汪曉雅，陳芳，劉思慧，陳卓，邵淑倩，冉倩楠，李明楊，2*，任曉鏷，2*

（1.塔里木大學食品科學與工程學院，新疆 阿拉爾 843300；2.南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

新疆是多民族聚居區(qū)，本地區(qū)牧民自古以來就有制作和食用發(fā)酵乳制品的習慣，這些傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中蘊藏著極為豐富的優(yōu)質乳酸菌資源，賦予了產(chǎn)品良好的感官品質和風味特性。乳酸菌是一類廣泛存在于各種發(fā)酵食品中的有益微生物，其產(chǎn)生的胞外蛋白酶對食品發(fā)酵過程中的風味形成及品質改善起關鍵作用[1]，其在發(fā)酵乳、肉制品中的作用尤為突出。發(fā)酵肉制品中的肌肉蛋白質在乳酸菌胞外蛋白酶的作用下分解為多肽、氨基酸等風味前體物質，改善發(fā)酵肉制品的特征風味與品質特性，提升肉制品的營養(yǎng)價值，同時確保產(chǎn)品的安全性與穩(wěn)定性[2-4]。在發(fā)酵乳制品生產(chǎn)中，乳酸菌蛋白酶能夠分解乳蛋白產(chǎn)生多肽及氨基酸，提高胃蛋白酶的活性，促進損傷的腸黏膜上皮修復等，同時還能提升乳制品的品質和營養(yǎng)價值[5-6]。

細菌生物膜是一種有組織的、具有功能性的細菌群體，是由菌體細胞及其分泌至胞外的大分子物質組成的微生物集合體[7]。生物膜的形成能使細菌具有良好的穩(wěn)定性和對不利環(huán)境的抗逆性，如果賦予有益細菌（如乳酸菌）這些特性，將使其能更好地在生產(chǎn)和實踐中發(fā)揮作用[8-9]，乳酸菌生物膜的形成為其生存環(huán)境提供機械穩(wěn)定性，提高了菌體的抗逆性，保護了生物膜中的乳酸菌。同時，生物膜的形成也賦予乳酸菌多重功能特性，具有極高的應用價值和廣闊的應用前景[10-11]。因此，開展乳酸菌生物膜的相關研究可為其在生產(chǎn)上的進一步應用提供理論指導，使它們在改善人類健康方面發(fā)揮更大的作用。

乳酸菌在發(fā)酵肉、乳制品過程中，發(fā)酵制品的內環(huán)境會隨發(fā)酵進程的延長和加工方式的不同而有所差異，如乳酸菌產(chǎn)酸使體系pH值下降，不同的鹽添加量和不同溫度的影響等均可能改變體系的發(fā)酵特性[12-13]。不同加工條件可使乳酸菌生物膜形成能力發(fā)生改變，同時也影響著菌株的產(chǎn)酶活力及酶的活性等特性。酶的催化能力與其活性部位和空間結構有關，完整的二級和三級結構可維持酶活性中心的空間構象，一旦二級和三級結構受到破壞，酶的催化活性即會喪失[14]。加工條件（如鹽濃度、體系pH值、加工溫度）會對酶的活性部位與空間結構造成不可逆破壞，改變菌體自身的合成及代謝進程，同時也影響其生物膜形成能力，故不同加工條件脅迫下乳酸菌胞外產(chǎn)酶活力的性質及生物膜形成能力均會受到一定的影響[15]。因此，探索加工條件脅迫下乳酸菌的產(chǎn)酶活性與其生物膜形成能力之間的關系，為進一步開發(fā)利用乳酸菌生物膜提供思路，同時也對發(fā)酵乳制品形成優(yōu)良的風味和提升品質特性具有重要意義。

本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）zwq9是生物膜強陽性菌株[16]，經(jīng)初步分析，該菌株具有良好的產(chǎn)胞外蛋白酶活力。本研究以該菌株為研究對象，探索不同加工條件脅迫下該乳酸菌的生物膜形成能力與其產(chǎn)胞外酶特性，探討乳酸菌生物膜的形成與其產(chǎn)酶特性的關系，為深入發(fā)掘利用新疆特色乳制品中的乳酸菌資源提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生物膜陽性植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）zwq9：塔里木大學食品科學與工程學院畜產(chǎn)品加工課題組分離自新疆傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品老酸奶。

MRS肉湯培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術有限責任公司；WHB細胞培養(yǎng)板：上海臥宏生物科技有限公司；蛋白酶K（40 U/mg）：德國Merck公司；高碘酸鈉：福晨（天津）化學試劑有限公司；福林酚：上海源葉生物科技有限公司；L-酪氨酸：天津市光復精細化工研究所；干酪素：天津市北聯(lián)精細化學品開發(fā)有限公司；其他試驗所需試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

多功能酶標儀（Synergy H1）：美國BioTek儀器有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（HPX-9162MBE）、立式壓力蒸汽滅菌器（50SII）：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；高速冷凍離心機（TGL-bR）：上海安亭科學儀器廠；電熱鼓風干燥箱（101型）：北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細菌生長曲線的測定

挑取單菌落接種至MRS液體培養(yǎng)基，37℃下培養(yǎng)12 h，按體積比1∶100的接種比例將培養(yǎng)12 h的菌液接種至新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中，前12 h每隔1 h測定培養(yǎng)液590nm處的吸光度，同時測定培養(yǎng)24、36 h和48 h后培養(yǎng)液在590 nm處的吸光度。每組試驗重復3次。

1.3.2 生物膜形成能力檢測

參照文獻[17-18]的方法，采用微量板半定量法對植物乳桿菌zwq9的生物膜形成能力進行檢測。按體積比1∶100的接種比例將培養(yǎng)12 h的菌液30 μL接種至3 mL培養(yǎng)基，充分混勻，吸取200 μL至96孔板中，37℃恒溫靜置培養(yǎng)48 h后測定培養(yǎng)液在590 nm處的吸光度，傾出培養(yǎng)液，用無菌水洗板4次。56℃烘干固定1 h，50 μL 0.5%結晶紫染色5 min，自來水沖洗除去多余染液，37℃晾干，再用酶標儀測定其在490 nm處的吸光度。當OD490大于4.0時儀器顯示為OVRFLW，即默認此時OD490值為4.0。所有生物膜形成檢測試驗均重復3次。

1.3.3 生物膜組分分析

參照Rohde等[19]及李英等[20]的方法并略做改動，同1.3.2中采用96孔板法檢測分析植物乳桿菌zwq9生物膜的組分，將培養(yǎng)后的培養(yǎng)板取出，測定其在590 nm處的吸光度后輕輕傾出培養(yǎng)液，用無菌水洗板洗去未黏附細菌后，分別向培養(yǎng)板中加入20 μL 1 mg/mL蛋白酶K，37℃孵育2h，或向培養(yǎng)板中加入50μL 50 mmol/L高碘酸鈉，37℃孵育2 h，以不加蛋白酶K或高碘酸鈉的處理組為對照組，用酶標儀測定490 nm處的吸光度。每組試驗重復3次。

1.3.4 發(fā)酵條件脅迫體系的構建

根據(jù)乳酸菌的發(fā)酵特性，分別建立乳酸脅迫體系、溫度脅迫體系和鹽脅迫體系。1）乳酸脅迫體系：分別向初始液體培養(yǎng)基中加入一定量的乳酸，使乳酸的終濃度為0%、0.2%、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、3.0%；2）溫度脅迫體系：將接種后的培養(yǎng)液分別置于10、20、30℃和40℃條件下培養(yǎng)；3）鹽脅迫體系：分別向初始液體培養(yǎng)基中加入一定量的NaCl，使NaCl的終濃度為0%、1%、2%、4%、6%、8%、10%。分別分析不同脅迫體系條件下植物乳桿菌zwq9的生物膜形成能力及其產(chǎn)酶活力。

1.3.5 產(chǎn)蛋白酶活力的測定

取培養(yǎng)結束后的發(fā)酵液5mL于4℃下10000r/min離心10 min，收集上清液即為粗酶液[21]；參照GB/T 23527—2009《蛋白酶制劑》中的福林法對植物乳桿菌zwq9粗酶液的蛋白酶活力進行測定。將不同稀釋梯度的粗酶液與1%酪蛋白溶液充分混合均勻，置于40℃水浴中加熱20 min，加入2 mL 0.4 mol/L三氯乙酸終止反應。20℃靜置10 min后5 000 r/min離心15 min，取1 mL上清液與5 mL碳酸鈉溶液、0.5 mL福林酚溶液混合，40℃顯色20 min，測定680 nm處的吸光度。以酪氨酸標準溶液繪制標準曲線，計算粗蛋白酶的活力。本研究所得酪氨酸標準曲線為y=0.010 8x+0.001 8（R2=0.999 6）。蛋白酶活力的定義：在最適條件下，每分鐘內水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg酪氨酸所需的酶量定為一個活力單位（U）。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

本研究所得試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22進行統(tǒng)計分析，One-way ANOVA和Duncan’s多重比較用于分析不同處理組之間的差異，顯著水平為P＜0.05；所有試驗至少重復3次，結果表示為平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌zwq9的生長曲線及其生物膜形成能力

圖1為植物乳桿菌zwq9的生長曲線及其生物膜形成能力。

圖1 植物乳桿菌zwq9生長曲線及其生物膜形成能力Fig.1 Growth curve and biofilm formation of L.plantarum zwq9

如圖1A所示，植物乳桿菌zwq9的生長曲線呈典型的“S”型，能較清晰地區(qū)分延滯期、對數(shù)期和穩(wěn)定期，其中0～4 h為細菌生長的延滯期，4 h～10 h為對數(shù)期，隨后逐漸進入穩(wěn)定期。該菌株的生長符合細菌分批培養(yǎng)的典型生長規(guī)律。如圖1B所示，植物乳桿菌zwq9具有極強的生物膜形成能力，經(jīng)微量板半定量法檢測其OD490值高于4.0，這與文獻研究結果保持一致[16-17]。

2.2 植物乳桿菌zwq9的生物膜組分分析

圖2為植物乳桿菌zwq9的生物膜組分分析。

圖2 植物乳桿菌zwq9的生物膜組分分析Fig.2 The component analysis of the biofilm formed by L.plantarum zwq9

如圖2所示，不同處理對植物乳桿菌zwq9的生物膜有不同影響，與對照組相比，采用高碘酸鈉處理后，生物膜的OD490值無顯著變化（P＞0.05），而經(jīng)蛋白酶K處理后，其OD490值顯著降低（P＜0.05），蛋白酶K處理后生物膜的OD490值僅為對照組的13.64%，表明在zwq9的生物膜結構中，胞外蛋白質可能發(fā)揮著重要作用。

2.3 不同脅迫條件對植物乳桿菌zwq9生長及生物膜形成的影響

2.3.1 乳酸脅迫對植物乳桿菌zwq9生長及生物膜形成的影響

乳酸脅迫對植物乳桿菌zwq9生長及生物膜形成的影響如圖3所示。

圖3 不同乳酸添加量對植物乳桿菌zwq9生長及生物膜形成的影響Fig.3 Effects of different lactic acid concentrations on growth and biofilm formation by L.plantarum zwq9

如圖3所示，當外源乳酸添加量低于0.2%時，植物乳桿菌zwq9的生長及生物膜形成均不受影響，其OD590和OD490值與對照組（乳酸添加量為0%）相比均無顯著差異（P＞0.05）；在乳酸添加量為0.4%時，zwq9的生長濁度是對照組的90.51%，而其生物膜形成能力顯著降低了36%（P＜0.05）；當乳酸添加量在0.8%以上時，其能夠顯著抑制zwq9的生長和生物膜的形成（P＜0.05），其OD590和OD490值比對照組均降低了90%以上。

2.3.2 溫度脅迫對植物乳桿菌zwq9生長及生物膜形成的影響

溫度脅迫對植物乳桿菌zwq9生長及生物膜形成的影響如圖4所示。

圖4 不同培養(yǎng)溫度對植物乳桿菌zwq9生長及生物膜形成的影響Fig.4 Effects of different culture temperatures on growth and biofilm formation by L.plantarum zwq9

如圖4所示，當培養(yǎng)溫度低于10℃時，植物乳桿菌zwq9的生長及生物膜形成能力在所有處理組中相對最低；當培養(yǎng)溫度提升至30℃時，其生長及生物膜形成情況良好，此時與40℃處理組之間無顯著差異（P＞0.05），兩組生物膜形成的OD490值均大于4.0，并且均顯著高于10℃和20℃處理組（P＜0.05）。

2.3.3 鹽脅迫對植物乳桿菌zwq9生長及生物膜形成的影響

鹽脅迫對植物乳桿菌zwq9生長及生物膜形成的影響如圖5所示。

圖5 不同鹽濃度對植物乳桿菌zwq9生長及生物膜形成的影響Fig.5 Effects of different salt concentrations on growth and biofilm formation by L.plantarum zwq9

如圖5所示，當NaCl濃度低于4%時，植物乳桿菌zwq9的生物膜形成與對照組（NaCl濃度為0%）無顯著差異（P＞0.05），但其生長受到一定影響。與對照組相比，1%NaCl顯著增加了植物乳桿菌zwq9的OD590值（P＜0.05），而4%NaCl則顯著抑制了植物乳桿菌zwq9的生長（P＜0.05），2%NaCl處理組的 OD590值與對照組無顯著差異（P＞0.05）；當NaCl濃度高于 6%時，植物乳桿菌zwq9的生長及其生物膜形成能力均被顯著抑制（P＜0.05），當NaCl濃度達到8%時，與對照組相比，其OD590值降低了90%以上，OD490值減小了98%以上。

通過對樣機進行標定獲得大量數(shù)據(jù),使用以上兩種方法進行解耦運算,發(fā)現(xiàn)兩種方法解得的結果都有較大的誤差。其中使用求解標定矩陣方法時發(fā)現(xiàn),該樣機當單獨施加My或Mz方向的力矩時,其他方向會產(chǎn)生非常嚴重的維間耦合;使用BP神經(jīng)網(wǎng)絡訓練的方法時發(fā)現(xiàn),對標定數(shù)據(jù)的解算結果良好,但是當將該網(wǎng)絡進行對多維復合加載數(shù)據(jù)的驗證時,會產(chǎn)生極大的偏差。這兩個問題的出現(xiàn)意味著常用的兩種解耦方法無法針對該樣機使用。

2.4 不同脅迫條件對植物乳桿菌zwq9產(chǎn)蛋白酶活力的影響

2.4.1 乳酸脅迫對植物乳桿菌zwq9產(chǎn)蛋白酶活力的影響

乳酸脅迫對植物乳桿菌zwq9產(chǎn)蛋白酶活力的影響如圖6所示。

圖6 不同乳酸濃度對植物乳桿菌zwq9產(chǎn)蛋白酶活力的影響Fig.6 Effects of different lactic acid concentrations on proteaseproducing activity of L.plantarum zwq9

如圖6所示，在乳酸脅迫條件下，隨著外源乳酸濃度的增加，植物乳桿菌zwq9產(chǎn)胞外蛋白酶活力呈下降趨勢；與對照組（乳酸濃度為0%）相比，當乳酸濃度為0.2%時，菌株的產(chǎn)酶活力顯著下降了12.57%（P＜0.05）；當濃度增加至0.4%時，產(chǎn)酶活力顯著低于對照組（P＜0.05），僅為對照組的60%；當乳酸濃度增加至0.8%以上時，植物乳桿菌zwq9的產(chǎn)酶活力與對照組相比顯著降低（P＜0.05），降低了94%以上。

2.4.2 溫度脅迫對植物乳桿菌zwq9產(chǎn)蛋白酶活力的影響

溫度脅迫對植物乳桿菌zwq9產(chǎn)蛋白酶活力的影響如圖7所示。

圖7 不同培養(yǎng)溫度對植物乳桿菌zwq9產(chǎn)蛋白酶活力的影響Fig.7 Effects of different culture temperatures on proteaseproducing activity of L.plantarum zwq9

如圖7所示，溫度條件對植物乳桿菌zwq9的產(chǎn)胞外蛋白酶活力也有較大影響。隨著培養(yǎng)溫度的升高，植物乳桿菌zwq9的產(chǎn)酶活力呈先增加再降低的趨勢，在30℃時，產(chǎn)酶活力相對最高，顯著高于其他處理組（P＜0.05），其次為40℃處理組，但其產(chǎn)酶活力僅為30℃處理組的50.79%。

2.4.3 鹽脅迫對植物乳桿菌zwq9產(chǎn)蛋白酶活力的影響

圖8 不同鹽濃度對植物乳桿菌zwq9產(chǎn)蛋白酶活力的影響Fig.8 Effects of different salt concentrations on proteaseproducing activity of L.plantarum zwq9

如圖8所示，在不同鹽濃度脅迫體系中，隨著NaCl添加濃度的增加，植物乳桿菌zwq9的產(chǎn)胞外蛋白酶活力也整體呈先升高后降低的趨勢，添加1%NaCl能夠顯著增加zwq9的產(chǎn)酶活力（P＜0.05），產(chǎn)酶活力比對照組提高了43.80%，并且添加2%和4%NaCl處理組的產(chǎn)酶活力也顯著高于對照組（P＜0.05）；當NaCl濃度高于8%時，zwq9的產(chǎn)酶活力顯著低于其他處理組（P＜0.05），與對照組相比降低了90%以上。這表明較低濃度NaCl（≤4%）的添加能夠在一定程度上提高zwq9的產(chǎn)蛋白酶活力，而高濃度NaCl（≥8%）的添加幾乎完全抑制了菌株的產(chǎn)酶活力。

2.5 相關性分析

采用SPSS 22對不同脅迫條件下植物乳桿菌zwq9的生長量（OD590值）、生物膜形成能力（OD490值）和產(chǎn)蛋白酶活力進行Pearson相關性分析，結果如表1所示。

表1 Pearson相關性分析Table 1 Pearson correlation analysis

由表1可知，在乳酸和鹽脅迫條件下，植物乳桿菌zwq9的生長量、生物膜形成能力和產(chǎn)蛋白酶活力之間均呈極顯著正相關關系（P＜0.01）。

3 討論與結論

新疆地區(qū)由于其獨特的地理環(huán)境及歷史文化等因素，發(fā)酵肉、乳制品是優(yōu)質乳酸菌資源的重要來源，尤其是亟待充分開發(fā)利用的生物膜陽性乳酸菌資源。西熱娜依·阿布力克木等[22]從新疆阿圖什市和烏什縣傳統(tǒng)酸奶分離獲得57株乳酸菌，其中生物膜陽性菌38株，占73%，并且發(fā)現(xiàn)生物膜的形成能力與酸奶的拉絲特性呈正相關關系。本課題組前期從新疆特色酸奶及奶疙瘩等乳制品中分離獲得110株乳酸菌，其中生物膜陽性乳酸菌70株，占比63.64%[16]；遠高于其他學者所報道的其他地區(qū)和來源乳酸菌的生物膜形成能力[23-24]。

細菌生物膜是由細菌細胞及其分泌至胞外的大分子物質所組成的集合體，其組分通常包括胞外多糖、胞外蛋白、核酸及少量其他物質，但不同種類細菌生物膜的組分及各組分的作用有較大差異[7，25-26]。李英等[20]對2株表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）的生物膜組分分析發(fā)現(xiàn)，菌株ATCC 35984的生物膜主要為胞外多糖，而臨床分離株5-121-2的生物膜中胞外蛋白起主導作用。金黃色葡萄球菌（S.aureus）ATCC 29213的生物膜中，胞外蛋白含量最高，胞外多糖的含量相對最低[27]。在副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）的生物膜中，胞外蛋白的含量與生物膜的形成呈正相關，而胞外多糖的含量與生物膜的形成不具有相關性[28]。而本研究結果顯示在植物乳桿菌zwq9的生物膜中，胞外蛋白所起的作用比胞外多糖更為重要。乳酸菌是一類富產(chǎn)胞外多糖的細菌，該類多糖在食品工業(yè)應用廣泛，而胞外多糖又是乳酸菌生物膜的組成部分，但產(chǎn)量高并不一定參與到乳酸菌的生理活動中，這與紀亞楠[29]的研究結果相一致。在不同脅迫體系中，乳酸菌生物膜形成無明顯變化時，其胞外多糖產(chǎn)量卻明顯降低，二者并未呈正相關關系。

在發(fā)酵乳、肉制品生產(chǎn)過程中，體系內存在的多種脅迫因素等會促進或抑制乳酸菌的產(chǎn)酶活力和生物膜形成能力，這些脅迫因素中最常見的有酸脅迫、溫度脅迫和鹽脅迫。這些因素不僅是菌體生長的重要控制條件，同時也關系到菌體的產(chǎn)酶活性及生物膜的形成能力。Sharma等[30]指出，體系的pH值影響微生物的產(chǎn)酶和營養(yǎng)物質的細胞膜運輸，這可能是由于在最適pH值時，質子在化學滲透中的動力受體系pH值的影響，微生物的相對代謝效率較高，故產(chǎn)酶能力提升。體系溫度不僅影響與菌體產(chǎn)酶相關的細胞代謝，而且和酶與底物蛋白的反應速率、分子作用強度及相關理化特性密切相關[31]。龐豐平等[32]通過Plackett-Burman試驗及響應面分析得出，瑞士乳桿菌（L.helveticus）的最優(yōu)產(chǎn)蛋白酶條件為發(fā)酵溫度36℃、起始pH6.65、發(fā)酵時間16 h，此時蛋白酶活力為22.59 U/mL。宋園亮等[33]對一株分離自云南豆豉中乳酸菌的產(chǎn)蛋白酶條件進行分析，發(fā)現(xiàn)起始pH5.0、35℃發(fā)酵培養(yǎng)36 h，菌株的產(chǎn)蛋白酶活力可達32.50 U/mL。乳酸菌生物膜的形成也與體系的pH值和溫度密切相關。趙佳偉等[34]指出植物乳桿菌RS66CD在NaCl質量濃度為53 g/L、40℃培養(yǎng)24 h時，菌株的生物膜形成量最大。紀亞楠[29]研究發(fā)現(xiàn)，不同乳酸菌生物膜形成的最佳條件不同，植物乳桿菌5-4-1生物膜形成的最佳條件為培養(yǎng)基pH7.5、培養(yǎng)溫度44℃、NaCl質量分數(shù)1.5%，而對于乳酸片球菌（Pediococcus lactis）TG1-1-10，培養(yǎng)基 pH7.5、培養(yǎng)溫度30℃、NaCl質量分數(shù)4.5%時，其生物膜形成能力最強。在本研究中，植物乳桿菌zwq9的生物膜形成能力及其產(chǎn)蛋白酶活力也受到培養(yǎng)基pH值和培養(yǎng)溫度的影響。植物乳桿菌的乳酸發(fā)酵屬于同型乳酸發(fā)酵，在其發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時間的延長，乳酸在發(fā)酵液中逐漸積累導致pH值降低，進而導致其生長量、生物膜形成能力及產(chǎn)蛋白酶活力均降低，尤其是當乳酸添加量高于0.8%時，乳酸菌的生物膜形成能力和產(chǎn)蛋白酶活力與對照組相比均降低90%以上。有學者指出，在乳酸菌的發(fā)酵進程中，隨著體系中乳酸等酸性物質的累積，乳酸菌細胞的生長及代謝活動被抑制，同時高濃度的酸使細胞質中積累大量質子，最終影響乳酸菌的增殖能力和各種生物活性功能[29]。培養(yǎng)溫度過高或過低均不利于乳酸菌的生長和代謝機能，在10℃時，植物乳桿菌zwq9的生長量、生物膜形成能力和產(chǎn)蛋白酶活力均被抑制，而當培養(yǎng)溫度為40℃時，植物乳桿菌zwq9的產(chǎn)蛋白酶活力顯著降低（P＜0.05），但其生長及生物膜形成能力與30℃相比無顯著差異（P＞0.05）。在低溫脅迫條件下，冷刺激會造成乳酸菌細胞的機械性損傷，導致細胞流動性變差，甚至引起DNA損傷，最終導致乳酸菌生長及代謝活動減緩甚至停滯[35-36]；而在高溫脅迫下，可能會引起乳酸菌細胞內蛋白質的變性和沉降，還會使細胞內核糖體、RNA等多種大分子物質的穩(wěn)定性下降，改變細胞膜的流動性等，進而影響乳酸菌的生理特性及代謝活動[37-38]。

外界鹽脅迫條件對乳酸菌細胞的存活、增殖、代謝途徑及活力均有較大影響，進而改變乳酸菌的發(fā)酵特性。有學者分析了鹽脅迫體系中嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）和瑞士乳桿菌的產(chǎn)酶活力的變化，發(fā)現(xiàn)鹽脅迫可使兩種乳酸菌細胞活力下降、產(chǎn)酶活力升高，體系中游離氨基酸含量增加[39]；而隨著鹽濃度的進一步增加，高鹽脅迫條件使乳酸菌的產(chǎn)酶活力迅速降低，細胞存活力也急劇下降，細胞膜的完整性遭到嚴重破壞[40]。對于乳酸菌生物膜，有學者指出，較低濃度的Na+能夠通過影響體系滲透壓平衡，促進生物膜形成相關基因表達，補償生物膜表型不穩(wěn)定等，促進生物膜的形成[34，41-42]。這與本研究的結果較為相似，添加1%NaCl能夠顯著增加植物乳桿菌zwq9的生長量（P＜0.05），并顯著增強其產(chǎn)酶活力（P＜0.05）（可能對其生物膜形成能力也具有一定的增強效應，但由于所用儀器最高限值的影響在本研究中的數(shù)據(jù)未顯示）。根據(jù)目前已有關于乳酸菌耐鹽機制的研究結果，植物乳桿菌的耐鹽機制主要包括相容性溶質調控系統(tǒng)和糖酵解關鍵酶調控系統(tǒng)[43]，在相容性溶質調控系統(tǒng)中，隨著NaCl添加量的增加，植物乳桿菌zwq9在細胞內積累相容性物質（如甘氨酸甜菜堿、海藻糖、脯氨酸等），這些物質在維持細胞正常滲透壓的同時，也在一定程度上改變了乳酸菌的合成與代謝通路，進而影響其生長、生物膜形成及胞外酶的產(chǎn)生等[43-44]；另一方面，一定濃度NaCl的添加會誘導植物乳桿菌糖酵解途徑（Embden-Meyerhof-Parnas，EMP）相關基因 pfk、fba、pgk、ldh等的表達量上調，使EMP途徑更為高效地進行[45]，進而導致植物乳桿菌的生長特性和發(fā)酵特性發(fā)生改變，影響其生長、生物膜形成和產(chǎn)蛋白酶活力。

綜上，本研究從生物膜形成及產(chǎn)生胞外蛋白酶方面著手，發(fā)現(xiàn)在不同脅迫條件下，植物乳桿菌zwq9的生物膜形成能力與其產(chǎn)胞外蛋白酶活力緊密相關，二者呈極顯著正相關關系（P＜0.01），兩種代謝活動均隨乳酸菌細胞在不同脅迫條件下生理特性的改變而發(fā)生變化，這為進一步開發(fā)利用優(yōu)質乳酸菌資源提供參考思路。