尹晶晶，劉 歡，高 潔，王志鵬，袁 慧，李建華，李建國(guó)

(中國(guó)輻射防護(hù)研究院 放射醫(yī)學(xué)與環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所 藥物毒理與放射損傷藥物山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中核集團(tuán)放射毒理與放射性藥物臨床前評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030006)

0 引言

鈾在自然界天然存在[1],鈾溶液中主要以鈾酰離子為主要形式[2].鈾具有放射和化學(xué)雙重毒性,人們對(duì)鈾毒性的關(guān)注主要是作為重金屬元素的鈾的化學(xué)毒性而非放射毒性[3,4].鈾可通過吸入、皮膚破損、水和食物鏈等方式進(jìn)入人體,對(duì)人體組織和器官造成損傷[5].研究發(fā)現(xiàn),鈾進(jìn)入體內(nèi)可在腎臟[6]、骨骼[7]、肝臟、生殖系統(tǒng)[8]等多個(gè)器官富集,造成器官損傷,增加癌癥的發(fā)病率[9].文獻(xiàn)中報(bào)道的鈾的毒性作用機(jī)制研究主要集中在氧化應(yīng)激、DNA損傷、蛋白結(jié)合與功能異常、炎癥及凋亡和自噬等[10-14],但鈾的毒性作用機(jī)制仍不清楚.

蛋白表達(dá)水平與生物學(xué)功能表型特征最相關(guān),隨著色譜和質(zhì)譜技術(shù)的飛速發(fā)展,蛋白組學(xué)研究得到飛速發(fā)展,通過檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平,建立蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò),實(shí)現(xiàn)了在蛋白水平對(duì)作用機(jī)制的深入研究.應(yīng)用蛋白組學(xué)在細(xì)胞層面進(jìn)行鈾毒性研究較少.

因此,本研究應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜標(biāo)簽(Tandem Mass Tag,TMT)標(biāo)記蛋白組學(xué)技術(shù)篩選硝酸鈾酰染毒后CHO-K1細(xì)胞中差異表達(dá)的蛋白,并對(duì)差異表達(dá)的蛋白進(jìn)行功能富集分析,篩選出關(guān)鍵靶蛋白和信號(hào)通路,以期進(jìn)一步探索硝酸鈾酰染毒對(duì)CHO-K1細(xì)胞損傷潛在的分子機(jī)制.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1.1 主要材料

CHO-K1細(xì)胞,購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù).

硝酸鈾酰(美國(guó)Sigma公司)；F-12K培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；SDS裂解液(上海碧云天公司)；BCA蛋白定量試劑盒(美國(guó)ThermoScientific公司)；PMSF(美國(guó)Amresco公司)；TMT標(biāo)記試劑盒(美國(guó)ThermoFisher公司)；質(zhì)譜級(jí)乙腈(美國(guó)ThermoScientific公司)；羥胺(美國(guó)Sigma公司)；質(zhì)譜級(jí)水(美國(guó)ThermoScientific公司).

1.1.2 主要儀器

CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)ThermoScientific公司)；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)電泳儀(北京市六一儀器廠)；酶標(biāo)儀(上?？迫A實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)有限公司)；全自動(dòng)數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；Q Exactive plus質(zhì)譜儀(美國(guó)ThermoFisher公司)；高pH分離液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

CHO-K1細(xì)胞培養(yǎng)于含10% 胎牛血清的F-12K培養(yǎng)基中,置于37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.2.2 細(xì)胞存活率測(cè)定

采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法測(cè)定細(xì)胞存活率.分別加入0 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、300 μmol/L和500 μmol/L 硝酸鈾酰,在37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱孵育12 h、24 h、48 h和72 h后,去除培養(yǎng)基,每孔加入100 μl空白培養(yǎng)基和10 μl CCK-8溶液，于37 ℃孵育2.5 h,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的OD值,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.細(xì)胞存活率=(染毒孔-空白孔)/(對(duì)照孔-空白孔)× 100%.

1.2.3 TMT標(biāo)記及蛋白組學(xué)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組和硝酸鈾酰染毒組.對(duì)照組細(xì)胞為正常CHO-K1細(xì)胞,硝酸鈾酰染毒組染毒濃度為500 μmol/L,染毒時(shí)間24 h.加入裂解液和蛋白酶抑制劑PMSF,取對(duì)照組和染毒組CHO-K1細(xì)胞提取總蛋白.

提取出的總蛋白用胰蛋白酶酶解后,加入TEAB緩沖液,用TMT試劑盒進(jìn)行肽段標(biāo)記,加入TMT試劑,渦旋混勻后室溫放置1 h,加入5%羥胺反應(yīng)15 min,-80 ℃保存?zhèn)溆?

反相色譜分離,色譜條件:流動(dòng)相ACN-H2O,流速300 μL/min.收集樣品后真空冷凍干燥抽干,進(jìn)行色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析.

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Proteome DiscovererTM 2.4(美國(guó)ThermoFisher公司)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,使用的數(shù)據(jù)庫(kù)為Uniprot,檢索條件為FDR < 0.01.以差異倍數(shù)FC > 1.5,且差異顯著性P-value < 0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)蛋白.

1.2.5 生物信息學(xué)分析

對(duì)篩選出的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行基因本體(Gene Ontology,GO)功能注釋分析、京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)信號(hào)通路分析及蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)胞存活率測(cè)定結(jié)果

CHO-K1細(xì)胞經(jīng)0 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、300 μmol/L、500 μmol/L 硝酸鈾酰染毒12 h、24 h、48 h和72 h,細(xì)胞存活率測(cè)定結(jié)果如圖1所示.由圖1可知，隨著硝酸鈾酰濃度的升高,細(xì)胞存活率逐漸降低,且隨著作用時(shí)間的增加,細(xì)胞存活率也呈下降趨勢(shì).染毒12 h后50 μmol/L染毒組細(xì)胞存活率較對(duì)照組顯著降低(P<0.05),100 μmol/L、300 μmol/L和500 μmol/L染毒組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.01)；染毒24 h后50 μmol/L、100 μmol/L、300 μmol/L和500 μmol/L染毒組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.01)；染毒48 h后50 μmol/L、100 μmol/L、300 μmol/L和500 μmol/L染毒組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.01)；染毒72 h后50 μmol/L和300 μmol/L染毒組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05),100 μmol/L和500 μmol/L染毒組細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.01).

圖1 不同濃度硝酸鈾酰染毒不同時(shí)間CHO-K1細(xì)胞存活率

2.2 蛋白鑒定結(jié)果

CHO-K1細(xì)胞經(jīng)500 μmol/L硝酸鈾酰染毒24 h,提取蛋白質(zhì),經(jīng)胰蛋白酶消化和TMT標(biāo)記,利用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行分析,分析后進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)檢索,共獲得蛋白譜圖42 401張,肽段數(shù)量23 553條,鑒定出蛋白4 772個(gè).

2.3 硝酸鈾酰染毒誘導(dǎo)的CHO-K1細(xì)胞差異蛋白篩選結(jié)果

以差異倍數(shù)大于1.5倍,P<0.05為差異顯著性標(biāo)準(zhǔn),如圖2所示,染毒組與對(duì)照組相比篩選出差異表達(dá)蛋白309個(gè),其中164個(gè)蛋白上調(diào)表達(dá),145個(gè)蛋白下調(diào)表達(dá).

圖2 染毒組CHO-K1細(xì)胞差異表達(dá)蛋白數(shù)量

以log2(差異倍數(shù))為橫坐標(biāo),-log10(P-value)為縱坐標(biāo),繪制差異表達(dá)蛋白火山圖,如圖3所示,紅色的點(diǎn)為上調(diào)差異表達(dá)蛋白,藍(lán)色的點(diǎn)表示下調(diào)差異表達(dá)蛋白,灰色的點(diǎn)為非顯著差異表達(dá)蛋白,距離0點(diǎn)越遠(yuǎn)表示差異越大,可以顯示染毒組與對(duì)照組蛋白的具體差異.

圖3 差異表達(dá)蛋白火山圖

2.4 差異蛋白表達(dá)水平聚類分析

如圖4所示,以熱圖形式顯示差異表達(dá)蛋白的聚類分析,紅色表示高表達(dá)蛋白,藍(lán)色表示低表達(dá)蛋白,每行表示每個(gè)蛋白在不同組中的表達(dá)量情況,每列表示每個(gè)組中所有差異蛋白的表達(dá)量情況.同組蛋白特征相似的聚在一起,不同組蛋白相似率越低,樣本間距離越遠(yuǎn),表明對(duì)照組和染毒組樣本具有明顯差異.

圖4 差異蛋白表達(dá)水平聚類分析圖

2.5 差異表達(dá)蛋白GO富集分析結(jié)果

通過GO富集分析對(duì)篩選出的309個(gè)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行生物過程(Biological Process)、細(xì)胞成分(Cellular Component)和分子功能(Molecular Function)三方面的分析,研究差異表達(dá)蛋白在功能上的分布.通過GO分析結(jié)果顯示309個(gè)差異表達(dá)蛋白富集于1 086種生物過程,282種細(xì)胞成分和377類分子功能.圖5顯示了生物過程、細(xì)胞成分和分子功能三類富集分析差異顯著性前十的條目.

圖5 染毒組差異蛋白GO富集分析結(jié)果

生物過程分析如表1所示.差異表達(dá)蛋白主要涉及翻譯、核糖體小亞基生物發(fā)生、rRNA加工、β-淀粉樣蛋白的形成、鋅離子跨膜輸入、透明質(zhì)酸代謝過程、受體活性的正向調(diào)節(jié)、維生素D受體信號(hào)通路的調(diào)節(jié)、肌肉結(jié)構(gòu)發(fā)展及核糖體小亞基組裝.

表1 差異表達(dá)蛋白的主要生物過程分析

細(xì)胞成分分析如表2所示.差異表達(dá)蛋白主要涉及細(xì)胞質(zhì)小核糖體亞基、細(xì)胞核、染色體、小核糖體亞基、外泌體、核小體、血紅蛋白復(fù)合體、小亞基加工體、U2型剪接前體及顆粒組分.

表2 差異表達(dá)蛋白的主要細(xì)胞成分分析

分子功能分析如表3所示.差異表達(dá)蛋白主要涉及poly(A)RNA結(jié)合、核糖體的結(jié)構(gòu)成分、線粒體靶向序列結(jié)合、氧運(yùn)輸活性、甘露糖結(jié)合、維生素D受體結(jié)合、維甲酸受體結(jié)合、氧氣結(jié)合、鋅離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體活性及酶激活活性.

表3 差異表達(dá)蛋白的主要分子功能分析

2.6 差異表達(dá)蛋白KEGG富集分析結(jié)果

KEGG通路分析結(jié)果顯示,本研究篩選出的309個(gè)差異表達(dá)蛋白涉及197條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,其中差異顯著(P<0.05)的通路有40條.差異顯著性排前20的通路如圖6所示,主要包括核糖體生物合成、核糖體、真核生物中的核糖體生物合成、瘧疾、剪接體、分泌系統(tǒng)、RNA運(yùn)輸、輔因子代謝、Notch信號(hào)通路、吞噬體、染色體及相關(guān)蛋白、蛋白質(zhì)外排、全身性紅斑狼瘡、生理節(jié)律、IL-17信號(hào)通路、類脂物代謝.氣泡越大的通路包含的差異蛋白數(shù)目越多,氣泡顏色與富集程度有關(guān),P值越小,顯著程度越大.

圖6 染毒組差異蛋白KEGG富集Top20氣泡圖

差異表達(dá)蛋白在KEGG通路中的分布如圖7所示.主要分布在這幾類信號(hào)通路中：蛋白家族：遺傳信息處理；蛋白家族：信號(hào)傳導(dǎo)和細(xì)胞過程;翻譯；蛋白家族：代謝;信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo).

圖7 染毒組差異蛋白KEGG分布

2.7 差異表達(dá)蛋白相互作用分析

使用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行分析,獲得差異表達(dá)蛋白的互作關(guān)系如圖8所示.關(guān)聯(lián)度最高的是G3HKG8和G3ICY6，G3HKG8是核糖體蛋白質(zhì)S3A(ribosomal protein S3A,RPS3A),G3ICY6是核糖體蛋白質(zhì)S17(ribosomal protein S17,RPS17).RPS3A和RPS17屬于核糖體蛋白家族,RPS3A位于40S核糖體亞基的外層,是核糖體與18S rRNA、mRNA、起始因子eIF-2和eIF-3、延伸因子EF-1和EF-2連接的位置,因此RPS3A在核糖體翻譯功能啟動(dòng)中起關(guān)鍵作用[15].研究發(fā)現(xiàn)RPS3A表達(dá)水平的變化,影響了核糖體翻譯功能的啟動(dòng),影響了蛋白質(zhì)的合成,蛋白質(zhì)合成作為生命活動(dòng)中的重要過程,其合成受到抑制將導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[16].RPS17蛋白也位于40S核糖體亞基,作用于翻譯起始密碼子,影響蛋白的生物合成[17].目前研究報(bào)道的鈾的毒性作用機(jī)制主要有氧化脅迫、DNA損傷、蛋白結(jié)合和功能異常、炎癥激活及凋亡和自噬[18].研究結(jié)果表明硝酸鈾酰暴露可能誘導(dǎo)CHO-K1細(xì)胞發(fā)生凋亡和蛋白功能異常.

圖8 差異蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果

3 結(jié)論

近年來TMT體外標(biāo)記技術(shù)廣泛用于差異表達(dá)蛋白質(zhì)分析研究,具有通量高、重復(fù)性好且定量準(zhǔn)確、分辨率高、數(shù)據(jù)豐富和自動(dòng)化程度高的優(yōu)點(diǎn).本研究采用TMT標(biāo)記蛋白技術(shù)對(duì)硝酸鈾酰暴露的CHO-K1細(xì)胞蛋白進(jìn)行鑒定,共鑒定獲得肽段數(shù)量23 553條,鑒定出蛋白4 772個(gè).

本研究應(yīng)用TMT標(biāo)記蛋白組學(xué)技術(shù)對(duì)硝酸鈾酰暴露致CHO-K1細(xì)胞損傷的蛋白進(jìn)行篩選,篩選出差異表達(dá)1.5倍以上的蛋白309個(gè),其中164個(gè)表達(dá)上調(diào),145個(gè)表達(dá)下調(diào).

GO分析表明差異表達(dá)的蛋白主要參與1 086種生物過程,282種細(xì)胞成分以及377類分子功能,生物過程中翻譯、β-淀粉樣蛋白的形成、鋅離子跨膜輸入、透明質(zhì)酸代謝過程、受體活性的正向調(diào)節(jié)、肌肉結(jié)構(gòu)發(fā)展和核糖體小亞基組裝表達(dá)上調(diào),核糖體小亞基生物發(fā)生、rRNA加工和維生素D受體信號(hào)通路的調(diào)節(jié)表達(dá)下調(diào)；細(xì)胞成分中細(xì)胞質(zhì)小核糖體亞基、細(xì)胞核、染色體、小核糖體亞基、外泌體、核小體、顆粒組分和血紅蛋白復(fù)合體表達(dá)上調(diào),小亞基加工體和U2型剪接前體表達(dá)下調(diào)；分子功能中poly(A)RNA結(jié)合、核糖體的結(jié)構(gòu)成分、線粒體靶向序列結(jié)合、氧運(yùn)輸活性、甘露糖結(jié)合、維甲酸受體結(jié)合、氧氣結(jié)合、鋅離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)體活性和酶激活活性表達(dá)上調(diào),維生素D受體結(jié)合表達(dá)下調(diào).

KEGG通路分析表明差異蛋白富集于40條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路.主要參與核糖體生物合成、RNA運(yùn)輸、輔因子代謝、Notch信號(hào)通路、吞噬體、染色體及相關(guān)蛋白、蛋白質(zhì)外排、生理節(jié)律、IL-17信號(hào)通路、類脂物代謝等信號(hào)通路.GO功能富集分析和KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果為進(jìn)一步探索硝酸鈾酰染毒對(duì)CHO-K1細(xì)胞損傷的影響及潛在的分子機(jī)制提供數(shù)據(jù).

對(duì)差異表達(dá)蛋白進(jìn)行互作網(wǎng)絡(luò)分析,關(guān)聯(lián)度最高的是RPS3A和RPS17.下一步RPS3A和RPS17可作為硝酸鈾酰暴露致CHO-K1細(xì)胞損傷的潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行研究.