黃金梅，鐘海藝，楊舒悅，黃鳳玲

(廣西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，廣西 南寧 530200)

0 引言

分子印跡技術(shù)(Molecular Imprinting Technique，MIT)是將具有一定功能基的功能單體與特定的模板分子結(jié)合成單體-模板分子復(fù)合物，在交聯(lián)劑、引發(fā)劑的條件下引發(fā)聚合反應(yīng)；再通過物理或者化學(xué)法除去模板分子，高分子聚合物主體上就留下了在大小、形狀以及功能排列上與模板分子相互匹配的空穴，該空穴對目標(biāo)分子有專一識別功能[1,2].近年來，由于MIT本身所具有高度分離選擇性而被應(yīng)用于手性藥物的拆分、吸附分離、酶催化等方面[3-7].目前，MIT已經(jīng)成為了世界上的很多國家、學(xué)術(shù)機構(gòu)、企事業(yè)單位的研究熱點[8].

葛根[9]是中藥豆科植物野葛Pueraria lobate(Willd.)Ohwi.或者甘葛藤(也稱粉葛)Pueraria thomsonii Benth的根.有生津止渴、通絡(luò)活經(jīng)、解肌退熱、升陽止瀉、解酒之功效[10-12].葛根素是中藥葛根中的主要成分，為異黃酮類化合物，水溶性弱，能溶于多種有機溶劑中[13].現(xiàn)代藥理研究表明，葛根素具有降低血壓、抗癌、抗炎等藥理作用[14].臨床上主要用于治療心律失常、高血壓、心絞痛等疾病，并取得了一定的療效[15].目前，對于葛根素的提取分離多采用傳統(tǒng)技術(shù)，例如溶劑提取法、加熱回流法、大孔樹脂吸附法等，雖能達(dá)到一定的提取分離效果，但存在效率低下、溶劑耗費大、有效成分提取不完全等不足.

因此，本文采用分子印跡技術(shù)制備以葛根素為模板分子的葛根素溫敏分子印跡聚合物，過程中引入溫敏單體N-異丙基丙烯酰胺，因其分子鏈上同時具有一個親水性的酰胺基和一個親酯性的異丙基，使葛根素MIPs具有低溫溶脹高溫收縮的特點，通過改變外界環(huán)境溫度即可控制模板分子的結(jié)合與釋放[16-18].本文旨在以葛根素MIPs為材料，探討其從中藥復(fù)雜成分中分離富集出目標(biāo)化合物葛根素的可行性，該研究對MIT在中藥領(lǐng)域的發(fā)展具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 主要原料

葛根素、槲皮素、木犀草素、丙烯酰胺、乙二醇二甲基丙烯酸酯、N-異丙基丙烯酰胺、偶氮二異丁腈，阿拉丁試劑(上海)有限公司；硅膠，青島海洋化工有限公司；甲醇，天津市富宇精細(xì)化工有限公司；乙酸，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；溴化鉀，天津市大茂化學(xué)試劑廠.

1.2 儀器與設(shè)備

2X15-3型恒溫加熱磁力攪拌器，上海司樂儀器有限公司；DHG-9146A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；SHB-B95型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；SQP型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；BSD-TX318型恒溫振蕩器，上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；TG16-WS型臺式高速離心機，長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機儀器有限公司；UV-1780型紫外可見分光光度計，島津儀器(蘇州)有限公司；KQ5200B型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Quanta250型電鏡掃描儀，美國FEI公司；Nicolet-iS10型紅外光譜儀，美國Thermo Fisher公司.

1.3 分子印跡聚合物的制備

表1為分子印跡聚合物的合成用料比.以MIP2為例，其制備原理如圖1所示，模板分子葛根素與功能單體丙烯酰胺(AM)、溫敏單體(NIPAM)溶于50 mL甲醇中，室溫下反應(yīng)30 min，使二者以氫鍵形式充分結(jié)合，之后加入交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)于70 ℃下充分溶解混合，通氮氣除氧15 min后加入AIBN引發(fā)劑，繼續(xù)氮氣保護下反應(yīng)5 h得到聚合物，抽濾烘干后，以體積比為9∶1的甲醇-乙酸溶液為溶劑抽提24 h，再用新鮮的甲醇洗滌三次以除去模板分子和殘遺的乙酸，干燥后即得葛根素溫敏分子印跡聚合物.非分子印跡聚合物NIP2制備方法類似，過程中不加入葛根素模板分子.

表1 聚合物的合成用料量

圖1 葛根素溫敏分子印跡聚合物制備原理

1.4 表征與測試

1.4.1 分子印跡聚合物結(jié)構(gòu)表征

采用紅外光譜(FTIR)分別對模板分子、NIP、洗脫前后MIP進行表征，溴化鉀為背景，檢測4 000～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)的紅外信號以確認(rèn)對比相應(yīng)官能團；利用掃描電鏡(SEM)對NIP、洗脫前后MIP表面形貌進行觀察，測試前樣品進行噴金處理.

1.4.2 分子印跡吸附實驗

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

移液槍準(zhǔn)確移取濃度為0.48 mg/mL的葛根素-甲醇標(biāo)準(zhǔn)母液0.30 mL于25 mL容量瓶中，甲醇稀釋，搖勻.使用紫外分光光度計，于200～400 nm之間，測量吸光度(A)，取最大吸收波長λmax205.50 nm.移液槍分別量取0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL、0.35 mL、0.40 mL、0.45 mL的0.48 mg/mL的葛根素標(biāo)準(zhǔn)溶液于7個25 mL量瓶中，甲醇定容.在所選定的λmax下，測定溶液的吸光度值，以吸光度對濃度進行回歸分析，得到葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.同理，繪制槲皮素-無水乙醇溶液和木犀草素-無水乙醇溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線.

(2)等溫吸附實驗

稱取5組MIP和NIP各20 mg于5 mL離心管中，用移液槍分別吸取4 mL濃度為0.4 mg/mL、0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL的葛根素-甲醇溶液，密封，30 ℃下于恒溫振蕩器中吸附4 h，取上清液，采用紫外可見分光光度法，測定吸附后的溶液中葛根素的濃度并做好記錄，根據(jù)吸附前后葛根素濃度的變化，使用公式(1)可以計算分子印跡聚合物的吸附量.

Q=(C0-Ceq)V/M

(1)

式(1)中：Q，分子印跡聚合物對底物的吸附量(mg/g)；C0，吸附前的底物濃度(mg/mL)；Ceq，吸附平衡時的底物濃度(mg/mL)；V，吸附液的總體積(mL)；M，分子印跡聚合物的質(zhì)量(g).

(3)不同溫度吸附

與“等溫吸附實驗”同法操作，配制適宜濃度的葛根素-甲醇吸附液，調(diào)節(jié)恒溫振蕩器中的溫度(30 ℃、40 ℃、50 ℃)，測定吸光度值，用公式(1)計算吸附量.

(4)選擇性吸附

分別配制濃度為1.0 mg/mL的葛根素-甲醇溶液、木犀草素-甲醇溶液、槲皮素-甲醇溶液作為吸附液，用紫外可見分光光度計測定吸光度后，根據(jù)工作曲線算出吸附后溶液中所含底物的濃度，以此計算出印跡聚合物對各物質(zhì)的吸附量Q、分配系數(shù)kd及對葛根素的選擇系數(shù)k.

kd=Q/C

(2)

k=kdi/kdj

(3)

式(2)、(3)中：kd，分配系數(shù)，mL/g；Q，平衡時MIP對底物分子的吸附容量，mg/g；C，吸附平衡時溶液中底物分子的質(zhì)量濃度，mg/mL；i、j，目標(biāo)分離物葛根素及其干擾物，當(dāng)i=j時，k=1.

1.4.3 分子印跡洗脫實驗

根據(jù)1.4.2節(jié)所述的操作方法，配制濃度為1.0 mg/mL的葛根素-甲醇吸附液，平行稱取多份等量(20 mg)的MIP1和MIP2，待吸附4 h達(dá)到平衡狀態(tài)后，離心，取沉淀物進行干燥；對吸附平衡的聚合物進行洗脫，以4 mL的甲醇為洗脫液，分別放入30 ℃、40 ℃、50 ℃恒溫振蕩器中，振蕩1 h后，離心，取上清液；每個樣品于每個溫度下進行三次平行洗脫實驗，通過紫外可見分光光度法測定吸光度，計算洗脫液濃度并最終求得平均洗脫率.

2 結(jié)果與討論

2.1 分子印跡聚合物結(jié)構(gòu)表征

2.1.1 紅外光譜分析

如圖2所示，葛根素和未洗脫的MIP2的紅外光譜圖對比知，未洗脫的MIP2在3 172.82 cm-1處出現(xiàn)明顯的締合峰，且峰較寬，伸縮振動區(qū)域也出現(xiàn)了葛根素和NIP2的特征峰，以此說明MIP2中的功能單體與模板分子通過氫鍵的形式結(jié)合，且葛根素的吸收峰發(fā)生了一定的紅移；此外，NIP2和洗脫后的MIP2圖譜對比可知，基團的吸收峰位置、形狀、強度基本相似，說明MIP2中的模板分子已經(jīng)被洗脫出去.

圖2 聚合物的紅外光譜圖

2.1.2 掃描電鏡(SEM)圖像分析

如圖3所示，通過掃描電鏡對NIP2、洗脫前的MIP2、洗脫后的MIP2的表面形貌進行觀察，可以看到所得聚合物材料呈現(xiàn)出不規(guī)則的顆粒狀，顆粒大小在200～800 nm之間；其中非印跡聚合物NIP2和洗脫前的印跡聚合物MIP2的表面較規(guī)整、光滑，洗脫后的MIP2顆粒形狀更加不規(guī)整，且表面粗糙度增加，空穴細(xì)度更小，說明長時間的抽提可將聚合物表面的模板分子洗脫，留下其結(jié)構(gòu)空穴，作為印跡位點.

圖3 聚合物的掃描電鏡圖

2.2 葛根素溫敏分子印跡聚合物吸附性能

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

如圖4所示，通過線性擬合得到葛根素-甲醇溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.087 132 5x-0.033 862 6，R2=0.998 9，說明在選定濃度范圍內(nèi)，葛根素濃度與吸光度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系.用相同方法測定木犀草素-乙醇溶液和槲皮素-乙醇溶液的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為y=0.123 9x-0.006 9，R2=0.999 7和y=0.130 791x-0.062 551 2，R2=0.999 6，均具有良好的線性關(guān)系.

圖4 葛根素標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.2.2 等溫吸附實驗

MIP、NIP的等溫吸附曲線結(jié)果如圖5所示，隨著葛根素-甲醇溶液濃度的升高，分子印跡聚合物對葛根素的吸附量也逐漸增大，尤其是在0.4～0.8 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，吸附量的增加速率明顯，以MIP2為例，在0.4 mg/mL的濃度下，其吸附量為14.47 mg/g，當(dāng)濃度增大到0.8 mg/mL時，吸附量變?yōu)?9.19 mg/g，增量達(dá)到一倍以上.但是，當(dāng)葛根素溶液的濃度達(dá)到一定值后，隨著濃度的繼續(xù)增大，MIP吸附量的增加速率變小，并逐漸趨于平緩，如MIP2的濃度從1.0 mg/mL增大到1.2 mg/mL時，其吸附量僅從45.51 mg/g增加到46.24 mg/g，這是因為同等質(zhì)量下，MIP的空穴數(shù)量是一定的，在吸附液濃度較低時，葛根素能夠迅速地結(jié)合到MIP的空穴上，隨著濃度的增大，一部分的葛根素首先與聚合物表面上具有一定空間結(jié)構(gòu)的空穴結(jié)合，另一部分則需要進入聚合物的內(nèi)部與深孔結(jié)合，在這過程中需要克服一定的傳質(zhì)阻力，最終導(dǎo)致吸附量的增加速率較小，尤其是當(dāng)濃度增加到1.0 mg/mL時，吸附量慢慢趨向于平衡，說明聚合物對葛根素的吸附接近飽和狀態(tài).

圖5 不同濃度下NIP與MIP的吸附量

此外，從圖5還可以看出，MIP對葛根素的吸附量總是大于NIP，說明MIP上具有與葛根素相吻合的空間結(jié)合位點，對葛根素有高度親和力和特異性識別能力，而NIP上由于沒有葛根素的特異性結(jié)合位點，故不會對葛根素有特異性吸附，只是簡單地與聚合物表面的一些隨機產(chǎn)生的空穴發(fā)生非特異性結(jié)合，所以對葛根素吸附量總是會低于MIP.

為了進一步探究MIP與葛根素的結(jié)合特征，我們采用經(jīng)典的采用經(jīng)典的Langmuir和Freundlich模型對等溫吸附數(shù)據(jù)進行處理.Langmuir 模型方程表達(dá)式為：

(4)

Freundlich 模型方程表達(dá)式為:

(5)

式(4)、(5)中：Qm，一定溫度下聚合物的飽和吸附量，mg/g；k1，Langmuir 常數(shù)，mL/mg；kf、n，經(jīng)驗常數(shù)；Ce，葛根素的平衡濃度，mg/mL；Qe，平衡吸附量，mg/g.

擬合數(shù)據(jù)如表2所示，Langmuir等溫吸附模型中，線性關(guān)系較為理想，表明葛根素分子印跡聚合物基本以表面單層分子吸附方式為主.葛根素MIP1和MIP2的等溫吸附過程與Freundlich等溫吸附模型也較為相符，擬合曲線對應(yīng)的1/n值遠(yuǎn)小于200，一般認(rèn)為，1/n反映吸附過程的難易程度，當(dāng)1/n>200則是難以吸附過程，由此可見，所得分子印跡聚合物對葛根素的吸附非常容易，且隨著底物濃度增加平衡吸附容量(Qe)變化較小.

表2 Langmuir和Freundlich等溫吸附模型參數(shù)

2.2.3 溫度對吸附性能的影響

溫度對分子印跡聚合物吸附性能的影響如圖6所示，在30 ℃條件下，MIPs對葛根素的吸附量最高，隨著溫度的不斷升高，吸附量逐漸下降，其中加了溫敏單體NIPAM的MIP2和NIP2變化更為明顯，表現(xiàn)出更強的溫度響應(yīng)性.以葛根素溫敏分子印跡聚合物MIP2為例，當(dāng)溫度從30 ℃升高到50 ℃時，其吸附量從45.51 mg/g下降到27.30 mg/g，下降率達(dá)到40%.這是因為，在不同溫度下，溫敏單體NIPAM的親疏水作用不同，溫度升高時，NIPAM與溶劑結(jié)合的氫鍵會發(fā)生斷裂，原印跡空穴中的溶劑被釋放，導(dǎo)致空穴收縮，葛根素?zé)o法進入空穴，進而使吸附量降低.此外，同一溫度下，MIP的吸附量總是大于對應(yīng)的NIP，進一步表明MIP上存在著與葛根素類似的空間結(jié)合位點，能對葛根素產(chǎn)生特異吸附.

圖6 不同溫度下NIP和MIP的吸附量

2.2.4 選擇性吸附性能

為了進一步突出MIP高度分離選擇性的特點，本實驗選取了葛根素結(jié)構(gòu)相類似的化合物木犀草素和槲皮素作為吸附底物，其結(jié)構(gòu)式如圖7所示，在其他條件相同的情況下，對它們進行靜態(tài)吸附實驗，考察MIP對葛根素的專一識別能力.

圖7 化合物的結(jié)構(gòu)圖

從圖8所示的選擇性吸附測試結(jié)果可知，在30 ℃下，MIP2對葛根素的吸附量為45.51 mg/g，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于對木犀草素(20.29 mg/g)和槲皮素(8.10 mg/g)的吸附量，MIP1對三種化合物的選擇性也與MIP2相似.表3列出了MIP對不同底物的分配系數(shù)及選擇性系數(shù)，通常情況下，kd越高，表示聚合物對該底物的結(jié)合量越大，k越大，表示該聚合物對底物的選擇性越好.葛根素的分配系數(shù)遠(yuǎn)高于槲皮素和木犀草素，同時相比于槲皮素和木犀草素，MIP1對葛根素的選擇性系數(shù)可分別達(dá)到4.19和2.63，MIP2的為6.87和2.62，由此說明MIP對葛根素具有良好的吸附能力和選擇識別能力.

圖8 MIP1和MIP2對葛根素(Puerarin)、木犀草素(Luteolin)、槲皮素(Quercetin)的吸附量

表3 選擇性吸附實驗結(jié)果

2.3 葛根素溫敏分子印跡聚合物洗脫性能

如圖9所示，吸附飽和的MIP1和MIP2洗脫率均隨著溫度的升高而增大，但MIP2的增幅明顯大于MIP1，50 ℃時，MIP2洗脫1 h后的平均釋放量為38.35 mg/g，平均洗脫效率為84.3%，遠(yuǎn)高于MIP1的53%，這是由于MIP2中具有溫敏單體NIPAM，其在溫度刺激下與模板分子及溶液之間的氫鍵作用變化更為明顯，在高溫時，AM、NIPAM與葛根素之間的氫鍵更容易發(fā)生斷裂，導(dǎo)致印跡空穴發(fā)生膨脹，進而利于葛根素的釋放.

圖9 不同溫度下MIP1和MIP2的洗脫率

3 結(jié)論

(1)以葛根素為模板分子、丙烯酰胺為功能單體、N-異丙基丙烯酰胺為溫敏單體，成功合成了葛根素溫敏分子印跡聚合物.該印跡聚合物表面粗糙、粒徑大小均勻、質(zhì)地疏松，提高了葛根素的結(jié)合率.

(2)MIP2表現(xiàn)出對葛根素較高的特異性吸附能力，當(dāng)吸附液濃度為1 mg/mL時，其吸附量可達(dá)45.51 mg/g；通過擬合，分子印跡聚合物對葛根素的吸附過程符合Langmuir和Freundlich模型；且溫敏單體的加入使得印跡聚合物具備溫度響應(yīng)行為，呈現(xiàn)出低溫利于吸附、高溫利于洗脫的特點.

綜上所述，本文提出和建立了葛根素溫敏分子印跡聚合物的制備方法，為中藥成分葛根素的提取分離提供了一種新型材料，同時也為分子印跡技術(shù)在中藥活性成分提取分離中的應(yīng)用提供參考.