張雨晴，周靚，施文衛(wèi)，朱辰暉，袁家偉，吳曉芹*

1(常熟理工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，江蘇 蘇州，215500)2(SGS通標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)(上海)有限公司，上海，200233)

桃(PrunuspersicaL.Batsch)屬于薔薇科，品種繁多，在我國多分布于江蘇、福建、浙江等省。由于桃果實(shí)汁多味美，營養(yǎng)價(jià)值高，深受廣大消費(fèi)者喜愛。但桃果實(shí)一般成熟于高溫多雨的夏季，采后呼吸作用旺盛，極不耐貯，一般采后2～3 d就可腐爛變質(zhì)[1]。近年來，國內(nèi)外已有對(duì)水蜜桃果實(shí)采后貯藏保鮮技術(shù)的大量研究，包括物理性(如低溫保鮮、熱處理保鮮、輻射保鮮和減壓保鮮)、化學(xué)性[如1-甲基環(huán)丙烯(1-methylcyclopropene, 1-MCP)、植物生長調(diào)節(jié)劑]及生物保鮮方法等(如微生物拮抗劑、天然提取物)[2]。但是以上方法或因潛在食品安全風(fēng)險(xiǎn)，或在實(shí)際應(yīng)用推廣方面成本較高、技術(shù)不完善等原因，都存在一定局限性。因此，探索可行、高效、低成本的采后處理方法，延長桃果實(shí)貯藏期，具有重要意義。

蘇州碧螺春茶是我國的傳統(tǒng)十大名茶之一，因其獨(dú)特的芳香及悠久的歷史享譽(yù)國內(nèi)外，湯色嫩綠，香氣淡雅，滋味鮮醇，被譽(yù)為“茶中仙子”，具有較高經(jīng)濟(jì)價(jià)值[3]。碧螺春茶一般于清明前開采，且開采期較短，只采其嫩芽制作，老葉因摻有茶碎末與雜質(zhì)，且影響口感往往被廢棄。而近幾年，茶樹老葉中豐富的多酚物質(zhì)受到廣泛關(guān)注[4-6]，其抗氧化、防輻射、抗炎抑菌等多種生物學(xué)功能顯著，且安全無毒，在食品工業(yè)、日用品、醫(yī)藥中有諸多應(yīng)用。

茶多酚穩(wěn)定性較差，容易氧化，采用復(fù)合保鮮技術(shù)可提高保鮮效果，延長果蔬貨架期，如茶多酚與溶菌酶的復(fù)合保鮮[7-8]。溶菌酶是一種天然蛋白質(zhì)，且安全無毒，能夠水解細(xì)菌中的多糖使細(xì)胞壁破裂，從而抑制細(xì)菌增長。然而，目前缺乏茶樹老葉茶多酚保鮮效果的研究，也未見茶樹老葉茶多酚與其他保鮮劑復(fù)合處理的報(bào)道。因此，本研究旨在探討碧螺春老葉多酚在果蔬保鮮中的效果，并研究茶多酚與溶菌酶的復(fù)合保鮮是否存在協(xié)同作用，通過本研究的開展，既能充分開發(fā)碧螺春經(jīng)濟(jì)及利用價(jià)值，又能開發(fā)一種安全無毒的食品保鮮方法，為桃果實(shí)保鮮技術(shù)的提升奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘白鳳’桃于常熟當(dāng)?shù)刭徺I；乙醇、沒食子酸、福林酚、Na2CO3、蘆丁標(biāo)品、NaNO2、AlCl3、NaOH、KCl、HCl、醋酸鈉、醋酸、FeSO4、水楊酸、愈創(chuàng)木酚、H2O2、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)、EDTA、Met、硝基四氮唑藍(lán)(nitroblue tetrazolium，NBT)、維生素B2等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Therm高速冷凍離心機(jī)，南京康維達(dá)生物科技有限公司；紫外分光光度計(jì)，上?？茣钥茖W(xué)儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海坤誠科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 碧螺春老葉多酚提取及施用濃度篩選

1.3.2 桃果實(shí)原材料及處理

‘白鳳’桃果實(shí)于7月份常熟當(dāng)?shù)夭少?，挑選約8成熟、大小均一、無病蟲害及明顯機(jī)械損傷的桃果實(shí)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，采摘當(dāng)天設(shè)置為D0。分別用1.25 mg/mL老葉多酚溶液(實(shí)驗(yàn)確定的最佳濃度)，1.25 mg/mL茶多酚+0.1%溶菌酶溶液室溫下浸泡10 min，蒸餾水浸泡作為對(duì)照， 晾干后貯藏于室溫下(25±1) ℃ 6 d，分別在第2、4、6天取樣(D2、D4、D6)，去皮、切成小塊并研磨，經(jīng)離心處理后用于各項(xiàng)指標(biāo)的測(cè)定。所有樣品均設(shè)3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 失重

3種不同處理的桃果實(shí)各選擇9個(gè)，分別于第0、2、4、6天測(cè)定果實(shí)質(zhì)量。失重(Δn)計(jì)算如公式(1)所示：

Δn/g=貯藏前果重-貯藏后果重

(1)

1.3.4 多酚的提取測(cè)定

稱取2 g新鮮桃果實(shí)樣品進(jìn)行研磨，加入10 mL體積分?jǐn)?shù)為80%乙醇溶液提取多酚，10 000×g離心10 min取上清備用。配制0.1 mg/mL的沒食子酸，分別取50、100、200、300、400、500 μL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，同時(shí)，取200 μL多酚提取液于試管中，每只試管加入2 mL體積分?jǐn)?shù)10%福林酚靜置5 min，然后加入2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%的Na2CO3，75 ℃水浴10 min后冷卻。于725 nm處測(cè)定吸光值，同體積的提取液作空白，每個(gè)樣品做3組平行。

1.3.5 黃酮的測(cè)定

配制0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，分別吸取100、200、400、600、800 μL于每支試管，用于標(biāo)曲測(cè)定。測(cè)定每組樣品時(shí)，吸取2 mL多酚提取液于新試管中，加入0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5% NaNO2溶液，搖勻后靜置6 min，再加入0.3 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% AlCl3溶液，搖勻并靜置6 min，然后加入4 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% NaOH溶液靜置15 min，每支試管定容至 10 mL。于510 nm處測(cè)定吸光值，同體積的提取液作為空白。

1.3.6 花青素的測(cè)定

2支試管各取1 mL多酚提取液，分別加入 3 mL KCl緩沖液(0.025 mol/L pH 1.0)與3 mL 醋酸鈉緩沖液(0.4 mol/L pH 4.5)，分別于520、700 nm處測(cè)定吸光值?；ㄇ嗨睾坑?jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中：Mw為花青素-3-葡萄糖苷的分子質(zhì)量(C15H11O6449.2 g/mol)；DF為稀釋倍數(shù)；ε為消光系數(shù)(26 900)；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.7 羥自由基清除率的測(cè)定

于每支試管中依次加入3 mL蒸餾水，100 μL FeSO4溶液(0.02 mol/L), 45 μL雙氧水(0.15%)生成羥自由基，然后加入0.5 mL多酚提取液并混勻，最后加入1 mL水楊酸(8 mmol/L)顯色。反應(yīng)30 min后于510 nm處測(cè)吸光值，用同體積提取液代替多酚作為對(duì)照，羥自由基清除率計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

1.3.8 DPPH自由基清除率的測(cè)定

取0.1 mL多酚提取液于試管中，加入2.5 mL 0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液搖勻，黑暗中孵育30 min，于517 nm處測(cè)吸光度。取同體積提取液代替多酚提取物作對(duì)照，DPPH自由基清除率計(jì)算如公式(4)所示：

(4)

1.3.9 過氧化物酶(peroxidase，POD)活性測(cè)定

稱取2 g新鮮桃果實(shí)樣品于冰上進(jìn)行研磨，加入6 ml PBS(50 mmol/L pH 7.8)提取酶，4 ℃下10 000×g離心10 min，取上清酶液并保存于4 ℃冰箱備用。

取0.4 mL酶液，加入2 mL醋酸緩沖液(50 mmol/L pH 5.4)和1 mL愈創(chuàng)木酚(0.25%,體積分?jǐn)?shù))，然后加入0.05 mL H2O2(3%,體積分?jǐn)?shù))啟動(dòng)反應(yīng)。立即置于紫外分光光度計(jì)中于460 nm處測(cè)定吸光值，每30 s記錄1次數(shù)值，反應(yīng)共5 min，每分鐘吸光度變化0.01為1個(gè)酶活單位。

1.3.10 超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性測(cè)定

取0.03 mL酶提取液，加入3 mL的反應(yīng)體系中(50 mmol/L pH 7.8 PBS、0.1 mmol/L EDTA、13 mmol/L Met、75 μmol/L NBT、2 μmol/L核黃素)。另取3個(gè)試管，加入20 μL的超純水代替酶提取液，作為對(duì)照組。將測(cè)定組與對(duì)照組放在4 000 lx強(qiáng)度的光照下反應(yīng)30 min，用等體積的超純水代替酶液作為空白組放在暗室中反應(yīng)作為空白組。反應(yīng)完成后在560 nm處測(cè)定吸光值。SOD活力計(jì)算如公式(5)所示：

(5)

式中：A0為對(duì)照組的吸光度；A為測(cè)定組的吸光度；V為樣品的總體積，mL；Vs為測(cè)定所用酶液體積，mL；t為反應(yīng)時(shí)間，h；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.11 過氧化氫酶(catalase，CAT)活性測(cè)定

取2.6 mL PBS(50 mmol/L pH 7.8)，加入0.4 mL酶液，搖勻，然后加入50 μL H2O2(3%)作啟動(dòng)反應(yīng)，于240 nm處測(cè)吸光值，每30 s記錄1次數(shù)值，觀察吸光值變化，反應(yīng)共5 min。每組樣品做3個(gè)平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 碧螺春老葉多酚施用濃度篩選

果蔬細(xì)胞中，線粒體是產(chǎn)生ATP的主要場(chǎng)所，通過有氧呼吸將氧氣轉(zhuǎn)化為水最終產(chǎn)生ATP，以維持機(jī)體基本的生命活動(dòng)。然而，在電子傳遞過程中，在線粒體復(fù)合物Ⅰ和復(fù)合物Ⅲ處會(huì)由于電子泄露導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生。羥自由基是ROS的一員，若在果蔬細(xì)胞內(nèi)累積過多，會(huì)對(duì)植物組織不斷侵襲，造成果蔬的衰老。而多酚具有羥自由基清除能力，高清除能力利于果蔬的后期貯存，延緩衰老。因此，本實(shí)驗(yàn)以碧螺春老葉多酚對(duì)羥自由基的清除能力為指標(biāo)，測(cè)定不同多酚濃度下羥自由基清除能力的變化，確定最佳的施用濃度。

如圖1所示，碧螺春老葉多酚顯示出較強(qiáng)的羥自由基清除能力，且隨著多酚濃度的升高，清除能力迅速提高，當(dāng)多酚質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL時(shí)，羥自由基清除率達(dá)到92.95%。此后多酚濃度再提高，羥自由基清除能力基本趨于平緩。因此，本實(shí)驗(yàn)確定用于桃果實(shí)保鮮的老葉多酚的最佳施用質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL。

圖1 老葉多酚最佳施用濃度的確定

2.2 桃果實(shí)的失重

果蔬皆為活的有機(jī)體，在采后貯藏階段，蒸騰作用、呼吸作用以及其他代謝活動(dòng)仍然會(huì)繼續(xù)進(jìn)行，這些生理活動(dòng)嚴(yán)重影響著果蔬表觀和質(zhì)量。其中，果蔬蒸騰作用的直接表現(xiàn)為質(zhì)量的下降、果實(shí)軟化等。本研究中，桃果實(shí)采后貯藏期間的圖片如圖2所示，在貯藏期內(nèi)，桃果實(shí)色澤進(jìn)一步轉(zhuǎn)紅。由于貯藏期只有6 d，且各組桃果實(shí)轉(zhuǎn)紅明顯，因此，僅從外觀不能很明顯的看出不同處理組之間的區(qū)別，因此要結(jié)合其他生理、生化指標(biāo)綜合討論采后處理對(duì)桃果實(shí)品質(zhì)的影響。桃果實(shí)在貯藏過程中的失重變化如圖3所示，對(duì)照組桃果實(shí)質(zhì)量下降最為迅速，茶多酚處理組次之，茶多酚和溶菌酶處理組質(zhì)量下降最慢。說明茶多酚可很好地維持桃果實(shí)在貯藏期間重量變化，減少水分的散失，茶多酚和溶菌酶結(jié)合處理對(duì)于維持桃果實(shí)的重量表現(xiàn)出協(xié)同作用，有效延緩桃果實(shí)的失重。

圖2 桃果實(shí)采后貯藏期間圖片

2.3 SOD活性的變化

桃屬于呼吸躍變型果實(shí)，在采后仍經(jīng)歷著新陳代謝活動(dòng)，呼吸作用會(huì)引起細(xì)胞壁降解、果實(shí)軟化、單糖含量增加、揮發(fā)性物質(zhì)的累積等，直接影響著果實(shí)的商品特性。果蔬采后隨著呼吸作用的進(jìn)行，線粒體在氧化磷酸化產(chǎn)生能量過程中，內(nèi)部的呼吸鏈會(huì)發(fā)生電子泄露，形成ROS。ROS會(huì)直接攻擊細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)，引起機(jī)體代謝的紊亂，影響細(xì)胞的代謝和細(xì)胞凋亡。植物細(xì)胞內(nèi)部還存在著抗氧化體系，包括抗氧化酶類和非抗氧化酶類，抵制ROS的侵害。其中，SOD、CAT和POD等是植物中常見的抗氧化酶。呼吸作用產(chǎn)生的超氧陰離子自由基在細(xì)胞內(nèi)部不穩(wěn)定，會(huì)在SOD的作用下轉(zhuǎn)化為H2O2，而H2O2會(huì)進(jìn)一步在CAT和POD等酶的作用下轉(zhuǎn)化為H2O，降低ROS對(duì)細(xì)胞的侵害。

本研究中，桃果實(shí)的SOD活性在貯藏過程中呈現(xiàn)總體持續(xù)上升的趨勢(shì)(如圖3所示)，說明在室溫貯存期間桃果實(shí)面臨較強(qiáng)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成果實(shí)內(nèi)部ROS累積。處理組的桃果實(shí)SOD活性明顯高于對(duì)照組，說明多酚提取液刺激了SOD酶活，提高了桃果實(shí)的抗氧化活性，及時(shí)清除處理組中桃果實(shí)產(chǎn)生的ROS，延緩了果實(shí)的成熟。而溶菌酶的添加對(duì)于果實(shí)SOD酶活的提高沒有顯著的作用。

2.4 CAT活性的變化

在桃果實(shí)貯藏期間，CAT酶活呈現(xiàn)持續(xù)降低的趨勢(shì),如圖3所示，而多酚提取液很好地維持了其較高的酶活，提高了果實(shí)的抗氧化能力。值得注意的是，不同于對(duì)SOD酶活的影響，溶菌酶與多酚的復(fù)合處理在提升CAT酶活方面顯著優(yōu)于對(duì)照組、茶多酚組，表現(xiàn)出較高的協(xié)同效果，有效清除桃果細(xì)胞內(nèi)部產(chǎn)生的H2O2，延緩果實(shí)的衰老。

2.5 POD活性的變化

如圖3所示，在貯藏期間，對(duì)照組的POD活性迅速升高，在第2天出現(xiàn)峰值，隨后在貯藏期間下降，所有組中的POD活性總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。其中，茶多酚和溶菌酶復(fù)合處理對(duì)桃果實(shí)POD活提升效果最佳，提高桃果實(shí)過氧化物酶的活性，可增強(qiáng)清除自由基的能力，延緩果實(shí)衰老。類似的研究結(jié)果在西藍(lán)花保鮮中也有報(bào)道， 李長亮等[11]采用1-MCP和溶菌酶結(jié)合處理研究新鮮西藍(lán)花保鮮，發(fā)現(xiàn)1-MCP+溶菌酶有效提高西藍(lán)花過氧化物酶的活性、感官品質(zhì)和總酚含量，延長了貯藏期。

a-失重；b-SOD酶活；c-CAT酶活；d-POD酶活

2.6 總酚、花青素和黃酮含量的變化

酚類物質(zhì)是由含有1個(gè)或多個(gè)羥基的苯環(huán)組成的高分子化合物，其廣泛存在于植物體內(nèi)，是植物體內(nèi)重要的次生代謝物。果蔬體內(nèi)的酚類物質(zhì)決定著果蔬的色澤、口感、營養(yǎng)和芳香等[12]，具有多種生物活性，可行使不同的功能，包括植物抗毒素[13]、吸引授粉、積累色素、抗氧化、防紫外線等[14]。類黃酮物質(zhì)因其極強(qiáng)的抗氧化潛力，可作為重要的抗氧化劑，還扮演著氫供體、金屬螯合和單線態(tài)氧猝滅劑等角色[15]。類黃酮物質(zhì)包括黃酮類、花色素、黃烷酮類等等，其含量的高低直接影響著果蔬的著色和抗氧化性能。

本實(shí)驗(yàn)中，桃果實(shí)貯藏期間多酚和黃酮含量總體呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)(圖4)，該結(jié)果與前人在李子[16]、桃子[17]研究中一致，黃酮物質(zhì)的變化與多酚趨勢(shì)類似，這種規(guī)律在之前的研究中也有報(bào)道[17-18]。2個(gè)處理組對(duì)多酚和黃酮含量均未表現(xiàn)出明顯的影響，與對(duì)照組含量區(qū)別不大。然而，處理組明顯提高了桃果實(shí)花青素的含量，且茶多酚處理組中花青素含量最高，利于桃果實(shí)后期果色的穩(wěn)定。

a-多酚含量；b-黃酮含量；c-花青素含量；d-DPPH自由基清除率；e-羥自由基清除率

2.7 DPPH自由基、羥自由基清除率的變化

酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)上含有苯環(huán)和取代羥基，可以為其他物質(zhì)提供氫原子或者電子，還原金屬離子。酚類物質(zhì)自身可以釋放出親和性強(qiáng)的氫質(zhì)子，可以將高活性的自由基失活或?qū)⑵滢D(zhuǎn)化為穩(wěn)定的化合物。測(cè)定多酚清除能力的方法有很多，大體可以分為2種：第一種是測(cè)定多酚物質(zhì)清除植物體內(nèi)羥自由基、超氧陰離子自由基、過氧化氫等自由基的能力，本研究中測(cè)定羥自由基清除能力的原理是利用FeSO4-H2O2的反應(yīng)，體系中產(chǎn)生的羥自由基與染色劑水楊酸反應(yīng)產(chǎn)生顏色，加入酚類粗提液會(huì)去除體系中的自由基，使得紫色會(huì)變淺。另一種方法是清除體外人工合成自由基的活性，應(yīng)用最多的是DPPH自由基。DPPH是一種穩(wěn)定的自由基，易溶于醇并且顯紫色，但是當(dāng)加入酚類提取液時(shí)，DPPH自由基會(huì)被酚類清除使紫色變淺，反應(yīng)靈敏，成為測(cè)定酚類清除活性的有效工具。

本實(shí)驗(yàn)中，在桃果實(shí)貯藏期間，DPPH自由基和羥自由基清除率均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，分別在第0天和第4天表現(xiàn)出峰值，2種自由基清除率的總體變化趨勢(shì)與總酚含量變化相似，因此推測(cè)清除率的變化與酚類物質(zhì)含量有關(guān)。此外，處理組的DPPH自由基和羥自由基清除率均明顯高于對(duì)照組，說明老葉多酚的處理明顯提高了桃果實(shí)自由基清除能力，維持細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)。值得注意的是，DPPH自由基清除能力跟桃果實(shí)的總酚含量變化趨勢(shì)一致，據(jù)此推測(cè)桃果實(shí)的DPPH自由基清除能力受總酚含量的影響。而羥自由基清除能力變化趨勢(shì)與總酚含量差別較大，碧螺春老葉多酚與溶菌酶的結(jié)合處理呈現(xiàn)出最強(qiáng)的羥自由基清除活性，但是該組中桃果實(shí)的總酚含量卻沒有表現(xiàn)出最高，由此推測(cè)羥自由基清除能力可能與某幾種單酚物質(zhì)有關(guān)，與總酚含量的關(guān)聯(lián)不像DPPH自由基清除率那樣密切，類似的結(jié)果在之前的研究中也曾得出[17]。

3 結(jié)論

本研究測(cè)定了碧螺春老葉茶多酚對(duì)桃果實(shí)采后貯藏期間成熟衰老的影響，實(shí)驗(yàn)前期測(cè)定不同濃度多酚提取液對(duì)羥自由基的清除效果，確定最佳適用質(zhì)量濃度為1.25 mg/mL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，碧螺春老葉多酚處理能激活桃果實(shí)SOD、CAT、POD的活性，提高總酚、花青素的含量，增強(qiáng)多酚對(duì)DPPH自由基和羥自由基的清除能力。DPPH自由基的清除能力可能與桃果實(shí)總酚含量有關(guān)，而羥自由基的清除能力可能與某種或某幾種單酚物質(zhì)有關(guān)，與總酚含量關(guān)聯(lián)不大。溶菌酶的添加對(duì)于抑制桃果實(shí)失重、提高CAT、POD活性以及羥自由基清除能力方面表現(xiàn)出協(xié)同作用。