張嘉賓，徐 釗，周光余，張夢迪，符 楊，劉佳琪，周東海*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070； 2.塔里木大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，阿拉爾 843300)

目前，我國寵物行業(yè)發(fā)展迅速。急性腎損傷已成為危害寵物生命和健康的一種常見病，尤其在老年犬中發(fā)病率逐年上升。雖然腎損傷的治療方法已十分成熟，不過對于急性腎損傷而言其治療有一定難度。因此，找到更加快速、簡便、經(jīng)濟(jì)且有效地治療犬急性腎損傷的方法在當(dāng)前寵物醫(yī)療行業(yè)迅速發(fā)展的階段具有重要現(xiàn)實意義。袁玲等[1]研究發(fā)現(xiàn)采用主客配穴的方法對急性胰腺炎與急性腎損傷的大鼠進(jìn)行治針灸治療，減輕炎癥作用，同時降低動物腎損傷程度。張俊川[2]報道，選取內(nèi)關(guān)、足三里等穴位針灸局灶性大腦皮層梗死模型大鼠，發(fā)現(xiàn)電針能減輕炎性因子的表達(dá)，減輕腎的受損程度，保護(hù)腎功能。梁鑫[3]研究發(fā)現(xiàn)選擇腎俞和足三里兩個穴位針刺能夠通過增強(qiáng)腎功能，減少有害物質(zhì)在體內(nèi)的蓄積，同時作用于細(xì)胞凋亡相關(guān)的信號通路，減輕腎橫紋肌的溶解程度，降低腎的病理損傷程度。王冰舒[4]發(fā)現(xiàn)電針治療急性腎衰竭后機(jī)體的抗氧化能力得到提高，其抗氧化相關(guān)蛋白的表達(dá)明顯增強(qiáng)，同時腎的損傷程度明顯減輕。這說明中醫(yī)治療對于腎的保護(hù)和腎功能的恢復(fù)具有很好的療效，尤其是針灸治療的方法，其可行性強(qiáng)，應(yīng)用廣泛。鄒曉彪等[5]研究發(fā)現(xiàn)急性腎衰竭的發(fā)病過程中存在氧化應(yīng)激反應(yīng)，而氧化應(yīng)激損傷也存在于急性腎衰竭的致病機(jī)制之中。郭艷輝[6]研究發(fā)現(xiàn)急性腎衰竭兔的氧化應(yīng)激作用在電針治療后得到明顯改善，同時NRF2信號通路上的抗氧化蛋白HO-1的表達(dá)明顯的增加。因此，對于急性腎衰竭過程中的氧化應(yīng)激反應(yīng)的研究十分有必要。目前，有關(guān)腎損傷的治療方法不盡相同，然而運(yùn)用中獸醫(yī)的電針療法治療犬急性腎損傷的研究少有報道。以比格犬為對象，探討電針療法對急性腎損傷犬的腎功能、鈣磷代謝、抗氧化能力以及NRF2信號通路的作用研究，為犬急性腎損傷的治療提供理論依據(jù)和新方法。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計

選取2～3歲健康、體重相近比格犬24只，采用單因子完全隨機(jī)區(qū)組試驗設(shè)計，將試驗犬隨機(jī)分為對照組、造模組、常規(guī)治療組、電針干預(yù)組、電針治療組和聯(lián)合治療組。第1～15天為造模期，第16～30天為治療期。本研究選用腺嘌呤制造急性腎損傷模型。造模的方法參考聶靜等[7]的造模方法，即當(dāng)試驗犬的血清肌酐濃度達(dá)到基線的1.5倍時即判定為造模成功。造模期，除對照組外其余各組每日上午基礎(chǔ)日糧添加75 mg·(kg·d)-1腺嘌呤，電針干預(yù)組每日下午電針治療。治療期，除對照組、造模組和電針干預(yù)組外，其余各組每日下午治療。常規(guī)治療組通過補(bǔ)液(5%葡萄糖氯化鈉溶液)、利尿(呋塞米2 mg·kg-1)等方法對試驗犬進(jìn)行對癥治療，電針治療組每日下午電針治療，聯(lián)合治療組在電針治療的同時根據(jù)試驗犬的癥狀輔以對癥治療。

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗期間自由采食和飲水，單獨(dú)籠子飼養(yǎng)。每天清理、消毒犬舍，隨時觀察犬健康狀況。

1.3 電針操作方法

選取犬雙側(cè)腎俞(第2腰椎橫突末端相對的髂肋肌溝中)、脾俞(倒數(shù)第2肋間，背最長肌與髂肋肌之間的肌溝中)、足三里(小腿外側(cè)上1/4處，脛腓骨間隙中)、三陰交(內(nèi)踝上方，脛骨內(nèi)隆起與內(nèi)踝連線下1/5處)、太溪(跟骨內(nèi)測凹陷中)以及命門(第2、3腰椎棘突之間)；試驗犬保定、剃毛、消毒，選用1寸(0.30 mm×25 mm)一次性無菌針，快速進(jìn)針法針刺上述穴位，直刺進(jìn)針，捻轉(zhuǎn)后接電針。用華佗牌電子針療儀(SDZ-Ⅱ型)，選擇疏密波，頻率1檔，每次電針持續(xù)20 min。電針干預(yù)組、電針治療組和聯(lián)合治療組均在造模成功后連續(xù)電針15 d直至試驗結(jié)束。

1.4 試驗測定與方法

1.4.1 尿比重和血液生化指標(biāo) 試驗結(jié)束后收集各組尿液進(jìn)行尿常規(guī)檢測；同時分別從各組犬前肢背側(cè)皮下頭靜脈采集血液5 mL，用EDTA抗凝管收集，37 ℃水浴30 min后3 000 r·min-1離心15 min，將上清液分裝到1.5 mL離心管中，置于-20 ℃保存待測生化指標(biāo)。BUN、CRE、Ca2+、P3+、UA、SOD和MDA試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.4.2 X光 根據(jù)拍攝部位調(diào)節(jié)腹部X光拍攝條件，設(shè)置管電壓為56.00 kV，毫安秒為8.00 mAs，曝光時間為40.00 ms。將試驗犬保定在臺子上，拍攝X光。

1.4.3 H.E.染色 試驗結(jié)束后，試驗犬麻醉，取出左側(cè)腎，將腎表面的血漬用生理鹽水洗凈，放入4%多聚甲醛緩沖液固定12～24 h。將固定好的組織用常規(guī)方法脫水后進(jìn)行石蠟包埋。包埋后的組織塊修理、切片、脫蠟、水化、蘇木素染色3～5 min、乙醇分色5 s后用伊紅染色數(shù)秒，分別用濃度梯度乙醇和二甲苯對切片進(jìn)行脫水、透明，中性樹膠進(jìn)行封片處理后，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4.4 免疫組織化學(xué)染色 組織石蠟切片常規(guī)脫水、透明后用檸檬酸抗原修復(fù)緩沖液(pH 6.0)加熱修復(fù)，然后放入3 %雙氧水溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。切片封閉后用一抗4 ℃孵育過夜。PBS洗滌切片后滴加與二抗(HRP標(biāo)記)覆蓋組織，室溫孵育50 min，DAB顯色和蘇木素復(fù)染3 min后脫水封片于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4.5 qRT-PCR 檢測相關(guān)基因 用Trizol法提取腎組織總RNA，測定RNA的濃度和純度；根據(jù)NCBI主頁GenBank已公布的目的基因序列，應(yīng)Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物，同時參考文獻(xiàn)中提及的引物序列，引物中G+C含量應(yīng)在40%～60%。qRT-PCR標(biāo)準(zhǔn)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，循環(huán)40次，然后繪制曲線，使用2-ΔΔCt的方法計算目的基因在不同cDNA 模板中的相對表達(dá)量。

表1 目的基因及內(nèi)參基因引物設(shè)計

1.4.6 Western blot 用RIPA裂解腎組織并提取總蛋白，BCA法測定總蛋白的濃度；加入Loading Buffer在95 ℃下蛋白變性；取適量的蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)印至PVDF膜，封閉1.5 h；4 ℃過夜孵育一抗(KEAP1、NRF2、HO-1、NQO1稀釋比例為 1∶800；β-actin稀釋比例為1∶1 000)、HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗室溫孵育2 h(二抗稀釋比例為 1∶5 000)，顯影。使用Image J軟件進(jìn)行蛋白條帶的灰度值分析；應(yīng)用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，采用One-way ANOVA、t檢驗方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析。KEAP1、NRF2、HO-1、NQO1一抗購自于Wanleibio 試劑公司，β-actin一抗和HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗購自ABclonal試劑公司。

2 結(jié) 果

2.1 電針療法對AKI犬尿比重和血液生化指標(biāo)的影響

由表2可知，與對照組相比，造模組犬尿比重數(shù)值降低；與造模組相比，常規(guī)治療組、電針干預(yù)組、電針治療組和聯(lián)合治療組的尿比重數(shù)值均有不同程度的升高，但均低于對照組。

表2 尿比重的變化

由圖1可知，與對照組相比，造模組犬血清CREA、BUN、UA、MDA以及血磷含量顯著提高(P<0.01)，而血鈣、血清與腎SOD水平顯著降低(P<0.01)；與造模組相比，常規(guī)治療組、電針干預(yù)組、電針治療組和聯(lián)合治療組的血清CREA、BUN、UA、MDA以及血磷含量顯著降低(P<0.01)，而血鈣、血清與腎SOD水平顯著升高(P<0.01)。

B. 空白組; M. 造模組; R. 常規(guī)治療組; Ei. 電針干預(yù)組; Et. 電針治療組; C. 聯(lián)合治療組。對比空白組，*.P<0.01；對比造模組，#.P<0.01

2.2 犬腎組織影像學(xué)觀察

由圖2可知，X光檢測造模前試驗犬腎結(jié)構(gòu)、大小正常，被膜完整。造模結(jié)束后與第2腰椎對比腎體積明顯增大，聯(lián)合治療后腎有所變小，但仍大于造模前腎大小。

A. 造模前；B.造模后；C.聯(lián)合治療后

2.3 犬腎組織病理學(xué)觀察

HE染色結(jié)果如圖3，空白組腎組織結(jié)構(gòu)完整，造模組腎組織中有大面積腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生腫大、空泡化、壞死，管腔內(nèi)細(xì)胞碎片和顆粒、且腎間質(zhì)存在瘀血。常規(guī)治療組與各電針處理組中腎出現(xiàn)的病變相較模型組均有減輕趨勢。

A.空白組;B.造模組;C.常規(guī)治療組;D.電針干預(yù)組;E.電針治療組;F.聯(lián)合治療組。掃描文章首頁OSID碼可查看彩圖

2.4 KEAP1、NRF2、HO-1、NQO1蛋白免疫組織化學(xué)染色

試驗用 KEAP1、NRF2、HO-1、NQO1單克隆抗體孵育組織切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(圖4)。各組腎組織均有KEAP1、NRF2、HO-1、NQO1 4種蛋白表達(dá)，其主要分布于腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)中，另有少量分布于腎小球基底膜細(xì)胞胞質(zhì)及腎間質(zhì)中。造模組腎小管上皮細(xì)胞KEAP1蛋白陽性染色深，呈深棕色，NRF2、HO-1、NQO1蛋白陽性染色淺，呈淺棕色；對照組腎小管上皮細(xì)胞KEAP1蛋白陽性染色淺，NRF2、HO-1、NQO1蛋白陽性染色深，呈深棕色，呈淺棕色。其余各治療的KEAP1蛋白陽性染色均淺于造模組，深于對照組；其余各治療的NRF2、HO-1、NQO1蛋白陽性染色均淺于空白組，深于造模組。

A.空白組;B.造模組;C.常規(guī)治療組;D.電針干預(yù)組;E.電針治療組;F.聯(lián)合治療組。掃描文章首頁OSID碼可查看彩圖

2.5 電針療法對AKI犬NRF2通路的影響

qRT-PCR和Western blot檢測KEAP1、NRF2、HO-1和NQO1的基因和蛋白的表達(dá)，結(jié)果如圖5、6所示，與對照組比，造模組KEAP1基因和蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)，而NRF2、HO-1、NQO1基因和蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.01)；與造模組比，各治療組腎組織KEAP1基因和蛋白相對表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.01)，而NRF2、HO-1、NQO1基因和蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)(P<0.01)。

B.空白組;M.造模組;R.常規(guī)治療組;Ei.電針干預(yù)組;Et.電針治療組;C.聯(lián)合治療組。對比空白組，*.P<0.01；對比造模組，#.P<0.01

3 討 論

3.1 電針療法對AKI犬腎功能的影響

現(xiàn)代研究證實針灸在腎疾病的治療方面有著確切的療效。徐藝菲等[8]報道電針可以通過改善腎微循環(huán)，增加氧和其他營養(yǎng)物質(zhì)的供給，進(jìn)而減輕腎損傷，增強(qiáng)腎功能。研究發(fā)現(xiàn)針刺還具有延緩腎損害進(jìn)展、減輕腎組織損傷程度、抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)抗炎物質(zhì)表達(dá)來改善腎功能[1]。肖小艷等[9]和金佳慧等[10]研究發(fā)現(xiàn),刺激腎俞和關(guān)元兩個穴位，腎的損傷程度明顯減輕。王學(xué)杰等[11]研究證實，在腎損傷通過刺激腎俞穴能夠降低尿蛋白的含量，使腎的濾過作用更快恢復(fù)。

B.空白組;M.造模組;R.常規(guī)治療組;Ei.電針干預(yù)組;Et.電針治療組;C.聯(lián)合治療組。對比空白組，*.P<0.01；對比造模組，#.P<0.01

本試驗選擇一組經(jīng)大量研究證實在腎疾病中有顯著療效的穴位配伍。其中，腎俞穴其中最主要的穴位，在治療腎系疾病中使用頻率最高，治療效果最好，尤其在治療腎損傷和糖尿病腎病的研究中常被選用[12-13]。中醫(yī)學(xué)對于本臟的疾病優(yōu)先考慮本臟的背俞穴進(jìn)行治療，以達(dá)到更好的治療效果。因此，腎疾病首選腎俞穴進(jìn)行治療。刺激腎俞穴能夠改善腎功能，促進(jìn)水液運(yùn)化[14-15]。脾俞穴與腎俞穴相配伍，能夠在調(diào)節(jié)腎功能的同時加強(qiáng)脾的水液運(yùn)化能力[16]。足三里穴在許多疾病的治療和養(yǎng)生保健方面都有著廣泛的應(yīng)用，針刺其穴位能夠生發(fā)脾胃之氣同時增強(qiáng)機(jī)體的免疫力[17-18]。針灸三陰交除健脾益血外，還能調(diào)肝補(bǔ)腎，對于急性腎衰竭的恢復(fù)期有著較好的療效[19]。太溪穴與腎俞穴合用稱原俞配伍[20]。原俞配穴是指將臟腑所對應(yīng)的原穴和背俞穴配伍使用，相比單獨(dú)針灸一個穴位效果更好。因此，選用腎俞和腎經(jīng)的原穴太溪相配伍[21]。此外，本試驗選取的命門穴在臨床上與腰、腎疾病關(guān)系密切。本試驗選取命門穴與上述其他穴位合用，改善急性腎損傷犬的腎功能。同時由于犬的皮膚游離性較大，在試驗操作過程中腎俞穴不方便定位。因此先定位命門穴，再沿腰椎定位腎俞穴也有利于試驗過程中的操作。本試驗造模組的腎較對照組出現(xiàn)體積增大[22]，經(jīng)過電針聯(lián)合治療后，體積減少，腎病變損傷程度減輕，治療效果比常規(guī)治療及電針單獨(dú)治療效果好。尿酸和肌酐是判定腎損傷的主要指標(biāo)。臨床上也是主要根據(jù)肌酐含量來判定腎損傷程度[23]。AKI犬的最明顯癥狀便是腎功能的損傷，其CREA、BUN、尿比重等都會出現(xiàn)明顯的變化[24]。郭銀雪等[25]報道ARF出現(xiàn)腎功能失常的主要原因是腎小管發(fā)生阻塞，導(dǎo)致有毒物質(zhì)在體內(nèi)蓄積。本研究發(fā)現(xiàn)電針治療組及其他治療組較造模組BUN、CREA、UA均顯著降低，尿比重顯著升高，且電針聯(lián)合治療組的結(jié)果比常規(guī)治療組合電針單獨(dú)治療組低。說明電針療法對AKI犬的腎及其功能具有積極作用。

3.2 電針療法對AKI犬鈣磷代謝的影響

在腎發(fā)生損傷過程中，血液內(nèi)游離的鈣通過被破壞的鈣離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)，超過正常細(xì)胞承載能力[26]。同時，血液中磷的含量會因腎功能障礙導(dǎo)致磷排出困難而增加，另外組織細(xì)胞受到實質(zhì)性的損傷導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的磷被釋放入血，進(jìn)一步導(dǎo)致了血磷的上升[27]。上述報道與本研究結(jié)果一致，試驗造模后血清磷含量顯著增加，血清鈣含量顯著降低。各治療組較造模組血磷濃度顯著降低，血鈣濃度顯著增高，其中，電針聯(lián)合治療組比常規(guī)治療組和電針單獨(dú)治療組變化明顯；說明電針處理能夠減少磷在血中的含量并提高鈣的含量，從而減輕AKI引起的體內(nèi)鈣磷代謝失調(diào)，從而減輕組織細(xì)胞的損傷程度。

3.3 電針療法對AKI犬抗氧化能力和NRF2通路的影響

在AKI過程中出現(xiàn)廣泛的氧化應(yīng)激損傷[28]，而氧化應(yīng)激損傷也存在于AKI的致病機(jī)制之中[5]。鄧樹泳等[29]研究發(fā)現(xiàn)針刺治療能夠提高機(jī)體的免疫反應(yīng)，增加體內(nèi)多個免疫器官的抗氧化能力，并促進(jìn)這些免疫器官中SOD的生成和MDA的減少，從而達(dá)到增強(qiáng)機(jī)體整體的抗氧化能力的效果。這一結(jié)論與本研究結(jié)果相一致，各治療組相比于腺嘌呤造模組SOD均有不同程度的增強(qiáng)，MDA含量均有不同程度的降低，其中，聯(lián)合治療組的作用效果最明顯。說明電針的干預(yù)和治療能夠提升AKI犬的抗氧化能力。

在氧化應(yīng)激過程中，NRF2信號通路通過激活抗氧化酶的表達(dá)來對過量的能造成氧化損傷的物質(zhì)進(jìn)行清除[30-31]。NRF2信號通路被認(rèn)為是最為主要的信號通路之一，NRF2也被認(rèn)為是該信號通路上的核心蛋白[5,32]。NRF2進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，啟動各類抗氧化蛋白酶的翻譯過程，包括NQO1、HO-1等[33-36]。也有研究證實，電針治療能夠通過調(diào)控NRF2信號通路改善機(jī)體的氧化應(yīng)激水平[37-38]。上述報道與本研究結(jié)果一致，造模組KEAP1蛋白和基因的表達(dá)量升高，NRF2、NQO1、HO-1蛋白和基因表達(dá)量降低；電針治療組KEAP1蛋白的表達(dá)量較造模組降低，而NRF2、NQO1、HO-1蛋白的表達(dá)量較造模組增加，其中，聯(lián)合治療組的蛋白和基因表達(dá)量較造模組變化最明顯。說明經(jīng)電針治療以后其NRF2通路上相關(guān)蛋白表達(dá)增加,其抗氧化能力也得到提升。

4 結(jié) 論

4.1電針治療通過提高腎功能、改善鈣磷代謝、提升抗氧化能力、降低腎KEAP1的表達(dá)，增加腎NRF2及其下游的抗氧化相關(guān)蛋白的表達(dá)等方面緩解犬的急性腎損傷癥狀，減輕腎損傷程度。

4.2電針與常規(guī)療法相結(jié)合的聯(lián)合治療方法對于急性腎衰竭的治療效果較好，其治療效果優(yōu)于單獨(dú)使用電針治療與單純進(jìn)行對癥治療。