尹樂斌，劉椏麗，何平，李樂樂，羅雪韻，楊學(xué)為，鄒文廣，賀超，孫孟京

1(邵陽(yáng)學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 邵陽(yáng)，422000)2(豆制品加工與安全控制湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 邵陽(yáng)，422000)3(貴州亮歡寨生物科技有限公司，貴州 凱里，556000)

大豆蛋白是一種具有較高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的植物性蛋白，大豆多肽是大豆蛋白的水解產(chǎn)物，其氨基酸組成和大豆蛋白一致。但大豆多肽分子質(zhì)量比大豆蛋白更小，從而更容易被吸收。大豆多肽還具有降血壓、降血脂、抗氧化及抗腫瘤等多種活性功能[1-2]，關(guān)于大豆多肽的生理活性功能探究也是目前的研究熱點(diǎn)。FANG等[3]比較了不同酶解方法制備多肽對(duì)蛋白質(zhì)提取率、抗氧化及免疫活性的影響，LI等[4]概述了大豆多肽在降高血壓中的作用。

固體飲料是指以食品或植物提取物為原料，添加適當(dāng)?shù)妮o料或食品添加劑制成的粉末狀、顆粒狀的固態(tài)制品，具有風(fēng)味獨(dú)特、貯存期長(zhǎng)、易攜帶等特點(diǎn)[5-6]。多肽固體飲料既保留了固體飲料原有特點(diǎn)，同時(shí)還具備了大豆多肽的活性功能，能夠一定程度地提高免疫力，提供營(yíng)養(yǎng)和能量的同時(shí)能夠增加飽腹感，減少多余熱量的攝入等。但由于多肽具有一定的苦味，在一定程度上也限制了多肽類產(chǎn)品的發(fā)展[7-8]。目前與大豆多肽相關(guān)的研究大多集中在其制備工藝、分離純化及生理活性的探究上，尹樂斌等[9]探究了酶解豆清液制備大豆多肽的工藝條件，最后還進(jìn)行了抗氧化活性的研究；肖聰麗等[10]對(duì)大豆多肽進(jìn)行分離純化，最后鑒定并篩選出5個(gè)多肽。目前有關(guān)大豆多肽固體飲料的研究還鮮有報(bào)道。

本文以大豆分離蛋白為原料，采用包埋掩蓋脫苦方式以酶解后大豆多肽為芯材，β-環(huán)糊精為壁材進(jìn)行包埋從而降低大豆多肽的苦味制備一款低苦味多肽固體飲料，并進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征及體外模擬消化探究，以期為大豆多肽的產(chǎn)品開發(fā)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白，浙江一諾生物科技有限公司；β-環(huán)糊精，廣州嘉業(yè)食品配料有限公司；堿性蛋白酶，河南仰韶生物酶制劑有限公司；ABTS，合肥巴斯夫生物科技有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TDZ5臺(tái)式低速離心機(jī)，Dynamica Scientific Ltd.；ZNCL-BC磁力攪拌器，上海越眾儀器有限公司；D-7型紫外可見分光光度計(jì)，上海舜宇恒平儀器有限公司；DX-2700BH X射線衍射掃描儀，丹東通達(dá)科技公司；DSC3熱量掃描差示儀，梅特勒-托利多公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

低苦味多肽固體飲料工藝流程如下：

堿性蛋白酶 β-環(huán)糊精

↓ ↓

大豆分離蛋白→酶解→離心→純化→低苦味多肽固體飲料的制備

1.3.2 低苦味多肽固體飲料的制備

將大豆分離蛋白3%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))分散于水中，先在(80±2) ℃條件下處理15 min，冷卻至預(yù)定溫度后恒溫水浴，調(diào)節(jié)pH至8.0，加入堿性蛋白酶[V(酶)∶V(底物)=1∶100]于50 ℃水浴中酶解。酶解4 h后，調(diào)節(jié)pH至7.0，立即沸水滅酶10 min，待溶液冷卻后離心(8 000 r/min，15 min)，取上清液過5 kDa超濾膜純化后備用[11]。

取一定量的大豆多肽溶液，添加一定量的β-環(huán)糊精，在一定溫度下恒溫磁力攪拌反應(yīng)一段時(shí)間后，于-20 ℃下預(yù)凍后取出并冷凍干燥20 h，粉碎后即得低苦味多肽固體飲料[12]。

1.3.3 多肽含量的測(cè)定

參考呂凱波等[13]的方法略作修改：取樣品溶液2 mL，按1∶1加入10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)溶液使其混合均勻，室溫下靜置10 min后在6 000 r/min 條件下離心10 min，取上清液加入雙縮脲試劑[V(樣液)∶V(雙縮脲試劑)=2∶3]混合均勻，37 ℃恒溫水浴30 min，測(cè)定吸光度(純水代替樣品做空白)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中多肽含量。

1.3.4 包埋率與苦味值的測(cè)定

配制質(zhì)量濃度為20 mg/mL的樣品溶液，充分溶解后于6 000 r/min 離心10 min測(cè)定其多肽含量,并計(jì)算包埋率，包埋率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

苦味評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參考孟雅瀟[14]方法稍作修改：取適量未包埋的大豆多肽凍干粉配制成質(zhì)量濃度為20 mg/mL的溶液，將其苦味定義為10分，取20 mL包埋處理后的多肽液10份依次加入0、10、20、30、40、50、60、70、80、90 mL的去離子水，攪拌均勻?qū)⑵淇辔吨捣謩e定義為10、9、8、7、6、5、4、3、2、1。選取20名經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)后的同學(xué)(10男10女)進(jìn)行評(píng)分，最終結(jié)果取均值。

1.3.5 單因素試驗(yàn)

分別以壁芯比(7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、11∶1,分別記為7、8、9、10、11)、包埋溫度(35、40、45、50、55 ℃)、包埋時(shí)間(30、40、50、60、70 min)為單因素，考查各因素在制備過程中對(duì)低苦味多肽固體飲料的包埋率與苦味值影響。

1.3.6 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素基礎(chǔ)上，以包埋率和苦味值為指標(biāo)采用響應(yīng)面分析法中Box-Menken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化低苦味多肽固體飲料制備工藝。

1.3.7 物理指標(biāo)的測(cè)定

1.3.7.1 水分的測(cè)定

1.檢驗(yàn)人員。食品檢驗(yàn)是人員手工操作與儀器緊密結(jié)合的工作過程，需要檢驗(yàn)工作人員熟練掌握儀器的使用并嚴(yán)格按照檢驗(yàn)流程進(jìn)行檢驗(yàn)活動(dòng)的開展，但在實(shí)際的檢驗(yàn)工作過程中，卻存在著人員專業(yè)素質(zhì)欠缺、技術(shù)能力不足和處理意外事件的反應(yīng)能力較差等問題。加之對(duì)人員工作的管理力度不夠大，使得檢驗(yàn)人員的工作過于隨意，忽視了對(duì)工作流程和各個(gè)環(huán)節(jié)的要求，影響了食品檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

采用水分測(cè)定儀測(cè)定多肽固體飲料的水分含量。

1.3.7.2 流動(dòng)性的測(cè)定

參考李鵬飛等[15]的方法進(jìn)行測(cè)定，流動(dòng)性使用Carr index(CI)來(lái)衡量,流動(dòng)性CI值的計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

1.3.8 結(jié)構(gòu)表征

傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜(Fourier-transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR)：參考岳陽(yáng)[16]的方法。X-射線衍射(diffraction of x-rays，XRD)分析、熱重-熱差同步分析：參考徐思鑫等[17]的方法。

1.3.9 體外模擬消化研究

胃消化過程：用HCl將消化液調(diào)節(jié)pH至2.0，隨后加入10 mL胃蛋白酶溶液(由HCl溶液配制，終質(zhì)量濃度2 mg/mL)，攪拌均勻，37 ℃下振蕩(100 r/min)2 h。從瓶中在0、1、2 h分別吸取10 mL消化液樣品，迅速低溫冷凍離心(4 ℃，5 000 r/min)，取上清液，置于-20 ℃保存?zhèn)溆?，分別作為胃消化階段0、1、2 h樣品，消化時(shí)間記為1、2、3。

腸消化過程：用NaOH將瓶中消化液調(diào)節(jié)pH至7.4，隨后加入胰酶和豬膽鹽混合液(終質(zhì)量濃度分別為1.2、2.4 mg/mL)，攪拌均勻，置于37 ℃下振蕩4 h(100 r/min)。分別在0、1、2、3、4 h吸取10 mL消化液樣品，迅速低溫冷凍離心，取上清液，置于-20 ℃保存?zhèn)溆茫謩e作為腸消化階段0、1、2、3、4樣品，消化時(shí)間記為4、5、6、7、8[18-19]。

1.3.10 抗氧化活性的測(cè)定

羥自由基清除率、ABTS陽(yáng)離子自由基清除率的測(cè)定參考尹樂斌等[20]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，運(yùn)用WPS Excel 2016和Design Expert 8.0.6 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，Origin 9.0進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

由圖1可知隨著β-環(huán)糊精的增加，包埋率也隨之上升而后呈緩慢下降趨勢(shì)，當(dāng)壁芯比為9∶1時(shí)，包埋率較好，達(dá)到52.06%?？赡苁且?yàn)棣?環(huán)糊精含量較低，大豆多肽含量較高，使得β-環(huán)糊精不足以有效包埋大豆多肽，隨著β-環(huán)糊精含量的增加，大豆多肽被包埋進(jìn)β-環(huán)糊精空腔中，但β-環(huán)糊精過多時(shí)，其內(nèi)部空腔未能充分利用，從而導(dǎo)致大豆多肽微膠囊包埋率緩慢下降。隨著β-環(huán)糊精的添加，苦味值逐漸減小，而超過一定量后，苦味值增加，產(chǎn)生了焦糊味[21]，因此選擇壁芯比為9∶1時(shí)進(jìn)行包埋最合適。

a-璧芯比；b-包埋溫度；c-包埋時(shí)間

隨著溫度的升高，樣品的包埋率逐漸升高，苦味值降低，當(dāng)溫度為45 ℃時(shí)，苦味值最低，隨著溫度再次升高，苦味值開始增大，可能是因?yàn)楦邷厥沟忙?環(huán)糊精的內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，分子運(yùn)動(dòng)更為劇烈，大豆多肽又從β-環(huán)糊精空腔中移出[22]。綜合考慮，選擇45 ℃為最適包埋溫度。

隨著包埋時(shí)間的延長(zhǎng)，包埋率逐漸增大，在包埋時(shí)間為50 min時(shí)包埋率趨于平緩。攪拌時(shí)間太短，大豆多肽與β-環(huán)糊精的接觸不充分，大豆多肽無(wú)法充分地進(jìn)入β-環(huán)糊精的空腔內(nèi)；一定時(shí)間后影響效果不明顯，可能是因?yàn)閿嚢钑r(shí)間太長(zhǎng)導(dǎo)致大豆多肽與β-環(huán)糊精之間的相互作用發(fā)生變化，造成包埋效果不良[23]。因此選擇時(shí)間為50 min進(jìn)行包埋。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案與優(yōu)化結(jié)果根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定壁芯比(A)、包埋溫度(B)、包埋時(shí)間(C)為響應(yīng)變量，運(yùn)用Design-Expert8.0.6軟件Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)，以包埋率(Y1)與苦味值(Y2)為響應(yīng)值，優(yōu)化低苦味多肽固體飲料制備工藝。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表1。

表1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行多元回歸擬合得到回歸方程：包埋率Y1=57.88-0.62A-0.40B+0.36C-0.083AB+0.41AC+0.21BC-1.85A2-1.57B2-1.35C2；苦味值Y2=2.78+0.15A-0.046B-0.023C-0.013AB+0.055AC-0.020BC+1.01A2+0.44B2+0.043C2。回歸方程進(jìn)行方差分析見表2、表3。

表2 包埋率回歸模型方差分析

表3 苦味值回歸模型方差分析

2.3 最佳制備工藝的確定

經(jīng)過Design-Expert 8.0.6軟件分析得到制備低苦味多肽固體飲料最佳條件為當(dāng)壁芯比為8.85∶1，包埋溫度為44.42 ℃，包埋時(shí)間為51.02 min時(shí)，包埋率預(yù)測(cè)值達(dá)57.97%；當(dāng)壁芯比為8.92∶1，包埋溫度為45.30 ℃，包埋時(shí)間為53.34 min時(shí)，苦味值預(yù)測(cè)為2.77分。結(jié)合實(shí)驗(yàn)具體情況調(diào)整參數(shù)為壁芯比9∶1，包埋溫度為45 ℃，包埋時(shí)間為50 min。經(jīng)3次平行實(shí)驗(yàn)測(cè)得包埋率為(58.04±0.32)%，苦味值為(2.72±0.27)分,與預(yù)測(cè)值無(wú)明顯差異。

2.4 物理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

對(duì)粉體的流動(dòng)性CI值進(jìn)行分級(jí)，<15表示流動(dòng)性非常好，15～20較好，20～35一般，35～45較差，>45非常差。

由表4可知，固體飲料的水分含量為4.37%，低于國(guó)標(biāo)要求6%，且其CI值為18.99%，流動(dòng)性較好，顆粒間的吸附不強(qiáng)。

表4 低苦味多肽固體飲料物理指標(biāo)測(cè)定結(jié)果

2.5 FT-IR紅外光譜分析

圖2 大豆多肽、β-環(huán)糊精及固體飲料紅外掃描光譜圖

2.6 XRD分析

由圖3可知β-環(huán)糊精在10°、12°、22°、27°均有較強(qiáng)的衍射峰，說明其具有較強(qiáng)的晶體結(jié)構(gòu)，是以晶體形態(tài)存在的化合物，大豆多肽呈現(xiàn)無(wú)定型狀態(tài)，只在25°附近存在1個(gè)較寬泛的衍射峰，可能是由于α-螺旋結(jié)構(gòu)引起。對(duì)比3種物質(zhì)的XRD譜圖可看出，固體飲料峰的強(qiáng)度發(fā)生了明顯變化，與β-環(huán)糊精相比，峰值減弱或消失，說明固體飲料具有晶體結(jié)構(gòu)，且結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化[26-27]，也從側(cè)面證明芯材與壁材包埋成功。

圖3 大豆多肽、β-環(huán)糊精及固體飲料的XRD譜圖

2.7 熱重-差熱分析

熱重-差熱同步分析 (thermogravimetric-differential thermal analysis，TG-DTA)可對(duì)樣品熱穩(wěn)定性、組成及熱反應(yīng)變化有效表征。將圖4與圖5進(jìn)行對(duì)比可知，當(dāng)溫度在100 ℃附近時(shí)，二者均有一定程度的失重，可能是由于樣品中水分的蒸發(fā)所導(dǎo)致，隨著溫度的上升也可看出，固體飲料的失重曲線較為平緩，說明固體飲料與大豆多肽相比，具有更好的熱穩(wěn)定性。隨著TG曲線的下降，DTA曲線峰值也發(fā)生變化，二者對(duì)比可發(fā)現(xiàn)固體飲料的DTA曲線變化更為顯著，115 ℃附近出現(xiàn)1個(gè)吸熱峰，可能是因?yàn)槲镔|(zhì)的脫水作用[28-29]，由此也說明固體飲料在沖調(diào)飲用過程中的熱穩(wěn)定性比大豆多肽更佳。

圖4 大豆多肽的TG-DTA曲線

圖5 固體飲料的TG-DTA曲線

2.8 體外模擬消化過程中抗氧化活性變化情況

由圖6可知，在腸消化階段的羥自由基清除率比胃消化階段要高，隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，羥自由基清除率逐漸升高，最終達(dá)到74.55%；由圖7可知在腸消化階段其ABTS陽(yáng)離子自由基清除率最高達(dá)到99.72%，接近100%，二者均說明β-環(huán)糊精能夠較好的包埋大豆多肽，隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)，固體飲料的抗氧化活性也隨之增強(qiáng)，可能是胃、胰蛋白酶處理使得多肽中的抗氧化氨基酸殘基更充分暴露，使得抗氧化活性增長(zhǎng)[30]，也有可能是因?yàn)樵谀c消化階段包埋后的大豆多肽得到了一定的釋放，大豆多肽本身具有較好的抗氧化活性，因此表現(xiàn)出腸消化階段的抗氧化活性高于胃消化階段，更有利于人體的吸收利用。

圖6 羥自由基清除率變化情況

圖7 ABTS陽(yáng)離子自由基清除率變化情況

3 結(jié)論

以酶解大豆分離蛋白所得大豆多肽為原料芯材，采用β-環(huán)糊精為壁材對(duì)其進(jìn)行包埋掩蓋脫苦制備低苦味多肽固體飲料，以包埋率與苦味值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在壁材與芯材比例、包埋溫度、包埋時(shí)間3個(gè)單因素的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面試驗(yàn)進(jìn)行工藝優(yōu)化。得到最適的包埋條件為壁芯比為8.85∶1，包埋溫度為44.42 ℃，包埋時(shí)間為51.02 min，此時(shí)包埋率預(yù)測(cè)值達(dá)57.97%；壁芯比8.92∶1，包埋溫度為45.30 ℃，包埋時(shí)間為53.34 min時(shí)，苦味值預(yù)測(cè)為2.77。結(jié)合實(shí)驗(yàn)具體情況調(diào)整參數(shù)為壁芯比9∶1，包埋溫度為 45 ℃，包埋時(shí)間為50 min。經(jīng)3次平行實(shí)驗(yàn)測(cè)得包埋率為(58.04±0.32)%，苦味值為(2.72±0.27)分與預(yù)測(cè)值無(wú)顯著差異。固體飲料結(jié)構(gòu)表征結(jié)果說明，固體飲料的制備過程為物理包埋過程，體外模擬消化系統(tǒng)對(duì)其固體飲料抗氧化活性的影響情況可知，通過包埋掩蓋脫苦制得的多肽固體飲料既使多肽本身苦味得到掩蓋降低，又仍保持其良好的抗氧化活性。因此，通過包埋掩蓋方式制得的低苦味多肽固體飲料，將產(chǎn)生一定的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。