冷海娜，張 艷，王曉棟，張學友，李洪利

1.濰坊市婦幼保健院 婦科，山東 濰坊 261000；濰坊醫(yī)學院 2.生命科學與技術學院； 3.基礎醫(yī)學院，山東 濰坊 261000

卵巢癌(ovarian cancer)是發(fā)生于卵巢或輸卵管的上皮細胞癌，是女性第七大常見癌和第八大常見癌死亡原因，5年生存率低于45%[1]。每年卵巢癌確診的病例數(shù)量仍不斷增加，因此探索卵巢癌發(fā)生發(fā)展的過程，尋找相關的分子靶標尤為重要。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一類長度約為20個核苷酸的小分子RNA，已有報道證實miRNA可通過調(diào)節(jié)靶基因或者受其他非編碼RNA調(diào)控發(fā)揮作用[2]。本研究選擇的miR-767-5p已被證能影響膠質(zhì)瘤、肝癌和胃癌等腫瘤進展[3]，但在卵巢癌中的研究尚未見報道。

轉(zhuǎn)導素β1X連鎖受體蛋白1(transducin beta-like 1 X-linked receptor,TBL1XR1)與轉(zhuǎn)導素β1(TBL1)家族蛋白具有高度同源性[4]。TBL1XR1在細胞增殖、凋亡、炎性反應和轉(zhuǎn)錄激活中發(fā)揮重要作用，目前相關的研究主要集中在TBL1XR1在癌進展中的作用及機制[5]。例如TBL1XR1可通過PI3K/AKT途徑誘導胰腺導管腺癌細胞增殖并抑制細胞凋亡[6]；TBL1XR1經(jīng)miR-186-5p負調(diào)控從而促進骨肉瘤細胞的遷移和侵襲[7]。

綜上所述，miR-767-5p與TBL1XR1在卵巢癌進展中可能發(fā)揮重要功能，但其作用機制尚不明確，亟待進一步探究和闡明。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：人卵巢癌細胞系OC3、SKOV-3、HO-8910、人正常卵巢上皮細胞系IOSE80，實驗所用細胞購自ATCC(American type culture collection)，細胞均已通過細胞檢測。

1.1.2 試劑：β-actin、TBL1XR1抗體(Abcam公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒及SYBR Green real-time PCR Master Mix(杭州博日科技股份有限公司)；實驗所用質(zhì)粒(上海吉凱基因醫(yī)學科技股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 收集數(shù)據(jù)庫中miR-767-5p及TBL1XR1相關數(shù)據(jù)進行分組處理及進一步分析：GEO(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)； miRPATH(http://snf-515788.vm.okeanos.grnet.gr/)；miRDB(http://www.mirdb.org/)；TargetScan(http://www.targetscan. org/)；miRTarBase(http://mirtarbase.mbc.nctu. edu.tw/)；miRWalk(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)；Open Target Platform(https://www.targe-tvalidation.org/)；THPA(https://www. proteinatlas. org/)；GEPIA(http://gepia.cancer-pku. cn/)；microT-CD(http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php?r=microT_CDS/index)。

1.2.2 細胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：將OC3、SKOV-3、HO-8910細胞、IOSE80細胞，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。瞬時轉(zhuǎn)染實驗依照Lipofectamine 2000說明書操作。轉(zhuǎn)染細胞分組如下: 1)SKOV-3(未處理)；2)SKOV-3/Ctrl(轉(zhuǎn)入miR-767-5p過表達對照質(zhì)粒)；3)SKOV-3/miR-767(轉(zhuǎn)入miR-767-5p過表達質(zhì)粒)；4)SKOV-3/TBL1XR1(轉(zhuǎn)入TBL1XR1過表達質(zhì)粒)；5)SKOV-3/miR-767+TBL1XR1(轉(zhuǎn)入miR-767-5p過表達和TBL1XR1過表達質(zhì)粒)。

1.2.3 RT-qPCR檢測質(zhì)粒轉(zhuǎn)染是否成功：Trizol法提取各組細胞總RNA，以2 μg RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA后，采用熒光定量PCR試劑盒(SYBR Green I染料，U6為內(nèi)參)進行RT-qPCR，結(jié)果分析采用2-△△Ct。miR-767-5p上游引物：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAG TTGAGCATGCTCAG-3′，下游引物：5′-ACACTCCAG CTGGGTGCACCATGGTTGTCTGAG-3′；U6上游引物5′-TCCGATCGTGAAGCGTTC-3′，下游引物5′-GTGC AGGGTCCGAGGT-3′。

1.2.4 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞C靶向關系：將TBL1XR1的 PCR產(chǎn)物克隆到pGL3載體中，構建pGL3-TBL1XR1-3-UTR-MUT和pGL3-TBL1XR1-3-UTR-WT質(zhì)粒，將SKOV-3細胞培養(yǎng)于24孔板中。100 ng的pGL3-TBL1XR1-3-UTR-MUT 和 pGL3-TBL1XR1-3-UTR-WT用Lipofectamine 2000將miRNA對照及過表達載體分別共轉(zhuǎn)染SKOV-3細胞。48 h后獲得細胞，雙熒光素酶檢測系統(tǒng)測定熒光素酶活性。

1.2.5 Western blot檢測相關蛋白質(zhì)的表達：將各組細胞提取總蛋白質(zhì)，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、4 ℃過夜、次日二抗孵育、X膠片曝光，最后使用Image J軟件進行灰度值分析。抗體濃度:β-actin(1∶1 000)；TBL1XR1(1∶1 000)。每組實驗均重復3次。

1.2.6 Transwell 小室法檢測細胞侵襲能力：實驗方法見參考文獻[8]，實驗完成后將小室置高倍鏡(400×)下觀察，隨機選取5個高倍鏡視野，分別計數(shù)穿過基質(zhì)膠的細胞數(shù)，實驗重復3次，取均數(shù)作為實驗結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 卵巢癌相關數(shù)據(jù)集的篩選及分析

GSE65819中microRNA(normal vs primary tumor)的總體表達情況和良好的區(qū)分度(圖1A)；選擇低表達的miR-767-5p作為研究對象(圖1B)發(fā)現(xiàn)miR-767-5p可靶向調(diào)節(jié)的基因在多種基因表達調(diào)節(jié)和癌相關通路中發(fā)揮作用(圖1C)；相較于正常卵巢上皮細胞系(IOSE80)，miR-767-5p在卵巢癌細胞系(OC3、SKOV-3、HO-8910)中表達顯著降低(圖1D，E)。

A，B.microRNA in GSE65819 was analyzed and miR-767-5p was selected；C.miR-767-5p targeted regulation of genes was associated with the development of a variety of cancers；D.miR-767-5p expression was significantly decreased in ovarian cancer cell lines (OC3, SKOV-3, HO-8910); *P<0.05 compared with IOSE80

2.2 靶蛋白的預測、篩選以及表達情況

預測miR-767-5p可結(jié)合的靶基因，并取交集，最后得到14個靶基因(圖2A)；TBL1XR1與多種女性疾病有密切聯(lián)系，尤其是乳腺癌和卵巢癌(圖2B)；除此之外，TBL1XR1在卵巢癌中呈現(xiàn)明顯的高表達(圖2C)。

A.target genes that could bind to miR-767-5p were predicted；B.TBL1XR1 was strongly linked to breast and ovarian cancer；C.TBL1XR1 was highly expressed in ovarian cancer

2.3 TBL1XR1在卵巢癌中高表達

TBL1XR1高表達與預后不良有關(P<0.05)(圖3A)；同時，TBL1XR1在卵巢癌組織中呈現(xiàn)高表達(圖3B)；相較于正常卵巢上皮細胞，TBL1XR1在卵巢癌細胞系中高表達(圖3C，D)。

A.high expression of TBL1XR1 was associated with poor prognosis；B.TBL1XR1 was highly expressed in ovarian cancer tissues；C，D.Western blot showed that TBL1XR1 was highly expressed in ovarian cancer cell lines; *P<0.05 compared with IOSE80

2.4 miR-767-5p與TBL1XR1靶向結(jié)合

雙熒光素酶實驗結(jié)果表明，TBL1XR1 mRNA 的 3′-UTR 是 miR-767-5p 的直接結(jié)合位點(P<0.05)(圖4)。

*P<0.05 compared with TBL1XR1-WT

2.5 miR-767-5p通過調(diào)節(jié)TBL1XR1抑制卵巢癌細胞侵襲

過表達TBL1XR1后，TBL1XR1表達量顯著提高；而同時過表達miR-767-5p后可在一定程度上減弱這種促表達作用(圖5A，B)。相較于對照組，過表達miR-767-5p后細胞侵襲能力明顯降低，而共轉(zhuǎn)染miR-767-5p和TBL1XR1過表達質(zhì)粒后，可在一定程度上減弱過表達miR-767-5p后對卵巢癌細胞侵襲能力的抑制(P<0.05)(圖5C，D)。

A，B.Western blot was used to detect TBL1XR1 expression after over-expression of miR-767-5p； *P<0.05 compared with Ctrl.C，D.invasiveness of miR-767-5p and TBL1XR1 cells after over-expression was detected by Transwell cell assay； *P<0.05 compared with SKOV-3/Ctrl

3 討論

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤。卵巢癌的臨床治療方法主要包括手術和化療，但化療后常出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象，限制了臨床治療效果，且復發(fā)率較高。因此，研究卵巢癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制，尋找卵巢癌相關的分子標志物，對于卵巢癌的診斷和治療具有重要意義。

有研究證明miRNA能夠抑制或促進卵巢癌進展，例如miR-636[9]和miR-141[10]等?，F(xiàn)已有研究指出，miR-767-5p可經(jīng)lncRNA、circRNA靶向調(diào)節(jié)從而影響下游靶基因的表達，以此發(fā)揮功能。例如miR-767-5p可通過SOCS2/JAK/STAT信號通路促進乳腺癌進展[11]；miR-767-5p具有抑制胃癌進展的作用，且受多種circRNA的調(diào)控[12]。此外，miR-767-5p也可通過調(diào)節(jié)下游靶基因的形式來影響腫瘤進展[13]。以上報道充分說明miR-767-5p較為廣泛地參與了多種類型腫瘤的進展，并且發(fā)揮功能的途徑具有多樣性。

綜合前言部分有關TBL1XR1的介紹，在篩選差異表達microRNA以及后期靶基因預測時，選擇研究miR-767-5p/TBL1XR1調(diào)節(jié)軸在卵巢癌中的作用。本研究首先對GEO數(shù)據(jù)集進行篩選，選擇GSE65819數(shù)據(jù)集對卵巢癌中的差異表達microRNA進行分析，最終選擇差異表達倍數(shù)較高且在卵巢癌中低表達的miR-767-5p，RT-qPCR實驗驗證了miR-767-5p在卵巢癌細胞中呈現(xiàn)低表達。miR-767-5p進行KEGG分析顯示miR-767-5p的靶基因參與了多種腫瘤相關的信號通路。miRDB、GEPIA數(shù)據(jù)庫分析選擇與多項女性生殖系統(tǒng)疾病相關且在卵巢癌中高表達的TBL1XR1進行后續(xù)研究。多種數(shù)據(jù)庫都說明TBL1XR1在卵巢癌中很可能扮演著癌基因的角色。

但miR-767-5p和TBL1XR1在卵巢癌中具體作用機制仍不明確。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實miR-767-5p和TBL1XR1的靶向結(jié)合。過表達miR-767-5p后可在一定程度上減弱過表達TBL1XR1的促進作用；Transwell小室法結(jié)果同樣印證了這一點，相較于對照組，過表達miR-767-5p后細胞侵襲能力明顯降低，而共轉(zhuǎn)染miR-767-5p和TBL1XR1過表達質(zhì)粒后，可在一定程度上逆轉(zhuǎn)過表達miR-767-5p造成的影響。

綜上，miR-767-5p能靶向調(diào)節(jié)TBL1XR1的表達抑制卵巢癌的進展。本研究結(jié)果可為卵巢癌的早期診斷以及臨床治療提供理論依據(jù)，TBL1XR1作為一種卵巢癌進展的標志物和靶向治療位點。