汪 博，張明煥

武漢市第三醫(yī)院 武漢大學附屬同仁醫(yī)院 1.麻醉科；2.骨科，湖北 武漢 430071

骨關節(jié)炎(osteoarthritis)是最常見的與年齡相關的慢性和致殘性關節(jié)疾病[1]。然而，骨關節(jié)炎的確切發(fā)病機制尚未闡明。軟骨細胞是正常軟骨的唯一細胞成分，軟骨細胞損傷與骨關節(jié)炎進展相關，包括軟骨細胞凋亡、炎性損傷和氧化應激[2]。最近的研究表明，骨關節(jié)炎的發(fā)病機制與非編碼RNA相關[3]circRNA可以像海綿一樣與miRNA結(jié)合，干擾它們的表達，從而干擾下游的mRNA或蛋白質(zhì)[4]。類風濕性關節(jié)炎患者外周血中的CIRC_0044235顯著降低，可能通過與miR-892a相互作用而在類風濕性關節(jié)炎中發(fā)揮作用[5]。miR-574-5p是一種在骨關節(jié)炎軟骨細胞中高表達的miRNA[6]。但CIRC_0044235對骨關節(jié)炎的影響及其機制是否涉及miR-574-5p仍不清楚?；诖?，本研究使用白細胞介素(interleukin，IL)-1β誘導軟骨細胞建立骨關節(jié)炎的體外模型，分析軟骨細胞中CIRC_0044235與miR-574-5p的調(diào)控網(wǎng)絡。

1 材料與方法

1.1 材料

人關節(jié)軟骨細胞(上海中喬新舟生物科技有限公司);Trizol(Thermo Fisher Scientific公司)；PrimeScript RT、SYBR Premix Ex Ta Ⅱ試劑盒(TaKaRa Bio公司)；miR-574-5p模擬物、模擬物對照miR-NC、pcDNA、pcDNA-CIRC_0044235、miR-574-5p抑制物anti-miR-574-5p和抑制物對照anti-miR-NC(Gene Pharma公司)；超氧化物歧化酶(super-oxide orgotein dismutase，SOD)檢測試劑盒、乳酸脫氫酶(lactate dehydrofenase，LDH)檢測試劑盒、IL-6酶聯(lián)免疫吸附測定法(enzyme-linked immunosor-bent assay，ELISA)試劑盒、IL-10 ELISA試劑盒、RIPA裂解緩沖液、BCA試劑盒和膜聯(lián)蛋白V(annexin V)-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；ECL化學發(fā)光溶液(北京Solarbio公司)；抗B細胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)抗體和Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)抗體(Abcam公司)；pmirGLO載體和熒光素酶檢測試劑盒(Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養(yǎng)與處理：軟骨細胞在含10%胎牛血清+1%雙抗的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，并維持在37 ℃和5% CO2環(huán)境中增殖。將軟骨細胞分為對照組、IL-1β組(10 μg/L的IL-1β處理軟骨細胞2 h[7])、分別轉(zhuǎn)染pcDNA、pcDNA-CIRC_0044235、anti-miR-NC、anti-miR-574-5p、pcDNA-CIRC_0044235+miR-NC、pcDNA-CIRC_0044235+miR-574-5p，干預IL-1β。

1.2.2 RT-qPCR檢測CIRC_0044235和miR-574-5p表達：用Trizol試劑提取軟骨細胞總RNA，使用NanoDrop ND-1000分光光度計評估RNA的濃度和質(zhì)量。使用PrimeScript RT試劑盒通過反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。使用SYBR Premix Ex Ta Ⅱ在ABI 7500實時PCR系統(tǒng)上確定CIRC_0044235和miR-574-5p的相對表達。引物序列(5′-3′)如下：CIRC_0044235 F：TGAGTTTGGTGATTCAGCTTGC，R：AACAAGG CTTCTTCTGAGTGT；β-肌動蛋白(β-actin) F：TAC TGCCCTGGCTCCTAGCA，R：TGGACAGTGAGGCCA GGATAG。miR-574-5p F：CGCGTGAGTGTGTGTGT GTGA，R：AGTGCAGGGTCCGAGGTATT；U6F：CTC GCTTCGGCAGCACA，R：AACGCTTCACGAATTTGC GT；β-actin和U6用作內(nèi)部對照，使用2-△△Ct方法分析CIRC_0044235和miR-574-5p的相對表達。

1.2.3 流式細胞測量術檢測細胞凋亡：根據(jù)annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒隨附操作說明，每組軟骨細胞在避光處與5×10-6L annexin V-FITC和5×10-6L碘化丙啶(propidium iodide，PI)混合，保持15 min。在FACSCalibur流式細胞儀上分析凋亡率。

1.2.4 Western blot檢測Bax和Bcl-2表達：用含有蛋白酶抑制劑和PMSF的RIPA裂解緩沖液提取軟骨細胞總蛋白；BCA試劑盒對總蛋白進行定量，并經(jīng)SDS-PAGE分離。繼而，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。將膜與1∶1 000稀釋的一抗(抗-Bax、-Bcl-2和-GAPDH抗體)一起孵育，然后與二抗(羊抗兔IgG)一起孵育。將ECL化學發(fā)光溶液和ChemiDoc凝膠成像系統(tǒng)應用于條帶可視化，內(nèi)參為GAPDH。

1.2.5 生化指標的檢測：比色法檢測每組軟骨細胞培養(yǎng)液中SOD和LDH活力，ELISA檢測每組軟骨細胞培養(yǎng)液中IL-6和IL-10水平，具體步驟按照SOD、LDH、IL-6與IL-10試劑盒說明書進行。

1.2.6 雙熒光素酶報告實驗檢測CIRC_0044235和miR-574-5p的靶向結(jié)合：預測軟件Circutar RNA Interactome用于篩選與CIRC_0044235結(jié)合的靶miRNA。創(chuàng)建CIRC_0044235的野生型(WT)和突變(MUT)序列，將其克隆到pmirGLO載體中，合成WT-CIRC_0044235與MUT-CIRC_0044235，并與miR-574-5p模擬物或模擬物對照miR-NC共轉(zhuǎn)染到軟骨細胞中以檢查CIRC_0044235和miR-574-5p之間的關系。最后，通過熒光素酶檢測試劑盒測定熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 各組細胞中CIRC_0044235和miR-574-5p的表達水平比較

與對照組比較，IL-1β組CIRC_0044235表達量降低(P<0.05)，miR-574-5p表達量升高(P<0.05)；與IL-1β組、IL-1β+pcDNA比較，IL-1β+pcDNA-CIRC_0044235組CIRC_0044235表達量升高(P<0.05)，miR-574-5p表達量降低(P<0.05)；與IL-1β+anti-miR-NC組比較，IL-1β+anti-miR-574-5p組miR-574-5p表達量降低(P<0.05)；與IL-1β+pcDNA-CIRC_0044235+miR-NC組比較，IL-1β+pcDNA-CIRC_0044235+miR-574-5p組miR-574-5p表達量升高(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with IL-1β group；&P<0.05 compared with IL-1β+pcDNA group；△P<0.05 compared with IL-1β+anti-miR-NC group；▲P<0.05 compared with IL-1β+pcDNA-CIRC_0044235+miR-NC group

2.2 各組細胞凋亡的比較

與對照組相比，IL-1β組凋亡率升高(P<0.05)；與IL-1β組或IL-1β+pcDNA組相比， IL-1β+pcDNA-CIRC_0044235組凋亡率降低(P<0.05)；與IL-1β+anti-miR-NC組相比，IL-1β+anti-miR-574-5p組凋亡率降低(P<0.05)； 與IL-1β+pcDNA-CIRC_0044235+miR-NC組相比，IL-1β+pcDNA-CIRC_0044235+miR-574-5p組凋亡率升高(P<0.05)(圖2)。

*P<0.05 compared with con group；#P<0.05 compared with IL-1β group；&P<0.05 compared with IL-1β+pcDNA group；△P<0.05 compared with IL-1β+anti-miR-NC group；▲P<0.05 compared with IL-1β+pcDNA-CIRC_0044235+miR-NC group

2.3 各組細胞中Bax、Bcl-2蛋白的表達

與對照組相比，IL-1β組Bax蛋白表達量升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達量降低(P<0.05)；與IL-1β組或IL-1β+pcDNA組相比，IL-1β+pcDNA-CIRC_0044235組Bax蛋白表達量降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達量升高(P<0.05)；與IL-1β+anti-miR-NC組相比，IL-1β+anti-miR-574-5p組Bax蛋白表達量降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達量升高(P<0.05)；與IL-1β+pcDNA-CIRC_0044235+miR-NC組相比，IL-1β+pcDNA-CIRC_0044235+miR-574-5p組Bax蛋白表達量升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白表達量降低(P<0.05)(圖3)。

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with IL-1β group；&P<0.05 compared with IL-1β+pcDNA group；△P<0.05 compared with IL-1β+anti-miR-NC group；▲P<0.05 compared with IL-1β+pcDNA-CIRC_0044235+miR-NC group

2.4 各組細胞的生化指標比較

與對照組相比，IL-1β組SOD活力、IL-10含量降低(P<0.05)，LDH活力、IL-6含量升高(P<0.05)；與IL-1β組或IL-1β+pcDNA組相比，IL-1β+pcDNA-CIRC_0044235組LDH活力、IL-6含量降低(P<0.05)，SOD活力、IL-10含量升高(P<0.05)；與IL-1β+anti-miR-NC組相比，IL-1β+anti-miR-574-5p組LDH活力、IL-6含量降低(P<0.05)，SOD活力、IL-10含量升高(P<0.05)；與IL-1β+pcDNA-CIRC_0044235+miR-NC組相比，IL-1β+pcDNA-CIRC_0044235+miR-574-5p組LDH活力、IL-6含量升高(P<0.05)，SOD活力、IL-10含量降低(P<0.05)(圖4)。

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with IL-1β group；&P<0.05 compared with IL-1β+pcDNA group；△P<0.05 compared with IL-1β+anti-miR-NC group；▲P<0.05 compared with IL-1β+pcDNA-CIRC_0044235+miR-NC group

2.5 CIRC_0044235靶向調(diào)控miR-574-5p

Circutar RNA Interactome預測到CIRC_0044235和miR-574-5p部分序列可以互補配對，含有二者結(jié)合位點的WT-CIRC_0044235和MUT-CIRC_0044235序列(圖5)。miR-574-5p組轉(zhuǎn)染W(wǎng)T-CIRC_0044235軟骨細胞的熒光素酶活性比miR-NC組降低約52.53%(P<0.05)，miR-574-5p組、miR-NC組轉(zhuǎn)染MUT-CIRC_0044235軟骨細胞的熒光素酶活性的變化無統(tǒng)計學意義(圖6)。

圖5 CIRC_0044235和miR-574-5p的互補序列

* P<0.05 compared with miR-NC

3 討論

先前的兩項研究表明，來自系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的外周血單核細胞中CIRC_0044235表達減少[8]，CIRC_0044235在類風濕性關節(jié)炎患者中表達被抑制[9]，可能作為系統(tǒng)性紅斑狼瘡和類風濕性關節(jié)炎的診斷生物標志物， 具有重要的臨床價值。同樣，本研究發(fā)現(xiàn)IL-1β誘導的軟骨細胞中CIRC_0044235表達減少，這意味著CIRC_0044235可能參與了IL-1β引起的軟骨細胞損傷。細胞凋亡是發(fā)育過程中細胞死亡的一個活躍過程，軟骨細胞凋亡與軟骨退化有關，可能導致骨關節(jié)炎中關節(jié)軟骨的衰竭[10]。軟骨細胞凋亡受細胞因子和一系列信號通路(涉及BAX和Bcl-2)的調(diào)控[11]。本研究發(fā)現(xiàn)過表達CIRC_0044235減輕了IL-1β引起的軟骨細胞凋亡，并伴隨BCL-2上調(diào)與BAX下調(diào)。炎癥在骨關節(jié)炎發(fā)病機制中起關鍵作用[12]。通過檢測促炎細胞因子(IL-6)和抗炎細胞因子(IL-10)[13]的表達，本研究證實過表達CIRC_0044235減弱了IL-1β誘導的炎性損傷。氧化應激是骨關節(jié)炎的另一個關鍵因素[14]。本研究中，軟骨細胞氧化應激由IL-1β引起，通過減弱SOD活力，以及增強LDH活力。此外，過表達CIRC_0044235減弱了這種傷害。根據(jù)這些結(jié)果，CIRC_0044235可能在減輕骨關節(jié)炎中軟骨細胞損傷的過程中起關鍵作用，CIRC_0044235可以防止IL-1β引起的軟骨細胞損傷，這與CIRC_0044235減輕類風濕性關節(jié)炎炎性反應、 細胞凋亡和關節(jié)損傷的報道[5]類似，表明CIRC_0044235可能作為調(diào)節(jié)骨關節(jié)炎中軟骨細胞損傷的治療靶點。

研究表明，骨關節(jié)炎小鼠膝關節(jié)和IL-1β誘導的軟骨細胞中miR-574-5p水平升高，下調(diào)miR-574-5p表達是隱丹參酮保護骨關節(jié)炎的重要機制[6]。有人在類風濕性關節(jié)炎中檢測到高豐度的miR-574-5p[15]。同樣，本研究在IL-1β誘導的軟骨細胞中也發(fā)現(xiàn)了高表達的miR-574-5p。此外，抑制miR-574-5p減弱了IL-1β引起的軟骨細胞凋亡、氧化應激和炎性損傷，表明miR-574-5p在IL-1β誘導的骨關節(jié)炎損傷中具有促進作用。本研究驗證了CIRC_0044235靶向調(diào)控miR-574-5p，并且miR-574-5p模擬物可以減輕CIRC_0044235對IL-1β誘導的軟骨細胞損傷。表明CIRC_0044235通過海綿miR-574-5p調(diào)節(jié)IL-1β誘導的軟骨細胞損傷。

總之，CIRC_0044235通過靶向miR-574-5p減輕IL-1β誘導的軟骨細胞凋亡、氧化應激和炎性反應。本研究提出骨關節(jié)炎軟骨細胞損傷發(fā)病機制的新見解，并表明CIRC_0044235和miR-574-5p可能作為骨關節(jié)炎治療的新靶點。