4)2SO4，0.4 g/L DO Supplement(缺陷型氨基酸混合物)，pH調(diào)至6.0，滅菌后40%葡萄糖使其終質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%。BMGY培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L，酵母提取物10 g/L，10 mL甘油溶解并定容至800 mL水中，高壓滅菌后加入100 mL 1 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)，100 mL 10×YNB，2 mL 500×Biotin，混勻備用。BMMY培養(yǎng)基：蛋白胨20 g，酵母提取物10 g，溶解并定容于800 mL水中，滅菌20 min。冷卻至室溫，加入100 mL 1 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)，100 mL 10×YNB，2 mL 500×Biotin，5 mL甲醇。固體培養(yǎng)基在對(duì)應(yīng)液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加20 g/L瓊脂粉。

1.1.3 儀器與設(shè)備

SX-500滅菌鍋，TOMY；Infinite M NANO酶標(biāo)儀，TECAN；A200 PCR儀，杭州朗基科學(xué)儀器有限公司；PHS-25精密pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；SW-CJ 生物潔凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；DW-YL270醫(yī)用低溫箱，中科美菱低溫科技股份有限公司；HNY-2102C恒溫培養(yǎng)箱，天津歐諾儀器股份有限公司；SCIENTZ-2C基因?qū)雰x，寧波新芝生物科技股份有限公司；B-500 超微量紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；MDF-382超低溫冰箱，松下冷鏈大連有限公司；JY600C電泳儀，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；GL124-1SCN 精密電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株構(gòu)建及篩選

根據(jù)NCBI網(wǎng)站上發(fā)表的蛋清溶菌酶基因序列，根據(jù)畢赤酵母密碼子偏好性人工合成蛋清溶菌酶目的基因，以pPIC9K載體為模板，通過Snab I和NotI酶切位點(diǎn)，構(gòu)建重組表達(dá)載體pPIC9K-EWLys。

挑取經(jīng)YPD平板劃線活化的畢赤酵母GS115單菌落，接種于10 mL YPD液體培養(yǎng)基中，于30 ℃過夜培養(yǎng)，轉(zhuǎn)接至50 mL YPD液體培養(yǎng)基，于30 ℃培養(yǎng)至OD600值為0.8～1.2。離心收集菌體(4 ℃，5 000 r/min，5 min)，以20 mL無菌水及10 mL 1 mol/L山梨醇溶液分別洗滌1次，重懸于3 mL 1 mol/L山梨醇溶液，分裝至無菌1.5 mL離心管中，完成感受態(tài)細(xì)胞的制備。使用SalI酶將表達(dá)載體pPIC9K-EWLys線性化，取2 μL酶切產(chǎn)物加入100 μL感受態(tài)細(xì)胞中，冰上靜置5 min后轉(zhuǎn)入預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中。設(shè)定電轉(zhuǎn)參數(shù)為電壓1.5 kV，電阻400 Ω，電容為25 μF。電擊完成后立即加入1 mL YPD吸打混勻轉(zhuǎn)至1.5 mL離心管中，于30 ℃、200 r/min條件下孵育2 h。離心(8 000 r/min, 2 min)收集菌體，以1 mL 1 mol/L山梨醇洗滌1次，重懸于200 μL山梨醇溶液(1 mol/L)，并涂布于MD(Without His)平板，于30 ℃培養(yǎng)48 h。隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化子，使用引物5′-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3′(α-Factor)及5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′(AOX1)進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證陽性轉(zhuǎn)化子，之后使用G418抗生素梯度篩選高拷貝轉(zhuǎn)化子。

1.2.2 高產(chǎn)工程菌株的試管發(fā)酵篩選

挑取陽性轉(zhuǎn)化子單菌落接種于2 mL BMGY培養(yǎng)基中，于30 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h(OD600=6～8)，離心收集菌體(12 000 r/min, 5 min)，重懸于2 mL BMMY培養(yǎng)基，于30 ℃、200 r/min培養(yǎng)，每隔24 h補(bǔ)加甲醇溶液使其終體積分?jǐn)?shù)為0.5%進(jìn)行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)72 h后，將菌液轉(zhuǎn)移至50 mL離心管中，4 000 r/min離心10 min，收集上清液存于4 ℃?zhèn)溆?。?duì)照組為未經(jīng)G418抗性篩選的工程菌株。

1.2.3 蛋清溶菌酶粗酶液的活性測(cè)定

測(cè)定方法參照GB 1886.257—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 溶菌酶》，挑取藤黃微球菌Micrococcusluteus10209甘油菌過夜培養(yǎng)(30 ℃，200 r/min)，轉(zhuǎn)接培養(yǎng)至OD450值為0.6～0.8，取1 mL菌液離心(12 000 r/min, 1 min)后棄上清液，用50 mmol/L Tris-HCl潤洗2次，之后用200 μL Tris-HCl重懸。以重懸后的藤黃微球菌為底物，在50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.0)體系中測(cè)定重組蛋清溶菌酶粗酶(發(fā)酵上清液)的活性。在96孔板中設(shè)置反應(yīng)體系為120 μL Tris-HCl緩沖液+15 μL菌懸液+15 μL發(fā)酵上清液，對(duì)照組為未經(jīng)G418抗性篩選的工程菌株，利用酶標(biāo)儀監(jiān)測(cè)OD450值的變化，酶活力的計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中：酶活力，U/mL；A2、A4為第2 min和第4 min測(cè)得的OD450值；2為時(shí)間間隔2 min；0.001為使用藤黃微球菌懸濁液在450 nm 處每分鐘引起吸光度變化為0.001；0.015代表所用酶的體積為0.015 mL。

1.2.4 溫度對(duì)重組蛋清溶菌酶粗酶液活性的影響

將重組酶在不同溫度(60、70、80、90 ℃)加熱處理不同時(shí)間后，測(cè)定殘余酶活力(方法同1.2.3，以不加熱時(shí)的酶活力為100%)，并計(jì)算熱失活過程的動(dòng)力學(xué)及熱力學(xué)參數(shù)。熱力學(xué)參數(shù)的計(jì)算如公式(2)～公式(5)所示：

(2)

ΔH=Ea-R

(3)

(4)

(5)

式中：Ea為活化能，J/mol；R為摩爾氣體常數(shù)，J/(mol·K)；slope為Arrhenius圖譜中曲線的斜率；ΔH、ΔG、ΔS分別為熱失活過程中的活化焓、活化熵、活化吉布斯自由能，J/mol；T為絕對(duì)溫度，K；h為普朗克常數(shù)；ki為不同溫度下熱失活速率常數(shù)，s-1；kB為玻爾茲曼常數(shù)。

1.2.5 pH對(duì)重組蛋清溶菌酶粗酶液活性的影響

同1.2.3蛋清溶菌酶活性測(cè)試方法，將酶活力測(cè)定反應(yīng)體系中緩沖液替換為50 mmol/L的非離子型緩沖液，即pH 5.0的檸檬酸緩沖液、pH 6.0的MES緩沖液和pH 7.0～9.0的Tris-HCl緩沖液，以最高酶活力為100%，計(jì)算不同pH下重組蛋清溶菌酶的殘余酶活力。

1.2.6 二價(jià)金屬離子對(duì)重組蛋清溶菌酶粗酶液活性的影響

配制含有不同二價(jià)金屬離子(ZnCl2，CoCl2，NiCl2，MgCl2，CaCl2，CuCl2)的50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.0) 緩沖液，使金屬離子終濃度為分別為0.1、1、10 mmol/L。同1.2.3測(cè)試方法，以未添加金屬離子的體系作為對(duì)照(對(duì)應(yīng)酶活力設(shè)為100%)，計(jì)算不同金屬離子存在條件下重組蛋清溶菌酶的活性。

1.2.7 鹽濃度對(duì)重組蛋清溶菌酶粗酶液活性的影響

配制含有25、50、75、100、150 mmol/L NaCl的50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.0)緩沖液，同1.2.3測(cè)試方法，以未添加NaCl的體系作為對(duì)照，以最高酶活力為100%，測(cè)試不同鹽濃度對(duì)重組蛋清溶菌酶活性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 GS115-pPIC9K-EWLys重組菌株的構(gòu)建及篩選

將蛋清溶菌酶的編碼基因按照畢赤酵母的密碼子偏好性進(jìn)行密碼子優(yōu)化，通過Snab I和NotI酶切位點(diǎn)克隆至pPIC9K表達(dá)載體。將重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至畢赤酵母菌株GS115，在缺少組氨酸的MD平板上進(jìn)行篩選。重組質(zhì)粒pPIC9K-EWLys為整合型質(zhì)粒，目的基因與載體上攜帶的G418抗生素抗性基因共同整合至畢赤酵母基因組(圖1)。為提高目的基因的拷貝數(shù)，研究中逐漸提高G418抗生素的濃度，對(duì)重組菌株進(jìn)行馴化，最終在16 mg/mL G418的質(zhì)量濃度下獲得高拷貝轉(zhuǎn)化子。隨機(jī)挑取一個(gè)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行重組蛋清溶菌酶的誘導(dǎo)表達(dá)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)24 h后出現(xiàn)目標(biāo)條帶，表明重組菌株構(gòu)建成功(圖2)。重組蛋清溶菌酶的表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，在誘導(dǎo)72 h時(shí)達(dá)到最大。

圖1 蛋清溶菌酶編碼基因的基因組整合示意圖

圖2 重組畢赤酵母分泌表達(dá)蛋清溶菌酶的SDS-PAGE分析

為獲得產(chǎn)量較高的重組菌株，隨機(jī)挑取100個(gè)高拷貝轉(zhuǎn)化子進(jìn)行試管發(fā)酵，誘導(dǎo)72 h后取發(fā)酵液上清測(cè)試重組蛋清溶菌酶的活性，如圖3所示。20號(hào)轉(zhuǎn)化子發(fā)酵產(chǎn)生的重組蛋清溶菌酶活性收率最高，達(dá)到665 U/mL，比未經(jīng)G418篩選的工程菌株提高3.02倍。選取該菌株進(jìn)行后續(xù)測(cè)試。

圖3 高產(chǎn)蛋清溶菌酶的畢赤酵母轉(zhuǎn)化子篩選

2.2 重組蛋清溶菌酶粗酶液的生化特性測(cè)試

2.2.1 溫度對(duì)重組蛋清溶菌酶粗酶液活性的影響

天然蛋清溶菌酶具有較好的熱穩(wěn)定性，在30～60 ℃加熱30 min后能保持較高的穩(wěn)定性，在70 ℃加熱30 min仍可保留78%的酶活力，在80 ℃加熱30 min后，保留52%的酶活力[26]。為了解重組蛋清溶菌酶是否具有相近的性質(zhì)，本研究將重組酶的粗酶液在不同溫度下加熱30 min，測(cè)定殘余酶活力。如圖4所示，重組蛋清溶菌酶在60 ℃以下加熱后酶活力略有升高，在70、80、90 ℃加熱30 min后可分別保留78%、68%、50%的活性，表明其熱穩(wěn)定性略優(yōu)于天然蛋清溶菌酶。

圖4 溫度對(duì)重組蛋清溶菌酶粗酶液活性的影響

為進(jìn)一步系統(tǒng)解析重組蛋清溶菌酶的熱失活動(dòng)力學(xué)特性，本研究在不同溫度對(duì)粗酶液加熱處理不同時(shí)間，測(cè)定殘余酶活力。如圖5所示，將重組蛋清溶菌酶在60 ℃加熱4 h后，其活性沒有明顯變化，而在70、80、90 ℃分別加熱240、160、100 min后，活性完全喪失。以這3個(gè)溫度下殘留酶活力的對(duì)數(shù)對(duì)加熱時(shí)間作圖，發(fā)現(xiàn)二者呈線性關(guān)系，如圖6所示，表明重組蛋清溶菌酶在相應(yīng)溫度下的熱失活遵循一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型。以絕對(duì)溫度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，以熱失活動(dòng)力學(xué)反應(yīng)常數(shù)的對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)，發(fā)現(xiàn)二者呈線性相關(guān)，如圖7所示。根據(jù)圖6斜率計(jì)算其活化能，利用1.2.4公式計(jì)算熱失活過程的熱力學(xué)參數(shù)，結(jié)果如表1所示。蛋清溶菌酶的熱失活活化能為62.85 kJ/mol，活化吉布斯自由能約為110 kJ/mol，表明其熱穩(wěn)定性較強(qiáng)，不易在熱加工過程中完全喪失活性[27]。此外，其熱失活活化熵約為-144 J/(mol·K), 負(fù)值較大，說明其在熱失活過程中可能出現(xiàn)結(jié)構(gòu)緊縮，導(dǎo)致活性中心折疊包埋。

a-60 ℃處理;b-70 ℃處理;c-80 ℃處理;d-90 ℃處理

圖6 重組蛋清溶菌酶粗酶液的熱失活動(dòng)力學(xué)

圖7 重組蛋清溶菌酶粗酶液熱失活的Arrhenius圖譜

表1 重組蛋清溶菌酶粗酶液熱失活動(dòng)力學(xué)參數(shù)

2.2.2 pH對(duì)重組蛋清溶菌酶粗酶液活性的影響

天然蛋清溶菌酶對(duì)鹽濃度較為敏感[26]。因此，在測(cè)定重組酶粗酶液活性隨pH值變化規(guī)律的過程中，為避免鹽濃度的影響，本研究選用一系列非離子型緩沖液。圖8表明重組蛋清溶菌酶在pH為6.0時(shí)活性最高；當(dāng)pH為7～9時(shí)酶活力隨pH的上升而降低。天然溶菌酶在pH 5～8可保持85%以上的相對(duì)酶活力，且最適pH為6.0[26]。重組酶在pH 5～8可保持60%以上的相對(duì)酶活力，與天然酶相比，其pH穩(wěn)定性有所下降。

圖8 pH對(duì)重組蛋清溶菌酶粗酶液活性的影響

2.2.3 鹽濃度對(duì)重組蛋清溶菌酶粗酶液活性的影響

天然蛋清溶菌酶對(duì)鹽濃度較為敏感，通常150 mmol/L NaCl即可完全抑制酶活力[28]。為探究重組蛋清溶菌酶對(duì)鹽濃度的敏感性，本研究測(cè)試了NaCl濃度對(duì)重組粗酶液活性的影響，并進(jìn)一步考察了這一影響是否具有pH依賴性。如圖9所示，在pH為6～9的非離子型緩沖液中，重組蛋清溶菌酶的活性隨NaCl濃度升高而降低，該性質(zhì)與天然蛋清溶菌酶一致。此外，在pH為6和7時(shí)，150 mmol/L NaCl可抑制約80%的重組酶活性，而在pH為8和9時(shí)，75 mmol/L NaCl即可完全抑制重組酶的活性。這一結(jié)果表明，隨著pH的升高，重組蛋清溶菌酶對(duì)NaCl濃度更為敏感。

圖9 鹽濃度對(duì)重組蛋清溶菌酶粗酶液活性的影響

2.2.4 金屬離子對(duì)重組蛋清溶菌酶粗酶液活性的影響

對(duì)于天然蛋清溶菌酶，Ca2+(10 mmol/L)對(duì)酶活力有較強(qiáng)激活作用，Zn2+(10 mmol/L)有明顯抑制作用，Mg2+(10 mmol/L)對(duì)酶活力沒有明顯影響[28]。對(duì)于重組蛋清溶菌酶，Zn2+、Ca2+、Ni2+、Mg2+、Co2+、Cu2+在0.1～10 mmol/L對(duì)酶活力均呈現(xiàn)不同程度的抑制作用，且該作用與金屬離子濃度呈正相關(guān)，如圖10所示。在10 mmol/L濃度下，Zn2+使重組酶的活性下降了約35%，與文獻(xiàn)報(bào)道一致；然而，Ca2+和Mg2+使重組酶的活性分別下降了30%與50%，與文獻(xiàn)報(bào)道明顯不同。這一偏差可能由多方面原因?qū)е?。首先，本研究使用粗酶液進(jìn)行測(cè)試，金屬離子可能與發(fā)酵液中的某些代謝物結(jié)合，影響重組蛋清溶菌酶的穩(wěn)定性；其次，重組蛋清溶菌酶與天然酶在結(jié)構(gòu)上存在某些差別，使得重組酶更易與金屬離子結(jié)合，引起活性下降；第三，本研究所用酶濃度較低，在底物過量的情況下，酶活力的變化對(duì)反應(yīng)速率及反應(yīng)進(jìn)行程度的影響較為明顯。

圖10 二價(jià)金屬離子對(duì)重組蛋清溶菌酶粗酶液活性的影響

3 結(jié)論與討論

本研究通過構(gòu)建重組載體pPIC9K-EWLys，實(shí)現(xiàn)蛋清溶菌酶在畢赤酵母中的異源表達(dá)，并篩選出高產(chǎn)工程菌株。生化特性分析表明，重組蛋清溶菌酶粗酶液在90 ℃加熱30 min仍能保持50%活性，熱穩(wěn)定性較強(qiáng)，最適pH為6.0，在pH 5～9能夠保持60%以上的活性，且對(duì)鹽濃度和金屬離子敏感。這一結(jié)果表明，該重組蛋清溶菌酶可用于熱加工處理。此外，用作飼料或食品添加劑時(shí)，需注意鹽濃度和金屬離子的濃度，以保證較大抗菌活性。本研究為蛋清溶菌酶在畢赤酵母中的后續(xù)研究提供了理論指導(dǎo)。