孫 敏，郝 飛，張紋紋，李文良,3,4，楊蕾蕾，毛 立,2，程子龍，劉茂軍,3,4

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)部獸用生物制品工程技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210014，2.江蘇大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013; 3.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鎮(zhèn)江 212013;4.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，南京 210095)

宿主先天免疫系統(tǒng)通過模式識別受體(pattern-recognition receptors，PRRs)識別病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，激活宿主先天免疫應(yīng)答而進(jìn)入抗感染狀態(tài)[1-2]，而干擾素(IFN)介導(dǎo)的先天免疫應(yīng)答是宿主抵抗病原感染的第一道屏障，具有較強(qiáng)的抗病毒活性[1]。根據(jù)干擾素的結(jié)構(gòu)、受體的特異性和來源的細(xì)胞種類不同，干擾素被分為I型、II型及III型，其中I型干擾素包括多種類型，包括IFN-α[3-4]。目前人類及不同種屬動物中(如豬、鼠、犬、雞)均報道含有IFN-α編碼基因，且均報道存在一定的抗病毒活性[5-8]。人源重組IFN-α可抑制SARS-CoV-2及PEDV復(fù)制，且具有劑量依賴性[9-10]，豬源重組IFN-α可抑制VSV及PRV的復(fù)制[11]，而目前關(guān)于山羊源IFN-α表達(dá)特性及抗病毒活性尚不清楚，值得進(jìn)一步研究。

I型IFN是病毒感染細(xì)胞分泌的多肽，其通過激活JAK/STAT信號通路刺激下游干擾素刺激基因(ISGs)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)誘導(dǎo)感染細(xì)胞和相鄰細(xì)胞進(jìn)入抗病毒狀態(tài)，由它們調(diào)制宿主細(xì)胞的各類抗病毒效應(yīng)[12]。ISG可以正調(diào)節(jié)或負(fù)調(diào)節(jié)IFN信號，甚至直接阻斷病毒復(fù)制周期[1, 13]。大多數(shù) ISG分子，比如Mx、Viperin等IFN誘導(dǎo)蛋白可直接作為抗病毒效應(yīng)分子[14-15]，分別作用于病毒復(fù)制周期的不同階段而發(fā)揮抗病毒活性[1, 16]。

目前，養(yǎng)殖方式向集約化、規(guī)模化改變，而養(yǎng)殖條件以及防控技術(shù)的應(yīng)用情況卻參差不齊，引起呼吸道疫病為主的疫病多發(fā)，危害嚴(yán)重。山羊副流感病毒3型(CPIV3)屬于副黏病毒科呼吸道病毒屬，可引起發(fā)病羊表現(xiàn)呼吸道臨床癥狀及相應(yīng)的病理變化，其可通過氣溶膠進(jìn)行水平傳播，具有較強(qiáng)致病性[17-19]。CPIV3在感染過程中可編碼非結(jié)構(gòu)蛋白C，死病毒、未感染病毒或早期感染階段病毒含量較低的細(xì)胞裂解物中不含有該蛋白，非結(jié)構(gòu)蛋白C 的表達(dá)水平可用于評價CPIV3的增殖效率。目前針對CPIV3感染尚無有效的免疫調(diào)控策略，探究山羊IFN-α對該病毒復(fù)制的調(diào)控作用，并依據(jù)非結(jié)構(gòu)蛋白C建立相應(yīng)的免疫印跡檢測方法，為開發(fā)有效的預(yù)防和治療措施提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及病毒培養(yǎng)

MDBK細(xì)胞(牛腎細(xì)胞)購自美國模式菌種收集中心(ATCC)，由本實(shí)驗(yàn)室傳代保存。其培養(yǎng)在含10%胎牛血清(FBS，Gibco)的DMEM(北京全式金)營養(yǎng)液中，消化液為0.25%胰酶(含0.02% EDTA, Gibco)。山羊副流感病毒3型(CPIV3)由本實(shí)驗(yàn)室保存。MDBK細(xì)胞長滿單層后PBS洗滌3遍，按照MOI比值為1接種CPIV3 JS2013株第8代(P8，病毒含量為108.0TCID50·0.1 mL-1)，37 ℃孵育1 h后棄除病毒液，向細(xì)胞中添加細(xì)胞維持液(含有2% FBS的DMEM營養(yǎng)液)，待培養(yǎng)至特定時間收集細(xì)胞上清，測定TCID50，計算病毒含量。

1.2 山羊IFN-α原核表達(dá)與純化

根據(jù)GenBank中山羊IFN-α編碼蛋白的基因序列，去除其信號肽序列后，基因合成相關(guān)序列，并獲得原核表達(dá)重組載體pET-30a-gIFN-α，進(jìn)而利用熱應(yīng)激方法轉(zhuǎn)化至工程菌Rosetta (DE3)。擴(kuò)大培養(yǎng)陽性克隆菌液，IPTG(10 μmol·L-1)誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，細(xì)菌破碎、離心，培養(yǎng)上清過His鎳柱(GE)和親和純化(南京德泰生物科技有限公司)，獲得山羊IFN-α。

1.3 SDS-PAGE電泳

將相同濃度的山羊IFN-α和pET-30a表達(dá)產(chǎn)物與2×蛋白上樣緩沖液(碧云天)1∶1混合后，煮沸10 min使蛋白變性，13 000 r·min-1離心5 min，取上清加入12% SDS變性膠(金斯瑞)，200 V電泳約30 min，取蛋白膠進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色6 h后進(jìn)行脫色觀察。

1.4 Western blot

原核表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，取蛋白膠濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上(300 mA，1 h)，用含5%脫脂奶的TBST進(jìn)行封閉(37 ℃，2 h)。封閉后加入His(博士德)單克隆抗體4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次，每次10 min，再加HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體(博士德)37 ℃孵育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min。

同樣，將山羊IFN-α(1.0 μg·mL-1)孵育MDBK細(xì)胞1 d，同樣設(shè)立空白細(xì)胞對照組和陰性對照組(pET-30a表達(dá)產(chǎn)物處理組)，進(jìn)而按照MOI為1感染CPIV3 JS2013株，于感染后48 h裂解細(xì)胞并收集總蛋白。進(jìn)而將CPIV3感染后的細(xì)胞蛋白樣品按照上述方法進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)印、封閉，隨后加入CPIV3非結(jié)構(gòu)蛋白C特異性單克隆抗體5E4(本實(shí)驗(yàn)室自備)或β-actin單克隆抗體(博士德)4 ℃孵育過夜，隨后按序進(jìn)行TBST洗滌、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG抗體孵育、TBST洗滌等。最后，利用ECL 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(諾唯贊)曝光顯色后，全自動化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)(天能)采集和分析印跡膜圖像。

1.5 熒光定量PCR

山羊IFN-α(1.0 μg·mL-1)孵育MDBK細(xì)胞1 d后，利用RNAiso Plus(TaKaRa)充分裂解，利用氯仿抽提，異丙醇沉淀的方法提取細(xì)胞的總RNA。同時，設(shè)置pET-30a表達(dá)產(chǎn)物處理組為陰性對照組，脂質(zhì)體Poly(I:C)(1 μg·mL-1)轉(zhuǎn)染的MDBK細(xì)胞為陽性對照組。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒(TaKaRa)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)。按照SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)試劑盒(TaKaRa)說明書配置反應(yīng)液，并利用Applied Biosystems Step OneTMReal Time PCR System儀器使用說明書要求進(jìn)行操作。特定目的基因的反應(yīng)引物參見表1[20-21]。以細(xì)胞β-actin為內(nèi)參，根據(jù)2-△△Ct計算方法測定和比較特定目的基因的相對轉(zhuǎn)錄水平。

表1 qPCR反應(yīng)引物

1.6 山羊IFN-α對CPIV3復(fù)制的影響

MDBK細(xì)胞于前1 d胰酶消化后鋪于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37 ℃，5% CO2培養(yǎng)至長滿單層，棄除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌3遍后，利用山羊IFN-α(1.0 μg·mL-1)預(yù)處理MDBK細(xì)胞1 d，同時設(shè)立空白細(xì)胞對照組和陰性對照組(pET-30a表達(dá)產(chǎn)物處理組)。然后按照MOI為1接種CPIV3，并于接種后不同時間點(diǎn)收集細(xì)胞上清，測定病毒滴度；同時，收集細(xì)胞沉淀，利用Western blot檢測CPIV3非結(jié)構(gòu)蛋白C和β-actin表達(dá)水平。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

山羊IFN-α蛋白序列跨膜區(qū)預(yù)測：http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/。收集不同種屬的IFN-α蛋白序列(表2)，利用MegAlign軟件對基因序列對齊，利用GraphPad Prism 5軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù)的顯著性并作圖。若P<0.05，則判定為差異顯著，并用“*”標(biāo)識，若P<0.01，則判定為差異極顯著，并用“**”標(biāo)識。

表2 不同種屬IFN-α蛋白序列信息

2 結(jié) 果

2.1 山羊IFN-α蛋白序列特性分析

山羊IFN-α蛋白全長189aa，NCBI登錄號為NP_001272633.1，預(yù)期分子質(zhì)量約19.4 ku。1～18aa為信號肽，同時有一個糖基化位點(diǎn)，位于101aa。TMHMM軟件預(yù)測其存在一個跨膜區(qū)，位于7～29aa(圖1A)。序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，山羊IFN-α與山羊IFN-α-H蛋白同源性最高，同源性為96.3%，其與牛源及綿羊源IFN-α-H蛋白序列同源性分別為92.1%及93.7%，其與人源、豬源及鼠源IFN-α蛋白序列同源性較低，約為55%至70%，而其與犬源IFN-α蛋白序列同源性最低，僅有52.9%(圖1B、1C)。

A. 山羊IFN-α蛋白跨膜區(qū)分析；B. 不同種屬IFN-α蛋白序列同源性分析；C. 不同種屬IFN-α蛋白序列Clustal V對齊

2.2 山羊IFN-α原核表達(dá)、純化及鑒定

將重組質(zhì)粒pET-30a(+)-gIFN-α轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Rosetta(DE3)，IPTG誘導(dǎo)后收集菌液，超聲破碎并離心后收集上清，進(jìn)行His鎳柱和親和純化。SDS-PAGE結(jié)果顯示，在20 ku處有一明顯的條帶，條帶單一，與預(yù)期重組蛋白的相對分子質(zhì)量一致，其濃度為0.20 mg·mL-1(圖2A)；Western blot結(jié)果顯示，該重組蛋白能與His單克隆抗體發(fā)生特異性反應(yīng)(圖2B)，證明重組蛋白被成功表達(dá)。

A.山羊IFN-α表達(dá)與純化；B.Western blot鑒定山羊IFN-α。M.蛋白Marker；1. pET-30a(+)空載體；2. pET-30a(+)-gIFN-α純化產(chǎn)物

2.3 RT-qPCR檢測山羊IFN-α作用MDBK細(xì)胞后干擾素刺激因子的表達(dá)

山羊IFN-α孵育MDBK細(xì)胞后，收集細(xì)胞的RNA，RT-qPCR檢測6種ISGs的轉(zhuǎn)錄水平，同時設(shè)置陰性對照組(pET-30a表達(dá)產(chǎn)物處理組)及陽性對照組(Poly(I:C)處理組)。結(jié)果如圖3所示，山羊IFN-α孵育細(xì)胞后，干擾素刺激因子RSAD2、STAT1、MX1、MX2、ISG15及IFI6的轉(zhuǎn)錄水平均顯著上調(diào)，以RSAD2上調(diào)最明顯，表明原核表達(dá)的山羊IFN-α可以刺激細(xì)胞產(chǎn)生干擾素刺激因子(ISGs)。

**. P<0.01，下同

2.4 山羊IFN-α對CPIV3病毒滴度的影響

CPIV3 JS2013株第8代(P8)以MOI比值為1感染MDBK細(xì)胞，感染后3 d滴度達(dá)到病毒滴度峰值，約108.0TCID50·0.1 mL-1，表明CPIV3 JS2013株在MDBK細(xì)胞中可有效增殖(圖4A)。山羊IFN-α孵育MDBK細(xì)胞1 d后，以MOI比值為1感染CPIV3 JS2013株，收集感染后48及72 h的細(xì)胞培養(yǎng)上清。TCID50結(jié)果表明，與空白對照相比，pET-30a表達(dá)產(chǎn)物不影響CPIV3的復(fù)制，而山羊IFN-α處理的細(xì)胞對CPIV3復(fù)制表現(xiàn)出顯著的抑制作用。與陰性對照相比，山羊IFN-α處理組感染后48 h病毒滴度下降98.88%，感染后72 h病毒滴度下降99.47%，表明山羊IFN-α能夠在體外顯著抑制CPIV3對MDBK細(xì)胞的感染能力(圖4B)。

A. CPIV3在MDBK細(xì)胞中生長曲線； B. 山羊IFN-α抑制CPIV3在MDBK細(xì)胞中增殖

2.5 山羊IFN-α對CPIV3病毒非結(jié)構(gòu)蛋白C表達(dá)的影響

山羊IFN-α孵育MDBK細(xì)胞1 d后，以MOI比值為1感染CPIV3 JS2013株，收集感染后48 h的細(xì)胞沉淀，同時設(shè)置空白細(xì)胞對照組及陰性對照組(pET-30a表達(dá)產(chǎn)物處理組)。Western blot結(jié)果表明，與病毒滴度結(jié)果相一致，山羊IFN-α顯著下調(diào)CPIV3非結(jié)構(gòu)蛋白C的表達(dá)(圖5)。

A. Western blot分析山羊IFN-α對CPIV3非結(jié)構(gòu)蛋白C表達(dá)水平；B. CPIV3非結(jié)構(gòu)蛋白C與內(nèi)參β-actin間灰度值比

3 討 論

干擾素(IFN)是細(xì)胞分泌的一種重要的抗病毒因子[22-23]，目前I型IFN已報道有9個亞型，其中IFN-α 的抗病毒活性最強(qiáng)[24-25]。山羊IFN-α孵育MDBK細(xì)胞后，可顯著刺激RSAD2、STAT1、MX1、MX2、ISG15及IFI6等6種ISGs的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，其分別編碼Viperin、STAT1、MX1、MX2、ISG15及IFI6蛋白。其中STAT1是JAK/STAT通路中關(guān)鍵銜接蛋白，而Viperin、MX1、MX2、ISG15及IFI6已報道可顯著抑制CPIV3在MDBK細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制能力[21, 26]，說明山羊IFN-α通過誘導(dǎo)多種抗病毒蛋白的轉(zhuǎn)錄表達(dá)而從病毒增殖的不同階段抑制CPIV3感染過程。

在針對CPIV3對山羊IFN-α抗病毒效應(yīng)敏感性的研究中，本試驗(yàn)試圖尋求一種快速、基于抗體的病毒生長檢測方法。副黏病毒的P基因編碼形成相應(yīng)P蛋白及其他多種非結(jié)構(gòu)蛋白[18, 27-28]，其中非結(jié)構(gòu)蛋白是副黏病毒在感染過程中產(chǎn)生的編碼產(chǎn)物，其是否表達(dá)可有效區(qū)別活病毒與死病毒，其表達(dá)水平能真實(shí)反映病毒在感染細(xì)胞內(nèi)的的復(fù)制能力[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，山羊IFN-α孵育1 d后可顯著下調(diào)CPIV3非結(jié)構(gòu)蛋白C的表達(dá)水平，其結(jié)果與病毒滴度變化趨勢相一致，進(jìn)一步證實(shí)山羊IFN-α對CPIV3復(fù)制具有抑制能力。

干擾素作為一種廣譜的抗病毒因子，許多病毒進(jìn)化出不同策略拮抗JAK/STAT通路抑制下游ISGs的轉(zhuǎn)錄激活。已有研究表明，CPIV3感染宿主細(xì)胞后再添加山羊IFN-α，其不具有抗病毒效應(yīng)[20]。而本研究將山羊IFN-α提前孵育細(xì)胞后再感染CPIV3，發(fā)現(xiàn)其具有顯著的抗病毒效應(yīng)，提示山羊IFN-α對CPIV3感染具有預(yù)防效應(yīng)而不具有治療效應(yīng)，指示在防控CPIV3感染過程中山羊IFN-α的給藥時機(jī)至關(guān)重要。

血清學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)，CPIV3在山羊及綿羊群體內(nèi)感染率較高，其中青海及甘肅地區(qū)的抗體陽性率高達(dá)70%以上，且其可通過氣溶膠傳播，引起感染動物呼吸道疾病，而目前針對該病原尚無有效的防治策略[19, 30-31]，應(yīng)給予重視并采取以預(yù)防為主的措施。本研究發(fā)現(xiàn)，原核表達(dá)的山羊IFN-α孵育MDBK細(xì)胞后，可顯著抑制CPIV3的體外復(fù)制，提示其對CPIV3具有較好的預(yù)防作用。同時，山羊IFN-α編碼基因與牛、綿羊等反芻動物的同源基因間同源性達(dá)到90%以上，而山羊IFN-α對其他反芻動物疫病病原在體外復(fù)制的影響尚不明確，進(jìn)一步探索其作為一種廣譜的抗病毒分子的潛能具有較大的臨床意義。

4 結(jié) 論

本研究通過原核表達(dá)系統(tǒng)制備的山羊IFN-α，其孵育MDBK細(xì)胞可增強(qiáng)ISGs的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，顯著抑制CPIV3的復(fù)制及非結(jié)構(gòu)蛋白C的表達(dá)，為后續(xù)CPIV3的防治提供理論基礎(chǔ)，并擴(kuò)展了動物源I型干擾素的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和研究資料。