司 玲，崔 蕾，邊百川，韓 雪，趙 歡

河北省直屬機關(guān)第二門診部口腔科，河北石家莊 050000

慢性牙周炎是發(fā)生在牙周組織的慢性炎癥性疾病，由牙周細(xì)菌感染與宿主免疫功能失調(diào)引起，不及時治療可導(dǎo)致牙槽骨、牙骨質(zhì)、牙齦和牙周韌帶等組織發(fā)生炎癥變化，甚至引起牙齒脫落[1]，為控制牙周炎進(jìn)展應(yīng)及早進(jìn)行診治。宿主免疫反應(yīng)失調(diào)、過度炎癥反應(yīng)可引起組織損傷并影響細(xì)菌的有效清除，是慢性牙周炎組織損傷和疾病進(jìn)展的主要原因[2]。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子6(STAT6)是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，STAT6信號傳導(dǎo)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)化，調(diào)控炎癥反應(yīng)[3]。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是一種重要的晚期炎癥反應(yīng)介質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)HMGB1可激活炎癥反應(yīng)下游信號通路中的核因子-κB(NF-κB)導(dǎo)致炎癥級聯(lián)反應(yīng)[4]?；|(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13)是基質(zhì)金屬蛋白酶家族重要成員，通過切割Ⅱ型膠原參與軟骨降解過程，與骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生密切相關(guān)[5]。STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13在慢性牙周炎中的報道并不多見，其臨床意義和價值尚不清楚，本研究擬檢測慢性牙周炎患者血清STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13，分析其與病情嚴(yán)重程度、炎癥反應(yīng)和牙周臨床指標(biāo)的相關(guān)性，為臨床診治提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料 將2019年2月至2022年2月本院收治的156例慢性牙周炎患者納入研究作為牙周炎組，男81、女75例，年齡41～69歲、平均(53.02±6.49)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合第4版《牙周病學(xué)》中慢性牙周炎診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；(2)至少存留20顆牙齒；(3)年齡18周歲以上，對本研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)有種植牙、佩戴義齒；(2)近1周接受過去腐治療、根管治療、正畸治療及抗菌藥物和免疫抑制劑治療；(3)頜面創(chuàng)傷；(4)合并惡性腫瘤、自身免疫疾病。另外，選取72例于本院進(jìn)行體檢的無口腔疾病的健康者作為對照組，男41例、女31例，年齡40～67歲、平均(52.95±6.01)歲。牙周炎組、對照組年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。本研究已經(jīng)獲得本院倫理會批準(zhǔn)。

1.2儀器與試劑 Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；Superscript Ⅲ cDNA擴增系統(tǒng)購自美國Invitrogen公司；Prism 9700 PCR儀購自美國Applied公司；FK-SY96S全自動酶標(biāo)儀購自山東方科儀器有限公司；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.3方法

1.3.1標(biāo)本采集 所有受試者入組后后于次日清晨采集空腹靜脈血3 mL于無抗凝劑的試管，待血液凝固后取上層液體于離心管，以2 500～3 000 r/min的速度離心，取試管最上層液體(血清)作為待測標(biāo)本，于-20 ℃保存。

1.3.2STAT6 mRNA的檢測 采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)檢測STAT6 mRNA水平。Trizol法提取總RNA，Superscript Ⅲ cDNA擴增系統(tǒng)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用PCR儀進(jìn)行檢測，反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s，然后95 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共45個循環(huán)。反應(yīng)體系：Power SYBR?Green PCR Master Mix 2.5 μL，2 μL cDNA(12.5 ng)特異引物，RNase-Free ddH2O 21 μL。STAT6引物序列，正向：5′-TTCTGCCAAAGACCTGTCCAT-3′，反向:5′-CTGTCCTCTACCATAGTCACA-3′；GAPDH引物序列，正向：5′-CCACTCACGGCA AATTCAAC-3′，反向：5′-GGAGAAGGCGTTTGC TTAGTT-3′。采用2-ΔΔCt法，以GAPDH為內(nèi)參，計算STAT6 mRNA的相對表達(dá)水平。

1.3.3炎癥因子的檢測 取血清標(biāo)本，采用ELISA檢測血清HMGB1、MMP-13、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-1α、IL-1β、IL-6水平。檢測步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.4牙周臨床指標(biāo)評估 對牙周炎患者進(jìn)行牙周臨床指標(biāo)的評估。牙周臨床指標(biāo)包括出血指數(shù)(BI)、探診深度(PD)和附著喪失(AL)。采用牙周探針(購自廣州市福星旺貿(mào)易有限公司)進(jìn)行操作。探針與牙長軸平行，探針尖端緊貼牙面，探入牙袋底后記錄從袋底到齦緣的距離，即PD。AL指的是釉牙骨質(zhì)界至袋底的距離，能客觀反映出牙周組織的破壞程度。參考文獻(xiàn)[7]評估BI，BI分為1～5級；1級：齦溝無出血；2級：輕探齦溝后出血；3級：探診后明顯出血，未溢出齦溝；4級：探診出血溢出齦溝；5級：齦溝自發(fā)性出血。1級賦值1分，以此類推。

1.3.5病情評估和分組 輕度牙周炎：牙齦有炎癥，BI<2，PD3～≤4 mm，AL 1～2 mm，X線片提示牙槽骨吸收<根長的1/3；中重度牙周炎：BI≥2，PD≥5 mm，AL≥3 mm，X線片提示牙槽骨吸收超過根長的1/3[6]。根據(jù)牙周炎病情嚴(yán)重程度將患者分為輕度組(80例)和中重度組(76例)。

2 結(jié) 果

2.1牙周炎組和對照組血清STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13及炎癥因子水平比較 牙周炎組血清STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13、TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6水平均高于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 兩組血清STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13及炎癥因子水平比較

2.2不同病情牙周炎患者血清STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13、炎癥因子及牙周臨床指標(biāo)比較 中重度組血清STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13、TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6水平及PD、BI、AL均高于輕度組(P<0.05)，見表2。

表2 不同病情牙周炎患者血清STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13、炎癥因子水平及牙周臨床指標(biāo)比較

組別nIL-1β(pg/mL)IL-6(pg/mL)PD(mm)BI(分)AL(mm)輕度組80100.99±6.85123.86±10.124.01±0.631.52±0.262.02±0.37中重度組76116.24±10.05147.26±12.396.02±0.983.02±0.654.52±0.63t11.12312.94815.31519.09830.403P<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001

2.3牙周炎組STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13和炎癥因子、牙周臨床指標(biāo)的相關(guān)性 牙周炎組STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13與TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6水平及PD、BI、AL均呈正相關(guān)(P<0.05)，見表3。

表3 STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13和炎癥因子、牙周臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析

2.4STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13診斷慢性牙周炎的價值 STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13診斷慢性牙周炎的臨界值分別為2.31、76.09 ng/mL、201.41 pg/mL，ROC曲線的AUC分別為0.739、0.687、0.684，STAT6 mRNA、HMGB1和MMP-13聯(lián)合用于診斷慢性牙周炎的AUC為0.911，大于STAT6 mRNA、HMGB1和MMP-13單項檢測(Z=4.830、5.257、6.009，P<0.05)，見表4、圖1。

表4 STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13用于慢性牙周炎診斷的價值分析

圖1 STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13單項及聯(lián)合用于診斷慢性牙周炎的ROC曲線

3 討 論

慢性牙周炎是人類最常見的口腔疾病，也是導(dǎo)致牙齒脫落的主要原因，影響著全球約20%～50%的人口，已知吸煙、口腔衛(wèi)生差、糖尿病、藥物、年齡、遺傳和心理壓力等是慢性牙周炎發(fā)病的高危因素，慢性牙周炎不僅可導(dǎo)致牙周組織炎性損傷，還可引起心血管疾病、糖尿病、癌癥、阿爾茲海默癥等全身性疾病[8-9]。慢性牙周炎發(fā)病機制復(fù)雜，目前認(rèn)為是口腔菌群失調(diào)及先天和適應(yīng)性免疫功能障礙介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致，牙周組織慢性炎癥由多種促炎細(xì)胞因子參與，包括IL-1α、IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-17等大量炎癥因子釋放，炎癥反應(yīng)失控導(dǎo)致牙周組織的慢性炎癥性損傷，最終引起骨吸收和牙齒的脫落[10]。

STAT是Janus激酶(JAK)下游信號傳遞細(xì)胞因子，JAK激活后細(xì)胞溶質(zhì)STAT會發(fā)生酪氨酸磷酸化并二聚化，以響應(yīng)各種外部刺激發(fā)生絲氨酸磷酸化，增強轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，JAK-STAT通路響應(yīng)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子和生長激素的信號傳導(dǎo)，啟動典型的信號級聯(lián)反應(yīng)，參與造血、細(xì)胞生長、組織修復(fù)、免疫調(diào)控等生理過程，JAK-STAT信號傳導(dǎo)通路異?？梢鸢┌Y、炎癥以及自身免疫性疾病[11]。STAT6是STAT家族成員之一，可被多種細(xì)胞因子以及JAK激活，參與免疫反應(yīng)調(diào)控過程，研究顯示STAT6基因多態(tài)性與嗜酸性粒細(xì)胞增多、總免疫球蛋白E水平增高以及哮喘發(fā)病有關(guān)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，牙周炎患者血清STAT6 mRNA表達(dá)增高與牙周炎病情嚴(yán)重程度、炎癥因子、牙周炎指標(biāo)有關(guān)，表明STAT6表達(dá)上調(diào)可能誘導(dǎo)牙周組織炎癥，加劇病情進(jìn)展。分析原因：在牙周病原菌刺激下，JAK激活，誘導(dǎo)STAT6表達(dá)上調(diào)，STAT6二聚化并在細(xì)胞核內(nèi)易位，刺激細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)和基因轉(zhuǎn)錄，激活單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，促使促炎細(xì)胞因子和趨化因子大量釋放，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生[13]，加劇牙周炎病情進(jìn)展。

HMGB1是一種高度保守的DNA結(jié)合蛋白，可通過與免疫細(xì)胞表面受體結(jié)合實現(xiàn)免疫調(diào)節(jié)，從而調(diào)控炎癥反應(yīng)過程，在炎癥反應(yīng)過程中HMGB1可通過激活其內(nèi)源性配體——Toll樣受體4，激活NF-κB，進(jìn)而誘導(dǎo)IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-8等炎癥因子釋放和級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致過度炎癥損傷[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1與慢性牙周炎也存在密切關(guān)系，表現(xiàn)牙周炎組血清HMGB1水平高于對照組(P<0.05)，且HMGB1水平隨著牙周炎病情的加重而增高，HMGB1與TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6水平，PD、BI、AL呈正相關(guān)，說明HMGB1可能參與牙周局部炎癥損傷過程。推測其機制如下，首先，HMGB1通過與Toll樣受體相互作用促使炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生增加，誘導(dǎo)牙周炎癥反應(yīng)和組織損傷[15]；其次，HMGB1通過與其配體-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體結(jié)合會激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，促使促炎因子TNF-α、IL-6等釋放，引起牙周組織炎癥[16]，繼而導(dǎo)致慢性牙周炎及病情的進(jìn)展。

MMP-13也稱為膠原酶3，是Ⅱ型膠原蛋白裂解的關(guān)鍵酶，主要通過特定信號通路直接或間接啟動下游基質(zhì)和膠原蛋白降解，MMP-13過度表達(dá)可導(dǎo)致上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，在癌癥侵襲、轉(zhuǎn)移、生長調(diào)節(jié)、免疫逃避、細(xì)胞凋亡和血管生成中具有重要作用[17]，MMP-13表達(dá)上調(diào)還可導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)過度降解，誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[18]。本研究結(jié)果顯示：MMP-13過表達(dá)與慢性牙周炎發(fā)病有關(guān)，MMP-13表達(dá)越高牙周炎病情越重，牙周損傷越明顯，相關(guān)性分析結(jié)果顯示MMP-13與TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6呈正相關(guān)，表明MMP-13可能調(diào)控炎癥反應(yīng)參與慢性牙周炎發(fā)病過程，MMP-13過表達(dá)可能導(dǎo)致炎癥反應(yīng)和牙周組織破壞。相關(guān)報道也指出：炎癥環(huán)境下NF-κB信號通路激活可誘導(dǎo)MMP-13表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解和骨代謝異常，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)[19]。抑制MMP-13表達(dá)可減輕脂多糖誘導(dǎo)的牙周炎小鼠模型中炎癥介質(zhì)釋放和骨吸收[20]。

ROC曲線分析顯示：STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13在慢性牙周炎診斷方面具有一定價值， STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13聯(lián)合診斷的效能明顯提高，表明STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13可作為慢性牙周炎臨床診斷的輔助指標(biāo)。

綜上所述，慢性牙周炎患者血清STAT6 mRNA表達(dá)上調(diào)，HMGB1、MMP-13水平增高，且中重度組血清STAT6 mRNA表達(dá)和HMGB1、MMP-13水平高于輕度組。STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13與血清炎癥細(xì)胞因子、PD、BI、AL呈正相關(guān)，提示STAT6、HMGB1、MMP-13可能通過調(diào)節(jié)牙周局部炎癥反應(yīng)參與牙周組織破壞過程，STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13是慢性牙周炎診斷中頗具應(yīng)用前景的指標(biāo)。本研究局限之處在于樣本例數(shù)偏少，未觀察STAT6 mRNA、HMGB1、MMP-13與慢性牙周炎治療療效和預(yù)后的關(guān)系，尚待進(jìn)一步擴大樣本量，增加觀測時間點加以證實。