張攀揚(yáng)，何明敏，曾園媛，蔡雄偉

1重慶市婦幼保健院（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院）婦產(chǎn)科，重慶 401147；2陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶400038

2020年，全球卵巢癌（OC）新發(fā)病例313 959例，死亡207 252人，在6種女性癌癥中死亡人數(shù)排名第3。高級(jí)別漿液性卵巢癌（HGSOC）是卵巢癌最常見和具有侵襲性的亞型，占卵巢癌亞型的67.5%［1］。由于早期HGSOC沒有特征性癥狀，通常在晚期被診斷。盡管手術(shù)和系統(tǒng)治療的不斷改進(jìn)和發(fā)展，OC患者的死亡率僅略有下降。大約50%的HGSOC 通過同源重組(HR)表現(xiàn)出潛在的DNA修復(fù)缺陷，并且對(duì)雙鏈斷裂誘導(dǎo)劑如鉑類似物和PARP抑制劑（PARPi）高度敏感［2］。然而，盡管一線鉑基化療使約70%OC 患者的臨床完全緩解，但超過70%的患者在治療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)，此時(shí)該病對(duì)后續(xù)治療的反應(yīng)較差［3］。同樣，盡管在HR缺陷的HGSOC中，超過80%最初對(duì)PARPi反應(yīng)良好，但隨著獲得性耐藥的發(fā)生，預(yù)后仍不盡如人意，5年生存率僅為35%～45%［4］。與其他腫瘤相比，HGSOC缺乏有效的分子靶向治療。因此，迫切需要識(shí)別HGSOC進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵分子靶標(biāo)，是改善診斷和預(yù)后的關(guān)鍵。

對(duì)高?；颊哌M(jìn)行分類有助于闡明疾病的發(fā)病機(jī)制，在之前的研究中，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組分析將HGSOC分為分化型、間充質(zhì)型、免疫反應(yīng)型和增殖型4個(gè)亞型［5］。這四種亞型的生存期沒有顯著差異，復(fù)發(fā)也沒有討論。同時(shí)，基因表達(dá)的異質(zhì)性和基因間的協(xié)同或相互作用仍是分類的障礙。因此，需要一種新的分類方法，將HGSOC分成與復(fù)發(fā)相關(guān)的亞型，以便尋找這些亞型中的關(guān)鍵分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

大部分人類基因組被轉(zhuǎn)錄成非編碼RNA，蛋白質(zhì)編碼的基因組不到2%［6］。MiRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22 個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，在真核生物中參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。MiRNA在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲等方面具有豐富的生物學(xué)效應(yīng)，在癌癥的發(fā)生、轉(zhuǎn)移和治療耐藥性中發(fā)揮著重要作用［7］。據(jù)報(bào)道，miR-10b、miR-125b和miR-145在腫瘤發(fā)展過程中下調(diào)，而miR-21和miR-155則上調(diào)，分別作為抑癌基因和癌基因發(fā)揮作用［8］。而在卵巢癌中，miR-363-3p-SPOCΚ2軸參與了肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)，促進(jìn)了卵巢癌的分期進(jìn)展［9］；miR-424-5p可通過靶向ACSL4消除卵巢癌細(xì)胞的鐵死亡［10］；miRNA-584通過負(fù)向調(diào)節(jié)LPIN1抑制卵巢癌的進(jìn)展［11］。雖然已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有多個(gè)miRNAs參與HGSOC的發(fā)病機(jī)制，然而，在卵巢癌中與復(fù)發(fā)相關(guān)的miRNAs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)還沒有被報(bào)道。

本研究從腫瘤基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫下載HGSOC轉(zhuǎn)錄組RNA-seq和臨床相關(guān)數(shù)據(jù)，通過生信分析將HGSOC分成與復(fù)發(fā)相關(guān)的兩種亞型，并根據(jù)兩種亞型中的差異基因構(gòu)建一個(gè)由5 個(gè)miRNAs 和41 個(gè)mRNAs組成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，其中miR-506-3p表達(dá)差異最顯著。然而，miR-506-3p是否參與HGSOC的EMT及復(fù)發(fā)，目前尚不清楚。因此，本研究通過探討miR-506-3p對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移、侵襲和EMT的影響，明確miR-506-3p 在HGSOC 復(fù)發(fā)中的作用。以期為探索HGSOC 中復(fù)發(fā)的具體機(jī)制提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為后續(xù)HGSOC的早期診斷和治療提供新的分子靶點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)收集

使用R包TCGA Biolinks從TCGA數(shù)據(jù)庫下載354例HGSOC患者的RNA-Seq原始數(shù)據(jù)和臨床信息［12］，GO_BP基因集和癌癥標(biāo)志基因集（Hallmark gene sets）從MSigDB 數(shù)據(jù)庫收集（version 7.1）。GSE25204 和GSE73582 用于驗(yàn)證miRNA 表達(dá)與卵巢癌復(fù)發(fā)的相關(guān)性。

1.2 計(jì)算基因富集分?jǐn)?shù)

基因計(jì)數(shù)用DESeq2［13］和log2轉(zhuǎn)換后進(jìn)行歸一化處理，濾除平均表達(dá)量低于5的基因。在R中使用基因集變異分析(GSVA)方法估算歸一化計(jì)數(shù)后得到每個(gè)樣本的GO基因集富集分?jǐn)?shù)。

1.3 與復(fù)發(fā)相關(guān)的HGSOC亞型分類

對(duì)GO_BP基因集和疾病無進(jìn)展期的7530個(gè)富集分?jǐn)?shù)進(jìn)行COX單因素回歸分析，保留復(fù)發(fā)相關(guān)基因集（P＜0.05）。使用非負(fù)矩陣分解（NMF）方法根據(jù)復(fù)發(fā)相關(guān)基因集的富集分?jǐn)?shù)對(duì)HGSOC患者進(jìn)行分類，該方法由R包CancerSubtypes［14］提供。聚類數(shù)（Κ）由最大平均輪廓值選擇。

通過R包limma［15］識(shí)別具有差異富集分?jǐn)?shù)的GO_BP基因路徑(adj.p＜0.001)和差異表達(dá)基因（adj.p＜0.05和|log fold change|＞1）。使用R包c(diǎn)lusterProfiler對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行HALLMARΚ富集分析［16］，基因集從MSigDB數(shù)據(jù)庫下載。通過Pearson相關(guān)性檢驗(yàn)計(jì)算miRNA與靶向差異表達(dá)基因的相關(guān)性，miRWalk 2.0預(yù)測(cè)miRNA靶向基因［17］。

1.4 MiRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用Cytoscape 軟件（v3.6.0）構(gòu)建miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 細(xì)胞培養(yǎng)

人卵巢癌細(xì)胞株（SΚOV3和CAOV3）由本實(shí)驗(yàn)室保存。SΚOV3 和CAOV3 細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（Gibco）中培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染，RNA提取和RT-qPCR

miR-506-3p mimics和inhibitor購自上海吉瑪醫(yī)藥科技有限公司。mimics-NC（miR-NC）和inhibitor-NC（in-NC）作為對(duì)照。SNAI2 siRNA（si-SNAI2-1#GCA GACAGGTCAAATCTGA,si-SNAI2-2# GCAGACC CATTCTGATGTA,si-SNAI2-3# GCACAAACATGA GGAATCT）購買自廣州瑞博生物科技有限公司。所有轉(zhuǎn)染均使用LipoFiterTM3.0 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（漢恒生物）?？俁NA 使用Trizol（TAΚARA）法提取，用Nanodrop 2000（Thermo）分光光度計(jì)檢測(cè)RNA質(zhì)量及濃度，使用PrimeScript RT試劑盒（Takara）將1000 ng總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)條件設(shè)置為：預(yù)變性95 ℃30 s，變性95 ℃5 s、退火58 ℃30 s及延伸72 ℃5 s，共40 個(gè)循環(huán)，在Bio-Rad CFX96（Bio-Rad）系統(tǒng)上使用SYBR Premix Ex TaqTM試劑（TAΚARA）進(jìn)行RT-qPCR分析，采用2-ΔΔCt法分析miRNA和mRNA的相對(duì)定量數(shù)據(jù)，U6和GAPDH作為各自的內(nèi)參。

1.7 劃痕實(shí)驗(yàn)

將做相應(yīng)處理后的卵巢癌細(xì)胞SΚOV3和CAOV3分別接種于6孔板中，每孔接種5×106個(gè)細(xì)胞，設(shè)置3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。37 ℃5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%左右時(shí)，用滅菌的10 μL槍頭垂直于板的中間劃痕，PBS洗去掉落的細(xì)胞，換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，并分別在0 h和24 h時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞并拍照。

1.8 Transwell 分析

事先鋪好基質(zhì)膠，將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞分別取2×104細(xì)胞接種于上室，加入300 μL無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，在下室中加入800 μL完全培養(yǎng)基，置于37 ℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別設(shè)置3個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。培養(yǎng)36 h后取出小室，使用棉簽擦拭小室內(nèi)部，使用結(jié)晶紫染色10 min。然后用PBS洗滌細(xì)胞，用光學(xué)顯微鏡計(jì)數(shù)。

1.9 Western blotting

使用含1%蛋白酶抑制劑的RIPA蛋白裂解液4 ℃裂解細(xì)胞30 min，14 000 r/min，4 ℃離心30 min。收集上清，使用BCA 蛋白定量試劑盒（碧云天）檢測(cè)蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液，同樣量（30 μg）的蛋白經(jīng)SDS-PAGE 分離，用Trans-Blot Turbo 快速轉(zhuǎn)移膜儀（Bio-rad）將其轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%牛奶封閉2 h，然后與抗SNAI2（1∶1000）（Proteintech，12129-1-AP）和GAPDH（1∶2000）（Proteintech，60004-1-Ig）一 抗4 ℃孵育過夜。HRP 標(biāo)記的山羊抗兔和山羊抗鼠二抗（1∶5000）室溫孵育1.5 h，最后，用ECL 發(fā)光液（Millipore）檢測(cè)灰度值。

1.10 雙熒光素酶報(bào)告基因

通過PCR擴(kuò)增SNAI2-3'UTR區(qū)域，然后克隆到熒光素酶報(bào)告載體pmirGLO（Promega）中，包括SNAI2-3'UTR WT 組，SNAI2-3'UTR Mut 組，根 據(jù)Dual-Glo 螢光素酶檢測(cè)試劑盒（Promega，E2920）說明書，檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 5.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 通過對(duì)通路活性的聚類鑒定出兩種與復(fù)發(fā)相關(guān)的HGSOC亞型

非監(jiān)督方法NMF分析結(jié)果得到C1（n=191）和C2（n=163）兩個(gè)子類型（圖1A、B），比較臨床分期、分級(jí)、年齡和腫瘤殘留分布，C1和C2患者無明顯偏差（表1），而C1組的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)明顯高于C2組（圖1C）。

表1 354例HGSOC患者的臨床特點(diǎn)及分布Tab.1 Clinical characteristics and distribution of 354 HGSOC patients

圖1 根據(jù)GO項(xiàng)的富集分?jǐn)?shù)，采用NMF聚類方法識(shí)別亞型Fig.1 HGSOC subtypes identified by NMF clustering based on enrichment scores of GO terms.A:Similarity matrix of clusters under cluster number(K)from 2 to 5.B:Average sihouette widths under different K(2,3,4,5)for selecting the optimal K,and K=2 meets the highest average sihoutte width.C:HGSOC patients were divided into two clusters,C1 and C2.The survival plots illustrate recurrence associated with NMF clusters.The P values are determined by log-rank test.

2.2 HGSOC 亞型中差異表達(dá)的mRNAs 和miRNAs的鑒定

在C1和C2兩種HGSOC亞型中共有645個(gè)表達(dá)差異顯著的mRNAs（|log2FC|＞1;adj.p＜0.05），其中616個(gè)上調(diào)，29個(gè)下調(diào)（圖2A、B）；以及47個(gè)差異表達(dá)顯著的miRNAs（adj.p＜0.05，|log2 FC|＞0.5）其中18個(gè)miRNAs在C1 組 中 下 調(diào)，29 個(gè)miRNAs 上 調(diào)（圖2C）。HALLMARΚ通路富集分析結(jié)果顯示，主要富集在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）信號(hào)通路（圖2D）。

圖2 C1和C2患者間的差異表達(dá)基因與EMT相關(guān)Fig.2 Differentially expressed genes between C1 and C2 subtypes of HGSOC are related with EMT.A: Heat map of the differentially expressed mRNAs between C1 and C2.B:Volcano map of the differentially expressed mRNAs between C1 and C2.C: Volcano map of the differentially expressed miRNAs between C1 and C2.D: The differentially expressed genes are significantly enriched in"HALLMARK EPITHELIALMESENCHYMALTRANSITION".

2.3 與HGSOC 復(fù)發(fā)相關(guān)的關(guān)鍵miRNA-mRNA 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

分析兩個(gè)數(shù)據(jù)集GSE25204、GSE73582中差異表達(dá)的miRNAs，GSE25204 得到16 個(gè)表達(dá)差異顯著的miRNAs（adj.p＜0.05，|log2 FC|＞0.5）；而在GSE73582中有39 個(gè)表達(dá)差異顯著的miRNAs（adj.p＜0.05，|log2 FC|＞0.5），其中25個(gè)上調(diào)，14個(gè)下調(diào)。3個(gè)數(shù)據(jù)集中沒有共同上調(diào)的miRNAs，而有5個(gè)共同下調(diào)的miRNAs，分別是miR-508-3p、miR-509-3-5p、miR-506-3p、miR-508-5p、miR-513c-5p（圖3A、B）。接著使用miRWalk數(shù)據(jù)庫對(duì)5個(gè)miRNAs進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)，去除重復(fù)靶向的mRNAs后，共得到10494個(gè)mRNAs。由于C1與C2差異表達(dá)的mRNAs主要富集在EMT通路，因此我們將數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)得到的靶mRNAs與在C1和C2中差異表達(dá)EMT 通路中的mRNAs 取交集，共獲得了41 個(gè)mRNAs，利用這5個(gè)miRNAs和41個(gè)mRNAs構(gòu)建出與HGSOC復(fù)發(fā)相關(guān)的關(guān)鍵miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)（圖3C）。

圖3 miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)Fig.3 The miRNA-mRNA network.A,B:The common miRNAs in the 3 datasets.C:The miRNA-mRNA network,in which blue indicates mRNAs and purple miRNAs.

2.4 MiR-506-3p調(diào)控卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲

在這5個(gè)miRNAs中，miR-506-3p表達(dá)差異最大（表2）。RT-qPCR結(jié)果顯示，mimics顯著上調(diào)miR-506-3p的表達(dá)，而inhibitor顯著下調(diào)了miR-506-3p的表達(dá)（P＜0.001，圖4A）。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過表達(dá)miR-506-3p后抑制了SΚOV3及CAOV3的遷移，而敲低miR-506-3p后SΚOV3及CAOV3的遷移能力增強(qiáng)（P＜0.01，圖4B）。同樣，Transwell 實(shí)驗(yàn)顯示miR-506-3p 抑制了SΚOV3及CAOV3的侵襲能力，而敲低miR-506-3p后SΚOV3及CAOV3的侵襲能力變強(qiáng)（P＜0.01，圖4C）。

圖4 MiR-506-3p調(diào)控SΚOV3和CAOV3細(xì)胞遷移和侵襲Fig.4 MiR-506-3p regulates SKOV3 and CAOV3 cell migration and invasion.A:Expression of miR-506-3p detected by qRT-PCR.B,C: Wound healing assay (Original magnification:×50) and Transwell assay (×100) demonstrate that miR-506-3p regulates SKOV3 and CAOV3 cell migration and invasion.Data are presented as Mean±SD.**P＜0.01,***P＜0.001.

表2 TCGA數(shù)據(jù)庫中5個(gè)miRNAs的表達(dá)水平Tab.2 Expression levels of 5 miRNAs in TCGAdatabase

2.4 MiR-506-3p 通過SNAI2 調(diào)控卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲

根據(jù)correlation coefficient 值挑選出miRNAmRNA網(wǎng)絡(luò)中miR-506-3p靶基因前五的mRNAs進(jìn)行驗(yàn)證（表3），RT-qPCR結(jié)果顯示在CAOV3和SΚOV3中過表達(dá)及敲低miR-506-3p后SNAI2表達(dá)差異最顯著（P＜0.05，圖5A～E）；Western blot 結(jié)果顯示，miR-506-3p mimics抑制了SNAI2蛋白表達(dá)，而沉默miR-506-3p后促進(jìn)了SNAI2蛋白表達(dá)（圖5F）。以上結(jié)果說明在SΚOV3 和CAOV3 中miR-506-3p 有可能通過調(diào)控SNAI2表達(dá)影響細(xì)胞遷移、侵襲和EMT等過程。雙熒光素酶結(jié)果顯示，miR-506-3p顯著降低SNAI2-WT組的熒光素酶活性（P＜0.001），但對(duì)突變組無明顯影響（圖6A）。此外，商業(yè)化合成SNAI2的3個(gè)siRNA（si-SNAI21#、2#和3#），RT-qPCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，si-SNAI2-2#和si-SNAI2-3#顯著抑制了SNAI2的表達(dá)（P＜0.001，圖6B、C）。因此，si-SNAI2-2#和si-SNAI2-3#被用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。重要的是，劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell 分析的數(shù)據(jù)顯示，沉默SNAI2 逆轉(zhuǎn)了miR-506-3p 對(duì)SΚOV3 和CAOV3 遷移和侵襲的抑制作用（P＜0.05，圖6D、E）。

圖5 MiR-506-3p調(diào)控SΚOV3和CAOV3細(xì)胞中差異基因的表達(dá)Fig.5 MiR-506-3p regulates the expression of differentially expressed genes in CAOV3 and SKOV3 cells.A-E: Expressions of differentially expressed genes detected by qRT-PCR.F:Western blotting for detecting the expression of SNAI2.Data are presented as Mean±SD.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

圖6 MiR-506-3p通過SNAI2促進(jìn)CAOV3和SΚOV3的細(xì)胞遷移和侵襲過程Fig.6 MiR-506-3p promotes EMT in CAOV3 and SKOV3 cells via SNAI2.A:Luciferase activity assay confirming binding of miR-506-3p to SNAI2 3'UTR.B,C: SNAI2 knockdown by si-SNAI2-2# and si-SNAI2-3#.D,E: Wound healing assay (×50) and Transwell assay(×100)demonstrate that SNAI2 knockdown attenuates the migration-promoting effects of miR-506-3p inhibitor in CAOV3 and SKOV3 cells.Data are presented as Mean±SD.*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001.

表3 miR-506-3p相關(guān)系數(shù)前5的mRNAsTab.3 Top 5mRNAs with the high correlation coefficients with miR-506-3p

3 討論

高級(jí)別漿液性卵巢癌是最常見的卵巢癌亞型，預(yù)后差。盡管患者在最初的治療后能夠完全緩解，但是腫瘤卻長(zhǎng)期復(fù)發(fā)。然而，復(fù)發(fā)的機(jī)制尚不清楚［18］。由于腫瘤病人具有高度的異質(zhì)性，根據(jù)分子水平的差異來確定亞型需要大量的樣本。在本研究中，我們將轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為基因功能富集組，以便于我們鑒別亞型。使用與復(fù)發(fā)相關(guān)的基因集進(jìn)行聚類，從而獲得預(yù)后不同的亞型，進(jìn)而揭示復(fù)發(fā)的潛在機(jī)制。

EMT是指上皮腫瘤細(xì)胞失去黏附能力獲得間充質(zhì)細(xì)胞遷移侵襲的能力以促進(jìn)轉(zhuǎn)移和耐藥性的過程，在癌癥復(fù)發(fā)中發(fā)揮重要作用［19,20］。在乳腺癌、肺癌及胰腺癌等多種腫瘤疾病中報(bào)道稱EMT是常規(guī)化療耐藥的關(guān)鍵過程［21］。在本研究中，我們主要關(guān)注HGSOC的復(fù)發(fā)及其潛在的機(jī)制。根據(jù)復(fù)發(fā)相關(guān)功能基因集富集評(píng)分將患者分為兩組，進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，參與富集得分的核心基因被顯著富集在EMT通路，122個(gè)基因中有41個(gè)參與了EMT。既往研究表明miR-513a-3p表達(dá)下調(diào)后能通過調(diào)控EMT促進(jìn)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，且能導(dǎo)致順鉑治療后復(fù)發(fā)的卵巢癌患者預(yù)后不良［22］；miRNA-199b-3p通過靶向ZEB1的CHΚ1/E-cadherin/EMT信號(hào)通路抑制卵巢癌的生長(zhǎng)和進(jìn)展［23］；miR-200c通過調(diào)節(jié)EMT調(diào)控卵巢癌遷移和侵襲［24］。這些結(jié)果顯示EMT是HGSOC復(fù)發(fā)的一個(gè)重要調(diào)控因素，且受到miRNA的調(diào)控。

MiRNA對(duì)疾病的調(diào)控通常是一個(gè)復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究顯示，通過生信分析構(gòu)建對(duì)胰腺癌預(yù)后具有顯著的預(yù)測(cè)價(jià)值的ceRNA網(wǎng)絡(luò)［25］；Chen等［26］分析鑒定了與膀胱癌相關(guān)的關(guān)鍵circRNA-miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；Li 等［27］揭示了卵巢癌中的關(guān)鍵miRNA-mRNA表達(dá)譜。但是，這些研究?jī)H分析了與疾病相關(guān)的分子網(wǎng)絡(luò)，少有研究分析在HGSOC中與復(fù)發(fā)相關(guān)的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。利用TCGA及GEO數(shù)據(jù)集分析與復(fù)發(fā)相關(guān)的兩類亞型中的差異表達(dá)基因，我們構(gòu)建了一個(gè)由5個(gè)miRNA和41個(gè)mRNA組成的與HGSOC復(fù)發(fā)相關(guān)的miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，因miR-506-3p表達(dá)差異最大，提示可能是更好的靶點(diǎn)，因此選擇該基因做進(jìn)一步分析。

研究表明miR-506-3p通過負(fù)向調(diào)控MTMR6的表達(dá)，抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖［28］；miR-506-3p通過靶向SIRT1/AΚT/FOXO3a信號(hào)通路抑制卵巢癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡［29］。本研究中過表達(dá)miR-506-3p后，卵巢癌細(xì)胞遷移及侵襲能力減弱，而敲低miR-506-3p后，卵巢癌細(xì)胞遷移及侵襲能力增強(qiáng)。接著對(duì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中miR-506-3p的靶基因進(jìn)行驗(yàn)證，其中SNAI2表達(dá)差異最為顯著。SNAI2是與EMT密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，研究顯示SNAI2可通過抑制miR-222-3p的轉(zhuǎn)錄活性和上調(diào)PDCD10的表達(dá)來誘導(dǎo)EMT［30］；SNAI2可能通過調(diào)節(jié)GSΚ-3β/β-catenin通路促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移、血管生成和干細(xì)胞生長(zhǎng)［31］；SNAI2能促進(jìn)口腔鱗狀細(xì)胞癌的EMT和細(xì)胞干細(xì)胞形成［32］。挽救實(shí)驗(yàn)顯示，敲低SNAI2后，逆轉(zhuǎn)了過表達(dá)miR-506-3p對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響。通過利用雙熒光素酶報(bào)告檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-506-3p與SNAI2 3'UTR區(qū)結(jié)合。以上結(jié)果提示miR-506-3p可能通過抑制SNAI2表達(dá)，調(diào)控卵巢癌細(xì)胞EMT，進(jìn)而影響卵巢癌的發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本研究利用TCGA及GSE數(shù)據(jù)集，根據(jù)復(fù)發(fā)相關(guān)功能基因集富集評(píng)分將患者分為兩組，查找與復(fù)發(fā)相關(guān)的差異基因。構(gòu)建與復(fù)發(fā)相關(guān)的EMT miRNA-mRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。其中，miR-506-3p差異最顯著，且miR-506-3p 可以通過調(diào)控SNAI2 抑制卵巢癌細(xì)胞遷移和侵襲的能力，并影響卵巢癌細(xì)胞的EMT 過程，提示miR-506-3p 異常降低可能是參與卵巢癌復(fù)發(fā)的重要機(jī)制之一。為進(jìn)一步理解HGSOC復(fù)發(fā)的機(jī)制和找到潛在分子治療靶點(diǎn)奠定了理論基礎(chǔ)。但是本研究?jī)H探討了miRNA-mRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中差異最顯著的miR-506-3p 和SNAI2，對(duì)于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的其他miRNA 及mRNA 如何影響卵巢癌發(fā)生發(fā)展還需進(jìn)一步研究。