李梓萌,劉宇龍

(吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 1.內(nèi)分泌代謝科;2.骨科,吉林 長春130033)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic Retinopathy,DR)是糖尿病最常見和嚴重的并發(fā)癥,已經(jīng)成為成人失明和視覺損傷的主要原因[1]。DR早期常常沒有任何癥狀,隨著疾病的進展,可以出現(xiàn)不同程度的視力缺失且不可逆轉(zhuǎn)[2]。目前DR尚無早期診斷和治療方法[3],晚期治療手段也較少且存在爭議[4]。因此,對DR的早篩查、早診斷、早治療已成為目前臨床中亟需解決的問題[3]。外泌體源性非編碼RNA(non-coding DNA,ncRNA)近年來被認為有望成為疾病極具潛力的生物標志物[5-6]。目前已有成熟的肝癌、胰腺癌相關(guān)miRNA檢測試劑盒,但是在DR領(lǐng)域尚無明確研究成果。因此,明確外泌體源性非編碼RNA在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的診斷價值具有重大意義。

1 糖尿病視網(wǎng)膜病變流行病學及診斷現(xiàn)狀

據(jù)統(tǒng)計,在全球糖尿病患者中,糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生率為22.27%,2020年DR患者約有1.0312億,預計2045年將達到1.605億[2]。糖尿病視網(wǎng)膜病變主要分為非增殖期(Non-proliferative Diabetic Retinopathy,NPDR)及增殖期(Proliferative Diabetic Retinopathy,PDR)。早期特點是視網(wǎng)膜上血管內(nèi)皮細胞和周細胞的進行性丟失以及連接蛋白的緩慢溶解,導致血管滲透性增加和視網(wǎng)膜黃斑水腫;晚期特點是炎癥細胞浸潤、組織破壞和新生血管形成,進一步引起玻璃體積血及牽拉性視網(wǎng)膜脫離[1]。眼底熒光素血管造影(Fundus fluorescein angiography,FFA)是診斷DR的金標準[2],但其為侵入性檢查,此外尚有檢眼鏡檢查、彩色眼底照相和光學相干斷層掃描等方法[2],但因無法發(fā)現(xiàn)早期病變、容易漏診細微病變、對醫(yī)生的診斷水平要求很高等缺點限制了臨床應(yīng)用。近年來的研究表明,在DR的病程進展中,神經(jīng)退行性病變早于微血管改變[7]。因此,需要更有效的檢測手段早期預測或發(fā)現(xiàn)糖尿病視網(wǎng)膜病變并進行早期干預。

2 外泌體源性非編碼RNA在糖尿病視網(wǎng)膜病變中的診斷價值

2.1 外泌體源性非編碼RNA作為生物標志物在疾病診斷中的優(yōu)勢

外泌體是一種細胞外泌性囊泡,可由多種細胞產(chǎn)生并釋放入細胞外空間,廣泛存在于血液、尿液、唾液等各種生物體液中,富含核酸(miRNA、lncRNA、circRNA、mRNA、tRNA等)、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等[8]。外泌體作為細胞間通訊的重要媒介,攜帶和傳遞重要的信號分子,廣泛參與細胞間物質(zhì)運輸和信息傳遞,調(diào)節(jié)細胞生理活動,與多種疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[8]。其良好的生物相容性及穿越生物屏障的能力保證了內(nèi)容物的完整性和活性。ncRNA如lncRNA、miRNA、circRNA等主要參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,可以在外泌體的保護下免受體液中RNA酶的降解而穩(wěn)定存在,隨外泌體循環(huán)并被鄰近或遠處的細胞攝取,參與受體細胞的增殖、分化、遷移等活動,調(diào)控疾病的發(fā)生和進展[5]。lncRNA、circRNA還能充當競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)或者RNA海綿,通過抑制miRNA活性來調(diào)節(jié)靶基因表達[9]。疾病發(fā)生時,組織中特異性外泌體釋放入外周血,致使循環(huán)中ncRNA的表達譜發(fā)生改變,其變化出現(xiàn)在疾病的早期階段并可以被高效、定量檢測出來,比常規(guī)檢查具有更高的敏感性和特異性。此外,循環(huán)miRNA等在體內(nèi)可以存活很久(接近2周)[10],并且在體外各種不同的環(huán)境下能夠穩(wěn)定存在,可以抵抗不同的pH、溫度、氣壓及核糖核酸酶RNases,甚至可以在反復凍融條件下穩(wěn)定存在、高效恢復并可以被高效、定量檢測出來。因此,近年來外泌體源性ncRNA憑借其穩(wěn)定性、普遍性、高特異性、高靈敏度,被認為可以成為疾病極具潛力的非侵入性生物標志物[8]。

2.2 外泌體源性非編碼RNA作為糖尿病視網(wǎng)膜病變生物標志物的研究現(xiàn)狀

糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生時存在大量異常表達的ncRNA,它們可以選擇性地透過血-視網(wǎng)膜屏障[11],影響炎癥應(yīng)答、胰島素信號通路和血管生成[12],與視網(wǎng)膜細胞的增殖、遷移、凋亡有很重要的關(guān)系[10]。外泌體源性ncRNA可以轉(zhuǎn)移到靶細胞或靶器官調(diào)節(jié)基因表達,也可以在其囊泡結(jié)構(gòu)保護下穩(wěn)定儲存在循環(huán)液中,因此,它們可以作為反映疾病進展的生物標志物[6]。大量研究表明外泌體源性ncRNA有望成為DR早期診斷的生物標志物及治療靶點[8],如miR-202-5p、miR-15a、miR-20a-5p、miR-20a-3p、circ-Ehmt1、circ-0005015、lncRNA SNHG7等。但是目前國內(nèi)外非編碼RNA與DR的相關(guān)研究中,以細胞、動物研究居多,臨床研究較少且多采用qRT-PCR或基因芯片進行候選驗證,無法尋找最有意義的ncRNA分子,僅有少數(shù)研究采用高通量測序進行全基因組篩選但樣本數(shù)極少(僅為個位數(shù))。

2.2.1外泌體源性miRNA作為糖尿病視網(wǎng)膜病變生物標志物的研究現(xiàn)狀 miRNA是內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA,長度約為19～24個核苷酸[2],在人類所有類型細胞中都有表達,參與了機體幾乎所有的病理生理過程,如細胞增殖、分化、凋亡等[6]。外泌體源性miRNA進入靶細胞后,可直接與特定靶mRNA的3’-非翻譯區(qū)(3’-untranslated region,3’-UTR)相結(jié)合,通過降解靶mRNA或抑制其翻譯,在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因蛋白質(zhì)的表達。外泌體源性miRNA也可以與lncRNA等“海綿”結(jié)合,發(fā)揮生理調(diào)節(jié)作用[6]。近來研究報道了外泌體源性miRNA在DR發(fā)展中的重要作用,特別是在視網(wǎng)膜細胞功能障礙中[6]。如KAMELDEN等證明[13]胰腺β細胞來源的外泌體源性miR-15a可以進入血液并通過靶向AKT3促進視網(wǎng)膜Müller細胞的凋亡,MAISTO[14]等報道高糖水平可以降低原代視網(wǎng)膜細胞釋放的外泌體中抗血管生成的miRNA(如miR-106a-5p、miR-20a-5p和miR-20a-3p)的水平,以調(diào)節(jié)VEGF的表達,從而促進視網(wǎng)膜光感受器的損傷。目前許多臨床研究發(fā)現(xiàn)DR患者血清中外泌體源性miRNA顯著升高,可作為DR診斷的生物標志物,具有較高的診斷效力,不僅可以用來診斷DR,還可以區(qū)分增殖期與非增殖期。如LIU等[15]通過qRT-PCR及ROC曲線發(fā)現(xiàn)與與健康對照組相比miR-425p診斷DR的AUC值為0.907 2,敏感度91.7%,特異度84%,與2型糖尿病患者相比其診斷的AUC值為0.833,敏感度85.7%,特異度78%;用來區(qū)別增殖期和非增殖期的AUC值為0.802,敏感度94.5%,特異度71.1%。WANG等[16]通過qRT-PCR及ROC曲線發(fā)現(xiàn)miR-374a用來診斷DR的AUC值為0.892,敏感度為82.9%,特異度為80.29%,用來區(qū)別增殖期和非增殖期的AUC值為0.807,敏感度為84.2%,特異度為78.83%。

2.2.2外泌體源性lncRNA作為糖尿病視網(wǎng)膜病變生物標志物的研究現(xiàn)狀 長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是轉(zhuǎn)錄本長度大于200nt的非編碼RNA[17]。在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上調(diào)控基因表達和蛋白質(zhì)形成,并影響細胞增殖、凋亡、免疫反應(yīng)和氧化應(yīng)激[17]。近來研究表明,lncRNA MALAT1、lncRNA MEG3、lncRNA MIAT、lncRNA H19、lncRNA HOTAIR、lncRNA BANCR、lncRNA SNHG16等可通過PI3K-Akt、SIRT1、P38 MAPK、TGF-β、Nrf2等通路參與DR的進展[17]。研究表明lncRNA MALAT1在DR神經(jīng)變性、炎性反應(yīng)、血管新生方面發(fā)揮了一定的致病作用[9,18-19],DR患者血清中MALAT1表達上調(diào),可作為DR早期診斷及嚴重程度的無創(chuàng)生物標志物[20],MALAT1下調(diào)將明顯改善糖尿病視網(wǎng)膜周細胞丟失、毛細血管變形、微血管滲漏、炎癥及視網(wǎng)膜光感受器損害所致的糖尿病神經(jīng)變性[21,17],減輕氧化應(yīng)激損傷,延緩DR的病程進展[22]。lncRNA PPT2-EGFL8在DR患者外周血中表達明顯下降,miR-423-5p明顯上升,PPT2-EGFL8通過分子海綿作用吸收miR-423-5p,抑制缺氧誘導的人視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細胞增殖[23]。血漿外泌體lncRNA DLX6-AS1和PRINS二者聯(lián)合診斷DR的AUC值為0.813,有望作為DR的診斷標志物[24]。BISWAS等在患者血清中檢測了9個lncRNAs(ANRIL、MALAT1、WISPER、ZFAS1、H19、HOTAIR、HULC、MEG3和MIAT),通過ROC和進一步分析,確定了lncRNA聯(lián)合應(yīng)用可以用來診斷篩查DR患者[25]。

2.2.3外泌體源性circRNA作為糖尿病視網(wǎng)膜病變生物標志物的研究現(xiàn)狀

與傳統(tǒng)的線性RNA不同,circRNA是一種特殊類型的非編碼RNA,其分子呈封閉環(huán)狀結(jié)構(gòu),不受RNA外切酶影響,表達更為穩(wěn)定[26]。circRNA已成為繼miRNA和lncRNA之后,ncRNA研究領(lǐng)域的新熱點,可以通過影響RNA聚合酶鏈長度、作為miRNA海綿調(diào)節(jié)靶基因表達、與RNA結(jié)合蛋白相互作用調(diào)節(jié)翻譯過程等方式調(diào)節(jié)各種細胞活動[27]。越來越多研究表明circRNA如circHIPK3、circRNA cZNF609等可通過調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細胞的生長、增殖、遷移等在DR疾病進程中發(fā)揮重要作用[27]。有研究通過芯片發(fā)現(xiàn)糖尿病視網(wǎng)膜組織中529個circRNA異常表達,通過qRT-PCR驗證了DR患者外周血中circ_0005015高表達,可作為DR診斷的生物標志物,其可通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細胞增殖、遷移等調(diào)控視網(wǎng)膜內(nèi)皮血管生成,可作為miR-519d-3p海綿抑制其表達并增加MMP-2、XIAP、STAT3的表達[28];有研究通過測序和qRT-PCR發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0001953在PDR患者中明顯升高,ROC曲線顯示其與NPDR患者和對照組相比有較高診斷準確率,AUC值分別為0.87和0.92[29]。最新有研究通過對患者血清外泌體中分離的總RNA進行測序發(fā)現(xiàn)circMKLN1在DR中異常高表達,在鏈脲佐菌素(STZ)誘導的糖尿病小鼠模型中通過AAV2轉(zhuǎn)導抑制cricMKLN1可顯著改善視網(wǎng)膜血管滲漏,在人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細胞(hRECs)中發(fā)現(xiàn)circMKLN1可作為分子海綿吸附miR-26-5p,調(diào)節(jié)高糖/甲基乙二醛介導的自噬[30]。

3 總結(jié)與展望

綜上所述,需要通過更多臨床研究發(fā)現(xiàn)最有診斷價值的外泌體源性ncRNA,并通過細胞、動物研究解析ncRNA在DR發(fā)生發(fā)展中的重要作用,以期將外泌體源性ncRNA作為DR早期診斷的生物標志物,達到對疾病的預防、早篩及早干預,為臨床上DR的早期診斷及治療提供一定的幫助。