薛劍超，王亞東，李博文，劉新宇，梁乃新*，李單青

1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 胸外科，北京 100730；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)八年制 2016級， 北京 100730

隨著全世界的人口增長和老齡化，肺癌(lung cancer)的發(fā)病率和病死率在全球范圍內(nèi)快速增長。2020年報道全球范圍內(nèi)新發(fā)肺癌病例約220萬例，死亡病例達(dá)180萬，占總惡性腫瘤診斷病例的11.4%和其總死亡的18.0%[1]。國家癌癥中心最新公布的數(shù)據(jù)顯示，2016年中國新發(fā)肺癌病例82.8萬，病死病例65.7萬，是中國人群發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤[2]。ⅠA～ⅢA期非小細(xì)胞肺癌患者即使接受根治性手術(shù)切除，仍有很高的復(fù)發(fā)和死亡風(fēng)險，5年生存率從ⅠA1期90%驟降至ⅢA期41%。即使TNM同分期的患者之間，5年生存率也存在很大差異，現(xiàn)有的分期系統(tǒng)不足以預(yù)測個體患者的治療結(jié)果和預(yù)后。因此，尋找能夠?qū)Ψ伟┗颊哌M(jìn)行復(fù)發(fā)風(fēng)險評估的預(yù)后標(biāo)志物，對不同風(fēng)險的患者采取個性化治療，將有助于提高肺癌患者的生存率。在過去的20年中，越來越多的DNA甲基化改變在肺癌中被報道。

DNA甲基化在肺癌的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要的角色，其性質(zhì)穩(wěn)定且易于檢測，在肺癌的預(yù)后預(yù)測中有巨大潛力。本文就DNA甲基化在肺癌發(fā)生及預(yù)后方面的相關(guān)進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)。

1 DNA甲基化機(jī)制概述

DNA甲基化是人類認(rèn)識最早、研究最多的表觀遺傳學(xué)改變，是指由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine，SAM)作為甲基供體，與CpG二核苷酸中5′端胞嘧啶以共價鍵結(jié)合。經(jīng)甲基化修飾后5′端胞嘧啶在離體狀態(tài)表現(xiàn)出更強(qiáng)的惰性；在活體狀態(tài)則表現(xiàn)為基因表達(dá)活性降低。DNMTs主要分為兩個家族，DNMT1家族在DNA復(fù)制和修復(fù)中維持其甲基化；而DNMT3家族則催化CpG從頭甲基化(denovomethylation)[3-4]。

2 DNA異常甲基化與肺癌的發(fā)生

肺癌的發(fā)生是一系列的基因組和表觀遺傳組改變的累積，如抑癌基因的沉默、原癌基因的激活和管家基因的功能異常。表觀遺傳組改變通常表現(xiàn)為全基因組的DNA低甲基化和特定基因的DNA高甲基化。一般情況下，原癌基因處于抑制狀態(tài)，DNA低甲基化可促使這些原癌基因及其轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生活化，導(dǎo)致基因組的不穩(wěn)定性和染色體的結(jié)構(gòu)改變，同時基因組中正常沉默區(qū)域的轉(zhuǎn)錄激活可能導(dǎo)致插入的病毒基因和正常沉默基因(如印記基因和不活躍的X染色體上的基因)的表達(dá)，最后導(dǎo)致肺癌的發(fā)生。同時，抑癌基因的啟動子區(qū)域會出現(xiàn)異常的高甲基化，導(dǎo)致這部分抑癌基因沉默，使肺癌發(fā)生的概率大大增加。

從正常肺組織到原位癌和侵襲性肺癌的過程中，涉及多種基因啟動子甲基化的頻率和水平增加，如p16、DAPK、MGMT和RASSF1A等。基因p16負(fù)責(zé)編碼p16INK4a和p14arf，p16INK4a是一種細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑，在G1/S期細(xì)胞周期停滯中起關(guān)鍵作用。RASSF1A是一個重要的抑癌基因，通過Ras信號通路參與腫瘤的發(fā)生。RASSF1A啟動子的高甲基化通過HOXB3介導(dǎo)DNMT3b表達(dá)，導(dǎo)致RASSF1A基因沉默。Wnt通路相關(guān)拮抗基因APC、Dkk1、DKK3、LKB1、WIF1、RUNX3

表1 常見基因的DNA甲基化及其在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用

NSCLC.非小細(xì)胞肺癌； SCLC.小細(xì)胞肺癌.和SFRP1/2/4/5通過DNA高甲基化被沉默，從而促進(jìn)Wnt信號通路的功能，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，APC甲基化發(fā)生率在非小細(xì)胞肺癌中高達(dá)94%，而在正常組織對照組中為20%。TGFBR2是上皮細(xì)胞增殖的主要抑制因子，它的異常甲基化與非小細(xì)胞肺癌中TGFBR2在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)下調(diào)有關(guān)。啟動子高甲基化是FHIT表達(dá)缺失的主要機(jī)制，在癌前病變中即可檢測到，F(xiàn)HIT缺失促進(jìn)肺癌細(xì)胞獲得過度增殖、抗凋亡、侵襲性和上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)等表型[5-6]。

肺癌相關(guān)基因調(diào)控區(qū)域的低甲基化可導(dǎo)致其轉(zhuǎn)錄活性增加，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生[7]。70%-85%的非小細(xì)胞肺癌中發(fā)現(xiàn)MAGE的異常激活，這一現(xiàn)象與低甲基化有關(guān),MAGE的過表達(dá)與肺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)，是預(yù)后不良的危險因素。編碼γ-突觸核蛋白的SNCG的低甲基化與肺癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移相關(guān)。在 NSCLC 中GPC5的低甲基化程度比正常肺組織明顯增高，導(dǎo)致表達(dá)激活，促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖遷移，與不良的預(yù)后相關(guān)[6]。

在肺癌的發(fā)生過程中，低甲基化和高甲基化途徑之間存在相互作用。DNA低甲基化可能是正常細(xì)胞的一種表觀遺傳修復(fù)，試圖代償與腫瘤抑制基因或靶基因啟動子的CpG島的異常甲基化。但是相較于傳統(tǒng)的DNA修復(fù)途徑，這種表觀遺傳修復(fù)途徑并不精準(zhǔn)有效，可能除修復(fù)異常甲基化的CpG島外，還會對更多的DNA序列進(jìn)行去甲基化。DNA低甲基化發(fā)生在肺癌的早期，隨后導(dǎo)致高甲基化的發(fā)生，這可能是基因組低甲基化導(dǎo)致的一種代償性的高甲基化[8-9]。

3 DNA甲基化在肺癌預(yù)后方面的應(yīng)用

3.1 現(xiàn)有的肺癌預(yù)后預(yù)測指標(biāo)

目前臨床主要根據(jù)肺癌的病理亞型、淋巴結(jié)侵犯和轉(zhuǎn)移等來粗略判斷患者的預(yù)后，但因缺乏特異性，即使是相同分期的患者預(yù)后差異也較大，預(yù)測效力差。其他方式如PET/CT的標(biāo)準(zhǔn)攝取值(standard uptake value,SUV)等也被證明是肺癌預(yù)后的獨立風(fēng)險因素，但其價格高昂、對患者有輻射損傷，無法多次、長期預(yù)測。分子標(biāo)志物可以提供病理分期之外的預(yù)后預(yù)測信息，已有許多研究對非小細(xì)胞肺癌預(yù)后預(yù)測因子進(jìn)行探索：1)DNA層面：已有數(shù)種基于多基因組合的預(yù)測標(biāo)志物，可以區(qū)分不同肺癌患者組的復(fù)發(fā)風(fēng)險。血液中循環(huán)腫瘤細(xì)胞DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)的檢出與復(fù)發(fā)相關(guān)。2)RNA層面：MicroRNA(miRNA)通過靶向作用于癌基因或腫瘤抑制基因，參與調(diào)節(jié)腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移過程，miRNA多個位點改變與患者術(shù)后復(fù)發(fā)及總生存率相關(guān)。3)蛋白質(zhì)層面：CHRNA蛋白陽性表達(dá)與患者更短的中位無復(fù)發(fā)生存期(recurrence-free survival, RFS)和總生存期(overall survival, OS)相關(guān)。神經(jīng)加壓素受體符合物具有促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖和遷移的能力，與更差的預(yù)后相關(guān)。盡管有大量涉及NSCLC預(yù)后預(yù)測因子的研究，但其預(yù)測價值和臨床轉(zhuǎn)化潛力仍存在較大爭議，真正走向應(yīng)用仍需更全面的驗證。

3.2 DNA甲基化在肺癌預(yù)后方面的研究進(jìn)展

DNA甲基化穩(wěn)定且易于在組織或體液中檢測，并且隨著高通量的表觀遺傳學(xué)篩選及檢測技術(shù)的發(fā)展，DNA甲基化改變作為肺癌預(yù)后的分子標(biāo)志物有著巨大的潛力。既往多項研究發(fā)現(xiàn)肺癌組織中許多抑癌基因的異常甲基化與較差的預(yù)后有關(guān)：在對163例受試者(包括30例Ⅰ期，29期Ⅱ期，26期Ⅲ期和68例Ⅳ期肺癌患者)血漿中異常甲基化的SHOX2水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)肺癌大小與血漿mSHOX2水平之間存在線性關(guān)系。根據(jù)治療反應(yīng)將患者分為部分緩解(partial response, PR)組和疾病穩(wěn)定(stable disease, SD)組后，發(fā)現(xiàn)mSHOX2水平的變化是治療是否有效的敏感標(biāo)志物。通過對31位患者進(jìn)行871 d的隨訪后，發(fā)現(xiàn)治療前mSHOX2水平低的患者比治療前mSHOX2高的患者具有更好的生存率水平，表明治療前血漿mSHOX2水平是患者長期生存的預(yù)測因素[10]。轉(zhuǎn)化生長因子β誘導(dǎo)蛋白(TGFB1)是一種分泌的細(xì)胞外基質(zhì)成分，在腫瘤生長和轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用。通過檢測138例NSCLC患者的腫瘤組織中轉(zhuǎn)化生長因-β-誘導(dǎo)蛋白(TGFBI)基因啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的TGFBI甲基化頻率高于無轉(zhuǎn)移患者，其發(fā)生率具有臨床意義，同時在肺腺癌患者中，TGFBI甲基化與較差的OS顯著相關(guān)[11]。在Ⅰ期肺癌患者中，跨膜蛋白酶絲氨酸4(TMPRSS4)基因啟動子低甲基化引起的蛋白高表達(dá)，與更差的預(yù)后顯著相關(guān)[12]。TMPRSS4在實體瘤中(包括肺癌)被高度上調(diào)，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。TMPRSS4是NSCLC的獨立預(yù)后標(biāo)志物，尤其是在非常早期的階段就可以顯著區(qū)分高復(fù)發(fā)風(fēng)險的患者。研究者們發(fā)現(xiàn)，在107例非小細(xì)胞肺癌患者中，與正常組織配對的肺癌組織相比，肺癌組織中FBP1啟動子的甲基化率顯著較高，同時高分化的腫瘤的FBP1甲基化水平在統(tǒng)計學(xué)上顯著較低；肺癌組織中FBP1的甲基化程度較低與肺癌患者的總體生存期有關(guān)，F(xiàn)BP1啟動子的甲基化水平有可能作為新的預(yù)后指標(biāo)[13]；在一項對155例肺癌患者和50例非腫瘤患者的研究中，發(fā)現(xiàn)TMEM196高甲基化患者的生存率明顯低于肺癌基因組圖譜中低水平患者，多變量模型顯示TMEM196甲基化是肺癌的獨立預(yù)后指標(biāo)[14]；在對142例接受免疫治療的患者的回顧性研究中，發(fā)現(xiàn)FOXP1基因的甲基化狀態(tài)與患者是否能通過PD-1抑制劑治療得到臨床獲益相關(guān)，F(xiàn)OXP1基因甲基化有巨大的預(yù)后預(yù)測價值，但仍需要通過前瞻性的研究來確定[15]；通過對13項研究共1 056例患者進(jìn)行的Meta分析顯示，肺癌組織的hMLH1甲基化率與正常肺組織相比明顯較高。晚期階段的hMLH1基因甲基化水平較高，具有hMLH1基因甲基化的NSCLC患者預(yù)后較差[16]。

隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究通過組合不同位點基因的甲基化，提高DNA甲基化預(yù)測肺癌預(yù)后的效能。使用高通量450 k芯片DNA甲基化分析，檢測了444例非小細(xì)胞肺癌患者組織及25例癌旁組織的甲基化水平，發(fā)現(xiàn)5個基因(包括HIST1H4F、NPBWR1、PCDHGB6、ALX1和HOXA9)的高甲基化與Ⅰ期非小細(xì)胞肺癌無復(fù)發(fā)生存期縮短顯著相關(guān)，因此完善了預(yù)后評估[17]。在對51例接受根治性切除但在40個月內(nèi)復(fù)發(fā)的Ⅰ期NSCLC患者與116例接受根治性切除且40個月內(nèi)無復(fù)發(fā)的患者進(jìn)行差異性分析，發(fā)現(xiàn)Ⅰ期NSCLC患者中4個基因(p16、CDH13、APC和RASSF1A)啟動子區(qū)甲基化與早期復(fù)發(fā)相關(guān)[18]。

此外，有多項研究基于對公共腫瘤數(shù)據(jù)庫的挖掘分析，篩選出不同的甲基化位點組合，進(jìn)一步完善肺癌患者的預(yù)后預(yù)測。以TCGA數(shù)據(jù)庫中370份肺鱗癌和42份健康DNA為樣本，發(fā)現(xiàn)低甲基化和高表達(dá)水平為特征的PMPCAP1和SOWAHC與肺鱗癌患者的預(yù)后不良有關(guān)，而以高甲基化和低表達(dá)水平為特征的ZNF454與較好的預(yù)后相關(guān)[19]?；趯?75例肺腺癌組織及32例癌旁組織進(jìn)行的差異甲基化分析，構(gòu)建的以CCDC181、PLAU、S1PR1、ELF3和KLHDC9的5個基因甲基化水平的風(fēng)向預(yù)測模型，可將患者分為高風(fēng)險組和低風(fēng)險組[20]。通過GEO數(shù)據(jù)庫分析特發(fā)性纖維化與肺癌的差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)高補體蛋白C1q基因是特發(fā)性纖維化與肺癌的共驅(qū)基因，C1q的低甲基化水平與肺癌患者的不良預(yù)后相關(guān)[21]。使用LASSO Cox回歸模型對TCGA數(shù)據(jù)庫中446例非小細(xì)胞肺癌患者進(jìn)行分析，篩選出16個CpG位點與患者預(yù)后顯著相關(guān)，該模型的ROC>0.7,預(yù)測效力較強(qiáng)[22]。在TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫中，采用機(jī)器學(xué)習(xí)算法篩選出4個預(yù)測復(fù)發(fā)風(fēng)險的甲基化位點(cg0.0253681/ART4、cg0.0111503/KCNK9、cg0.27156.29/FAM83A、cg0.3282991/C6orf10)，構(gòu)建預(yù)測NSCLC患者無復(fù)發(fā)生存和預(yù)后的風(fēng)險評分模型，并進(jìn)一步探討DNA甲基化與免疫治療相關(guān)反應(yīng)性的關(guān)系[23]。

4 問題與展望

近20多年來，表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域的研究蓬勃發(fā)展。表觀遺傳改變在肺癌發(fā)生和發(fā)展中的作用的了解已經(jīng)逐步加深。盡管有許多學(xué)者投入研究并發(fā)表了約14 000篇論文，但最后具有臨床轉(zhuǎn)化價值的生物標(biāo)志物卻寥寥無幾[24]。迄今仍有許多問題亟待解決：如DNA甲基化的檢測方法眾多，但均存在局限性，難以在臨床工作中普及；絕大多數(shù)研究均為回顧性分析，發(fā)現(xiàn)的甲基化位點尚缺乏前瞻性的臨床驗證。但是，隨著高通量技術(shù)的高速發(fā)展，越來越多的組織DNA甲基化標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)且應(yīng)用于肺癌患者的預(yù)后預(yù)測之中。同時，隨著液體活檢技術(shù)的興起，無創(chuàng)性監(jiān)測肺癌患者DNA甲基化標(biāo)志物的動態(tài)變化成為可能。DNA甲基化有望在將來成為NSCLC預(yù)后預(yù)測的有效工具。