姚 平，阮 萍，劉 瑩，鄭 玲，林國(guó)彪

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院病理科，廣西 南寧 530011；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室，廣西 南寧 530200)

膽管癌(cholangiocarcinoma，CCA)是一種起源于膽管上皮的惡性腫瘤，根據(jù)其解剖位置，CCA可分為肝內(nèi)膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，ICCA)、肝門周膽管癌(perihilar cholangiocarcinoma，PCCA)和遠(yuǎn)端CCA(distal cholangiocarcinoma，DCCA)。其中ICCA發(fā)病率占胃腸道系統(tǒng)所有惡性腫瘤的3%，已成為僅次于肝細(xì)胞性肝癌的第二大肝臟惡性腫瘤，占原發(fā)性肝癌發(fā)病率的10%～20%[1]。 2019年第5版《WHO消化系統(tǒng)腫瘤分類》將ICCA分為大導(dǎo)管型及小導(dǎo)管型[2]。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)開展關(guān)于兩種亞型ICCA的大樣本臨床研究，故本研究就此進(jìn)行相關(guān)分析。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2012年1月-2020年12月在廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院接受手術(shù)治療后并隨訪的ICCA患者91例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①手術(shù)方式為根治性手術(shù)及區(qū)域淋巴結(jié)清掃；②術(shù)后石蠟病理證實(shí)為ICCA；③有完整隨訪資料；④術(shù)前影像檢查證實(shí)無(wú)遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在射頻消融、放療、化療史者；②混合型肝癌；③合并其他惡性腫瘤；④圍手術(shù)期死亡病例；⑤隨訪中發(fā)生非腫瘤相關(guān)死亡。收集患者的性別、年齡、肝病史、腫瘤大小、腫瘤發(fā)病部位、病理學(xué)分級(jí)、AJCC第八版臨床分級(jí)、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、有無(wú)血管及神經(jīng)侵犯、周邊肝組織病變等數(shù)據(jù)。通過電話和門診復(fù)診方式隨訪，所有病例每3個(gè)月定期隨訪1次。無(wú)瘤生存時(shí)間定義為手術(shù)日期至第1次臨床確診腫瘤的復(fù)發(fā)日期或末次隨訪日期。總生存時(shí)間定義為手術(shù)日期至死亡日期。隨訪截止日期為2021年1月，隨訪期限內(nèi)隨訪結(jié)束日期為患者死亡日期。

本研究經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)通過。所有患者或其法定監(jiān)護(hù)人均知情同意并簽署知情同意書。

1.2診斷標(biāo)準(zhǔn) 病理診斷和形態(tài)學(xué)分類采用蘇木精-伊紅染色、輔以免疫組織化學(xué)及AB-PAS染色綜合分析。病理切片由2位病理醫(yī)師復(fù)閱，參照2019年第5版《WHO消化系統(tǒng)腫瘤分類》[2]，并結(jié)合Hayashi等[3]的標(biāo)準(zhǔn)將腫瘤進(jìn)行評(píng)估分型(表1)，大導(dǎo)管型指標(biāo)數(shù)量>小導(dǎo)管型指標(biāo)數(shù)量診斷為大導(dǎo)管型，反之為小導(dǎo)管型，其余診斷為不確定型。結(jié)論不一致者由第3名醫(yī)師進(jìn)行評(píng)估，最后討論達(dá)成共識(shí)。

表1 結(jié)合黏液蛋白和免疫表型的ICCA分類評(píng)分表 Table 1 ICCA classification score table combining mucin and immunophenotype

1.3特殊染色及免疫組織化學(xué)染色 所有標(biāo)本均充分取材，經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，組織切片3～4 μm厚，HE染色。特殊染色采用AB-PAS法對(duì)黏液蛋白進(jìn)行評(píng)估。染色后，光鏡下觀察黏液蛋白呈藍(lán)色。采用半定量評(píng)價(jià)：評(píng)分0分，腺腔內(nèi)黏液蛋白積聚<10%；評(píng)分1分，腺腔黏液蛋白積聚10%～50%；評(píng)分2分，腺腔內(nèi)黏液蛋白積聚>50%或胞漿內(nèi)黏液蛋白豐富。

免疫組織化學(xué)染色用LUMATAS自動(dòng)免疫組織化學(xué)染色機(jī)(美國(guó)，Lumatas BioSystems Inc)進(jìn)行。切片用下列抗體染色：福州邁新公司鼠抗人S100P單克隆抗體( 編號(hào)MAB-06997， 工作濃度1∶200)，鼠抗人N-cadherin單克隆抗體( 編號(hào)MAB-0571， 工作濃度1∶300)。二抗、顯色系統(tǒng)、脫蠟液、緩沖液、抗原修復(fù)液和抗體稀釋開放試劑瓶均由全自動(dòng)染色儀配套提供。S100P主要染色部位為細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì)，N-cadherin主要染色部位為細(xì)胞膜/細(xì)胞質(zhì)。對(duì)這些抗體的免疫反應(yīng)性半定量評(píng)估如下：得分0，<1%陽(yáng)性細(xì)胞；1分，1%～25%陽(yáng)性細(xì)胞；2分，26%～50%陽(yáng)性細(xì)胞；3分，51%～75%陽(yáng)性細(xì)胞；4分，76%～100%陽(yáng)性細(xì)胞[3]。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料比較采用秩和檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier生存分析法做無(wú)復(fù)發(fā)生存曲線及總生存曲線分析，Log-rank法比較組間生存率。采用Cox比例回歸風(fēng)險(xiǎn)模型分析大導(dǎo)管型肝內(nèi)膽管癌患者預(yù)后的影響因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1病理形態(tài)學(xué)改變 91例ICCA患者隨訪時(shí)間為0.70～76.50個(gè)月。根據(jù)黏蛋白狀態(tài)、S100-P及N-cadherin對(duì)ICCA進(jìn)行組織學(xué)分類，其中大導(dǎo)管型52例(57.14%)，小導(dǎo)管型32例(35.16%)，未確定型7例(7.69%)。各種類型的ICCA均可見管狀、腺泡狀、篩狀、實(shí)體狀等組織結(jié)構(gòu)。大導(dǎo)管型ICCA的腫瘤細(xì)胞多呈高柱狀，形成大的腺管樣結(jié)構(gòu)(圖1A)，細(xì)胞胞漿及腺腔內(nèi)多可見黏液(圖1B)。免疫組織化學(xué)S-100P染色常為陽(yáng)性(圖1C)。間質(zhì)纖維化明顯，?？梢娚窠?jīng)侵犯，癌周膽管上皮內(nèi)瘤變易見。小導(dǎo)管型ICCA的腫瘤細(xì)胞體積較小，多呈矮柱狀或立方狀，形成腺泡或小管狀結(jié)構(gòu)(圖1D)，細(xì)胞胞漿及腺腔內(nèi)黏液稀少(圖1E)，免疫組織化學(xué)N-cadherin染色多為陽(yáng)性(圖1F)。

圖1 大、小導(dǎo)管型ICCA的病理組織學(xué)特點(diǎn)A.大導(dǎo)管型ICCA大腺管結(jié)構(gòu)明顯，細(xì)胞呈高柱狀，可見細(xì)胞內(nèi)黏液(箭頭示)(HE ×200)；B.大導(dǎo)管型ICCA可見胞漿內(nèi)及腺腔內(nèi)黏液(*示)(AB-PAS ×200)；C.大導(dǎo)管型ICCA S-100P陽(yáng)性表達(dá)(IHC ×200)；D.小導(dǎo)管型ICCA呈小管狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞呈立方狀(箭頭示)(HE ×200)；E.小導(dǎo)管型ICCA黏液蛋白缺失(AB-PAS ×200)F.小導(dǎo)管型ICCA N -cadherin陽(yáng)性表達(dá)(IHC ×200)Figure 1 Pathohistopathological characteristics of large-duct subtype and small-duct subtype ICCA

2.2臨床病理特征比較 大導(dǎo)管型及小導(dǎo)管型ICCA患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯、CA199水平、TNM分期及肝內(nèi)膽管結(jié)石病史等臨床病理特征差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。2組性別、年齡、腫瘤大小、腫瘤分化、肝內(nèi)寄生蟲感染史、乙型肝炎感染等臨床病理特征差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 2種類型ICCA患者臨床病理特征比較 Table 2 Comparison of clinicopathological features between two types of ICCA (例數(shù)，%)

2.3生存分析 截至隨訪日期，大導(dǎo)管ICCA組存活5例(5/52，9.62%)，死亡47例(47/52，90.38%)，中位總生存時(shí)間11.20個(gè)月(0.70～61.00個(gè)月)，中位無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間20.30個(gè)月(0.70～49.60個(gè)月)；小導(dǎo)管ICCA組存活6例(6/32，18.75%)，死亡26例(26/52，81.25%)，中位總生存時(shí)間30.80個(gè)月(5.33～76.50個(gè)月)，中位無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間41.37個(gè)月(18.43～66.00個(gè)月)。大導(dǎo)管ICCA組術(shù)后1、3、5年總生存率(分別是48.08%、13.46%、1.92%)明顯低于小導(dǎo)管ICCA組(分別是78.13%、32.33%、6.25%；P<0.05)，大導(dǎo)管ICCA組術(shù)后1、3、5年的無(wú)復(fù)發(fā)生存率(分別是9.61%、5.77%、0.00%)與小導(dǎo)管ICCA組(分別是28.13%、18.75%、3.13%)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 大、小導(dǎo)管型ICCA患者的總生存期和無(wú)復(fù)發(fā)生存期的Kaplan-Meier曲線圖A.總生存期;B.無(wú)復(fù)發(fā)生存期Figure 2 Kaplan-Meier curve of o-verall survival and recurrence-free survival of patients with large duct type and small duct type ICCA

2.4預(yù)后分析 以預(yù)后為因變量，以腫瘤大小、血管侵犯、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期、腫瘤分化及肝內(nèi)膽石病史為自變量，變量賦值見表3，進(jìn)行多因素Cox模型分析。結(jié)果顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期是大導(dǎo)管型ICCA患者總生存期的預(yù)后不良因素，血管侵犯、TNM分期是無(wú)復(fù)發(fā)生存期的預(yù)后不良因素，見表4，5。

表3 預(yù)后情況多因素Cox分析變量賦值表Table 3 Variable assignment table of multivariate Cox analysis of prognostic factors

表4 大導(dǎo)管型ICCA患者生存的多因素分析Table 4 Multivariate analysis of survival in patients with large duct type ICCA

表5 大導(dǎo)管型ICCA患者復(fù)發(fā)的多因素分析Table 5 Multivariate analysis of recurrence in patients with large duct type ICCA

3 討 論

在過去10年間，ICCA的發(fā)病率增加近20%[4]。ICCA發(fā)病隱匿，惡性程度高，晚期5 年生存率為 5%～15%[5]。手術(shù)治療是首選方案，但術(shù)后復(fù)發(fā)率高達(dá)60%～70%[6]，且ICCA高度促結(jié)締組織增生的能力、多樣的腫瘤微環(huán)境及高度的異質(zhì)性決定了其易對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性[7]。在最新的第5版WHO分類中，根據(jù)組織形態(tài)特點(diǎn)，ICCA可分為大導(dǎo)管型及小導(dǎo)管型[8]。小導(dǎo)管型ICCA可能來(lái)源于小葉間膽管和間隔膽管，腫瘤細(xì)胞起源為小的肝內(nèi)膽管、前體細(xì)胞及成熟的肝細(xì)胞，表現(xiàn)為小的管狀或腺泡狀腺癌，沒有或很少產(chǎn)生黏蛋白。大導(dǎo)管型ICCA多起源于段、葉等較大膽管或伴發(fā)的膽周腺，是由產(chǎn)生黏液的柱狀細(xì)胞排列成大腺管或乳頭狀結(jié)構(gòu)構(gòu)成[9-11]?；谶@兩種類型之間的生物學(xué)差異，對(duì)ICCA進(jìn)行亞型分類已成為ICCA病理組織學(xué)診斷的重要組成部分，并與臨床的治療及預(yù)后評(píng)估密切相關(guān)。

本研究通過單中心樣本對(duì)大導(dǎo)管型、小導(dǎo)管型ICCA的臨床特征及生存期進(jìn)行比較，并對(duì)大導(dǎo)管型ICCA進(jìn)行生存分析，比較不同臨床特征與預(yù)后之間的關(guān)系。結(jié)合HE組織形態(tài)、免疫組織化學(xué)標(biāo)記及黏蛋白等綜合分析，91例ICCA中，大導(dǎo)管型ICCA 52例，小導(dǎo)管型ICCA 32例，未確定型7例。小導(dǎo)管型ICCA患者的5年總生存率均高于大導(dǎo)管型患者，與Hayashi等[3]，Chung等[12]及Liau等[13]的研究結(jié)果一致。而Sigel等[14]研究提示，大導(dǎo)管型及小導(dǎo)管型ICCA患者的疾病特異性生存率及無(wú)復(fù)發(fā)生存率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與該研究中大導(dǎo)管型ICCA患者例數(shù)過少(14例，8%)有關(guān)。

大導(dǎo)管型、小導(dǎo)管型ICCA表現(xiàn)出不同的臨床病理特征。在腫瘤的肝臟背景病變中，大導(dǎo)管型ICCA往往與肝內(nèi)膽管結(jié)石和膽管上皮內(nèi)瘤變相關(guān)[12]，本研究中大導(dǎo)管型ICCA的肝內(nèi)導(dǎo)管結(jié)石發(fā)生率明顯高于小導(dǎo)管型。這可能是由于肝內(nèi)膽管結(jié)石機(jī)械性刺激和膽汁淤積損傷膽管上皮細(xì)胞，改變了膽管組織周圍的微環(huán)境，從而導(dǎo)致膽管上皮再生、不典型增生、上皮內(nèi)瘤變，最終導(dǎo)致膽管上皮癌變[15]。本研究對(duì)臨床特征進(jìn)行單因素分析發(fā)現(xiàn)，肝內(nèi)導(dǎo)管結(jié)石是大導(dǎo)管型ICCA的預(yù)后不良因素，這與葉冠雄等[16]研究結(jié)果一致。ICCA的轉(zhuǎn)移方式不同于肝細(xì)胞癌的經(jīng)門靜脈血運(yùn)轉(zhuǎn)移為主，而是以淋巴回流的形式向腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及肝外臟器的直接浸潤(rùn)的方式進(jìn)行[17]。第8版AJCC分期系統(tǒng)建議至少清掃6個(gè)淋巴結(jié)，以獲得準(zhǔn)確的N分期[18]。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對(duì)更準(zhǔn)確地評(píng)估ICCA預(yù)后方面起著重要作用。許多研究都集中在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目和位置與預(yù)后的關(guān)系。然而，淋巴結(jié)清掃術(shù)是否能提高ICCA患者的存活率仍存在爭(zhēng)議。本研究結(jié)果顯示，與小導(dǎo)管型ICCA比較，大導(dǎo)管型ICCA的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及血管侵犯發(fā)生率、血清CA199水平、TNM分期等明顯升高，這意味著大導(dǎo)管型ICCA比小導(dǎo)管型有更高的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是大導(dǎo)管型ICCA患者總生存期的預(yù)后不良因素，提示大導(dǎo)管型ICCA有必要進(jìn)行系統(tǒng)性淋巴結(jié)清掃。而腫瘤標(biāo)志物CA199的增高及TNM分期都說明，與小導(dǎo)管型ICCA比較，大導(dǎo)管型ICCA的預(yù)后較差。TNM分期是大導(dǎo)管型ICCA患者總生存期及無(wú)復(fù)發(fā)生存期的預(yù)后不良因素，這與以往的一些ICCA患者的預(yù)后研究相似[19-21]。

綜上所述，大導(dǎo)管型、小導(dǎo)管型ICCA患者的臨床病理特征有一定差異，大導(dǎo)管型ICCA的預(yù)后更差，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、血管侵犯及TNM分期是其總生存期及無(wú)復(fù)發(fā)生存期的影響因素。由于病因和臨床轉(zhuǎn)歸不同，不同類型的ICCA對(duì)治療的反應(yīng)也可能不同，對(duì)ICCA進(jìn)行組織學(xué)亞型分類有一定的臨床意義。本研究的不足是小導(dǎo)管型ICCA病例數(shù)較少，后期仍需要擴(kuò)大樣本數(shù)量并開展多中心研究以進(jìn)一步驗(yàn)證。