丁虹芳，李肖娟，周璐煒，崔 智，蒙海德，王 娟

桂林醫(yī)學(xué)院1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2藥學(xué)院，3生物技術(shù)學(xué)院，廣西 桂林541199

結(jié)直腸癌（CRC）是世界上最常見的惡性腫瘤之一［1］，也是癌癥相關(guān)死亡的主要原因［2］。盡管近年來手術(shù)技術(shù)、化療和分子靶向藥物的進(jìn)展改善了CRC患者的預(yù)后，但它在全球所有癌癥相關(guān)死亡中排名第4［3］，約有一半的CRC患者死于腫瘤轉(zhuǎn)移［4］。雖然已有報道稱抑癌基因和癌基因的異常改變驅(qū)動結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展［5］，但結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制的確切分子機(jī)制，特別是遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，尚不明確［6］。因此，尋找結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的潛在治療靶點和分子機(jī)制對臨床治療具有重要意義。

富含酸性亮氨酸的核磷酸化蛋白-32a（ANP32A）也稱為假定的HLA相關(guān)蛋白I（IPHAPI）或PP32［5］，是屬于酸性核酸家族，在進(jìn)化上相對保守的一種蛋白［7］，調(diào)節(jié)細(xì)胞信號傳導(dǎo)和基因表達(dá)，主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架、細(xì)胞黏附、神經(jīng)元發(fā)育或小腦形態(tài)發(fā)生等。早期認(rèn)為ANP32A 是一種腫瘤抑制因子［7,8］，近來有文獻(xiàn)表明ANP32A能促進(jìn)白血病細(xì)胞及口腔鱗癌的增殖［9,10］，靶向ANP32A 的小肽TAT-H3BP可能是急性髓細(xì)胞白血病治療的一種新策略［11］。我們前期也發(fā)現(xiàn)ANP32A在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，抑制其表達(dá)能抑制結(jié)直腸癌的增殖［12］，且與腫瘤分化程度密切相關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)敲除ANP32A顯著降低了口腔鱗狀細(xì)胞癌遷移和侵襲能力，可能是評估口腔癌患者預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物［10］。Tian 等［13］發(fā)現(xiàn)ANP32A 能促進(jìn)肝癌的增殖與侵襲遷移。雖然我們的數(shù)據(jù)和別人的報道都顯示ANP32A在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，下調(diào)ANP32A能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，但是ANP32A對結(jié)直腸癌侵襲遷移能力是否有影響尚無報道。

AΚT，也被稱為蛋白激酶B（PΚB），是絲氨酸/蘇氨酸激酶，是生長因子誘導(dǎo)細(xì)胞存活的關(guān)鍵介質(zhì)［14］，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、增殖、生存、凋亡、血管生成等［15］。AΚT的活化參與腫瘤的侵襲遷移，是預(yù)防和治療轉(zhuǎn)移性腫瘤的潛在靶點［16］。有研究證明AΚT活化參與結(jié)直腸癌侵襲與遷移能力的調(diào)控［17,18］。我們前期實驗發(fā)現(xiàn)下調(diào)ANP32A能抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖與AΚT活性相關(guān)［12］，但是目前關(guān)于ANP32A是否調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌侵襲遷移，以及該作用是否與AΚT的活性有關(guān)尚無報道。本研究擬探討ANP32A對結(jié)直腸癌細(xì)胞系侵襲遷移的影響及其與AΚT活性的關(guān)系，以期尋找到治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的潛在新靶點。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 本實驗所用人結(jié)直腸癌HCT116 和SW480細(xì)胞為本課題組傳代保存。

1.1.2 試劑與儀器 胎牛血清（CLΛRΚ）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco）；Transwell小室（廣州JET BIOFIL）；基質(zhì)膠（corning）；噻唑藍(lán)（MTT，北京索萊寶科技有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，廣東西隴化工有限公司）；SC79（GLPBIO）；MΚ2206（Selleckchem）；RIPA強(qiáng)裂解液（上海碧云天生物科技有限公司）；β-actin（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；AΚT、MTDH單克隆抗體（Abcam）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG二抗（北京依瑪博科技有限公司）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（Thermo Fisher Scientific）；ECL化學(xué)發(fā)光試劑（合肥Bio sharp）；二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱（Eppendorf）；生物安全柜（ESCO）；酶標(biāo)儀（TECAN）；蛋白電泳系統(tǒng)、蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（Bio-Rad）；臺式低速離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；小型高速離心機(jī)（Eppendorf）；高速冷凍離心機(jī)、細(xì)胞計數(shù)儀（Thermo Fisher Scientific）；凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）。

1.2 方法

1.2.1 藥物配制及干預(yù) AΚT激活劑SC79用DMSO配制成濃度為50 mmol/L母液，AΚT抑制劑MΚ2206用DMSO配制成濃度為20 mmol/L母液，實驗時根據(jù)實驗所需濃度用培養(yǎng)基稀釋，現(xiàn)配現(xiàn)用。進(jìn)行細(xì)胞增殖實驗分析時，SC79和MΚ2206的處理時間為24、48和72 h；進(jìn)行侵襲遷移以及收集細(xì)胞沉淀進(jìn)行Western blotting分析時二者的處理時間均為48 h。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng) HCT116結(jié)直腸癌細(xì)胞用DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 g/L）在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞融合度為80%以上時使用含EDTA胰蛋白酶消化傳代，2 d傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 由公司設(shè)計ANP32A shRNA（sh-ANP32A）及其空載體質(zhì)粒（sh-NC），利用ANP32A沉默質(zhì)粒和慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染24 h與48 h收集上清，獲得慢病毒。使用收集的上清感染HCT116 和SW480 細(xì)胞，從而構(gòu)建ANP32A 沉默（sh-ANP32A）和空載質(zhì)粒（sh-NC）的穩(wěn)定細(xì)胞系。

1.2.4 MTT 檢測細(xì)胞增殖 將對數(shù)生長期的sh-ANP32A、sh-NC及Control的HCT116和SW480細(xì)胞，按2000細(xì)胞/孔接種至96孔板中，在給予藥物處理24、48及72 h用酶標(biāo)儀檢測光密度值（A值）。用酶標(biāo)儀檢測前每孔加入20 μL MTT，放入培養(yǎng)箱孵育4 h后，吸去孔內(nèi)全部溶液，加入二甲基亞砜溶液（DMSO），待甲臜完全溶解后，用酶標(biāo)儀檢測A490。

將對數(shù)生長期的HCT116和SW480細(xì)胞分為對照組，SC79 組與MΚ2206 組，其中SC79 的給藥濃度為2 μmol/L，MΚ2206 的給藥濃度為5 μmol/L，按每孔2000個細(xì)胞接種至96孔板中，在給予藥物處理24、48、72及96 h。用酶標(biāo)儀檢測前每孔加入20 μL MTT，放入培養(yǎng)箱孵育4 h后，吸去孔內(nèi)全部溶液，加入二甲基亞砜溶液（DMSO），待甲臜完全溶解后，用酶標(biāo)儀檢測A490。

1.2.5 劃痕實驗檢測細(xì)胞遷移能力 將對數(shù)生長期已轉(zhuǎn)染成功的sh-NC與sh-ANP32A細(xì)胞，胰酶消化離心，然后按照細(xì)胞匯合度為70%接種于六孔板中，放置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁達(dá)到95%以上，用200 μL槍頭進(jìn)行劃痕，用PBS清洗脫落的細(xì)胞，加入新的培養(yǎng)基，于倒置顯微鏡下觀察拍照，拍照時間記為0 h，隨后在劃痕成功的sh-NC 與sh-ANP32A 細(xì)胞中分別給予SC79 和MΚ2206，將六孔板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后繼續(xù)進(jìn)行拍照，利用Image J軟件計算劃痕面積。此實驗分組為sh-NC、sh-NC+SC79、sh-ANP32A、sh-ANP32A+SC79，sh-NC、sh-NC+MΚ2206、sh-ANP32A、sh-ANP32A+MΚ2206。

1.2.6 Transwell檢測細(xì)胞侵襲能力 提前將基質(zhì)膠放置4 ℃解凍，用DMEM（不含胎牛血清）按1∶8稀釋基質(zhì)膠，每孔加入30 μL稀釋好的基質(zhì)膠，37 ℃培養(yǎng)箱中放置4 h后進(jìn)行實驗。收集饑餓24 h后的實驗組細(xì)胞，1000 r/min，5 min離心后，進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，按每孔3×105個細(xì)胞接種在Transwell小室上室體積為200 μL，下室依照不同實驗添加600 μL DMEM（含10%胎牛血清）或600 μL加藥培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）。6 h后加入SC79和MΚ2206，然后在37 ℃，5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，用4%多聚甲醛固定30 min，用0.1%結(jié)晶紫37 ℃染色20 min，用PBS清洗3次。利用倒置顯微鏡進(jìn)行拍照，用Image J軟件進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。

1.2.7 Western blot檢測細(xì)胞蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞沉淀，加入RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，用BCA法進(jìn)行細(xì)胞總蛋白定量，并將樣品進(jìn)行煮沸變性。隨后進(jìn)行電泳分離與轉(zhuǎn)膜，之后用5%脫脂牛奶封閉2 h，用PBST洗膜3次后加入相應(yīng)的ANP32A、AΚT、p-AΚT、MTDH 與βactin抗體，4 ℃過夜，次日用PBST洗膜3次，室溫孵育辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗1 h，用PBST洗膜3次，加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑，用發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)檢測目的蛋白。利用Image J軟件進(jìn)行目的蛋白的灰度分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad 8.0與SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間差異比較采用單因素方差分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 ANP32A的下調(diào)抑制細(xì)胞增殖

在結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116和SW480中，利用慢病毒載體構(gòu)建ANP32A沉默的細(xì)胞（sh ANP32A）和陰性對照細(xì)胞（sh-NC）。Western blot結(jié)果顯示sh-ANP32A組的ANP32A 表達(dá)與sh-NC 相比顯著下降（P＜0.01，圖1C、D）。ANP32A下調(diào)后，HCT116細(xì)胞和SW480細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，觸角消失，細(xì)胞變圓，且更易聚集成團(tuán)（圖1 A、B）。細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示陰性組（sh-NC）與空白對照組細(xì)胞增殖沒有顯著性差異（P＞0.05），但是ANP32A下調(diào)則能顯著抑制HCT116和SW480細(xì)胞的增殖（P＜0.01），其中ANP32A沉默對HCT116細(xì)胞的增殖抑制作用更強(qiáng)，達(dá)到50%以上（圖1E）。

圖1 ANP32A的下調(diào)抑制細(xì)胞增殖Fig.1 ANP32A silencing inhibits proliferation of HCT116 and SW480 cells.A,B: Changes in morphology of HCT116 and SW480 cells after ANP32A silencing(Original magnification:×100).C,D:Expression level of ANP32A in HCT116 and SW480 cells after ANP32A silencing detected by Western blotting.E,F: Changes in proliferation of HCT116 and SW480 cells after ANP32Asilencing.**P＜0.01 vs sh-NC group.

2.2 AΚT 的活性對HCT116 和SW480 增殖及侵襲的影響

HCT116細(xì)胞和SW480細(xì)胞敲低ANP32A的表達(dá)后，細(xì)胞內(nèi)p-AΚT的表達(dá)下降（圖2）。倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，AΚT抑制劑MΚ2206能明顯抑制HCT116細(xì)胞增殖，使細(xì)胞變圓，觸角消失，失去其正常的梭形形狀，而其對SW480細(xì)胞，能抑制其增殖，甚至誘導(dǎo)其發(fā)生死亡（圖2B）。細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示2 μmol/LAΚT激活劑SC79對大腸癌HCT116和SW480細(xì)胞的增殖作用較弱，而5 μmol/L MΚ2206能顯著地抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力（P＜0.05，圖2C）。Transwell實驗結(jié)果顯示2 μmol/L SC79能顯著促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的侵襲遷移能力（P＜0.01），而5 μmol/L MΚ2206能顯著地抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲遷移能力（P＜0.01，圖2D、E）。

圖2 AΚT的活性影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖及侵襲遷移Fig.2 Effects of AKT agonist and inhibitor on proliferation,invasion and migration of HCT116 and SW480 cells.A:Changes in AKT activity in HCT116 and SW480 cells with ANP32Asilencing.B:Effects of AKT agonist and inhibitor on morphology of HCT116 and SW480 cells(×200).C:Effect of treatments with AKT agonist and inhibitor on viability of HCT116 and SW480 cells.D-G:Effects of treatments with AKT agonist and inhibitor on invasion and migration ability of HCT116 and SW480 cells(Crystal violet staining,×200).*P＜0.05,**P＜0.01 vs sh-NC group.

2.3 ANP32A 下調(diào)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲遷移與AΚT的活性有關(guān)

細(xì)胞劃痕實驗結(jié)果顯示，SC79 不僅能增強(qiáng)對照組細(xì)胞的遷移能力（P＜0.01），且能恢復(fù)由ANP32A沉默導(dǎo)致的結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移能力減弱（P＜0.01），而MΚ2206 則不僅能抑制對照組細(xì)胞的遷移能力（P＜0.01），同時增強(qiáng)ANP32A 沉默引起的結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移抑制作用（HC1116細(xì)胞中P＜0.01，SW480細(xì)胞中P＜0.05）（圖3A～E）。Transwell實驗結(jié)果也顯示SC79不僅能增強(qiáng)對照組細(xì)胞的侵襲能力（P＜0.01），且能回撤ANP32A 沉默導(dǎo)致的結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲能力減弱（P＜0.01），而MΚ2206則不僅能抑制對照組細(xì)胞的侵襲能力（P＜0.01），同時增強(qiáng)ANP32A沉默引起的侵襲抑制作用（P＜0.01，圖3F）。

圖3 AΚT的活性對ANP32A沉默結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲遷移的影響Fig.3 Effects of AKT agonist and inhibitor on invasion and migration ability of HCT116 and SW480 cells with ANP32A silencing.A-D: AKT activity affects the inhibitory effects of ANP32A silencing on colon cancer cell migration(×40).E,F:AKT activity affects the inhibitory effect of ANP32A silencing on colon cancer cell invasion(Crystal violet staining,×200).**P＜0.01 vs sh-NC group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs sh-ANP32Agroup.

2.4 AΚT的活性對shANP32A大腸癌細(xì)胞內(nèi)ANP32A表達(dá)及AΚT活性的影響

如圖4A和5A所示，SC79能逆轉(zhuǎn)ANP32A沉默細(xì)胞內(nèi)ANP32A的表達(dá)；而MΚ2206則能進(jìn)一步抑制由shANP32A導(dǎo)致的結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)ANP32A水平的降低（圖4B 和5B）。同時我們發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌細(xì)胞中MTDH的蛋白水平能被AΚT抑制劑MΚ2206所抑制（P＜0.01）；被AΚT激活劑SC79所上調(diào)（P＜0.05），但是在HCT116細(xì)胞中，與對照組相比沒有顯著性差異（P＞0.05）。ANP32A 沉默后，MTDH 的表達(dá)下調(diào)，同時MΚ2206 能加強(qiáng)ANP32A 沉默對MTDH 的抑制作用（HC1116 細(xì)胞中P＜0.01，SW480 細(xì)胞中P＜0.05），在SW480細(xì)胞中SC79則能逆轉(zhuǎn)ANP32A沉默對MTDH的抑制作用（P＜0.05，圖5A），但是在HCT116細(xì)胞中，SC79的逆轉(zhuǎn)作用不顯著（P＞0.05，圖4A）。

圖4 HCT116細(xì)胞western blot和灰度分析Fig.4 Western blotting and gray scale analysis of ANP32A expression and AKT activity in HCT116 cells with ANP32A silencing treated with AKT agonist or inhibitor.A:Effects of Akt agonist on ANP32A expression and AKT activity in HCT116 cells with ANP32A silencing.B:Effects of AKTt inhibitor on ANP32A expression and AKT activity in HCT116 cells withANP32Asilencing.**P＜0.01 vs sh-NC;#P＜0.05,##P＜0.01 vs sh-ANP32A.

圖5 SW480細(xì)胞western blot和灰度分析Fig.5 Western blotting and gray scale analysis of SW480 cells.A:Effects of AKT agonists on ANP32A expression and AKT activity in SW480 cells with ANP32A silencing;B: Effects of AKT inhibitor on ANP32A expression and AKT activity in SW480 cells withANP32Asilencing.*P＜0.05,**P＜0.01 vs sh-NC group;#P＜0.05,##P＜0.01 vs sh-ANP32Agroup.

3 討論

越來越多的證據(jù)表明許多基因變化與癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)［19,20］。因此，在結(jié)直腸癌中特異性上調(diào)或者下調(diào)的基因中尋找關(guān)鍵調(diào)控因子，對于結(jié)直腸癌的防治意義重大。早期研究表明，ANP32A被認(rèn)為是一種腫瘤抑制因子［8,21］，在正常組織、乳腺癌、胰腺癌和前列腺癌中表達(dá)的核磷酸蛋白［7,10］，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、轉(zhuǎn)錄、凋亡和細(xì)胞周期進(jìn)程多種細(xì)胞功能［22］。近些年來，越來越多的人發(fā)現(xiàn)，ANP32A在腫瘤組織中高表達(dá)，并參與了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［10］。我們前期也發(fā)現(xiàn)ANP32A在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，利用siRNA干擾技術(shù)我們發(fā)現(xiàn)ANP32A 的沉默確實可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖［12］。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)利用慢病毒構(gòu)建的ANP32A沉默的穩(wěn)定細(xì)胞株確實能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖，同時倒置顯微鏡鏡下發(fā)現(xiàn)ANP32A的沉默能夠改變細(xì)胞的形態(tài)，尤其是在HCT116細(xì)胞中細(xì)胞形態(tài)改變更明顯，我們發(fā)現(xiàn)ANP32A沉默可以導(dǎo)致細(xì)胞變圓，細(xì)胞更易成團(tuán)，原來的形態(tài)消失，細(xì)胞接觸增加，這個與以前報道的惡性侵襲表型相反［23,24］，因此我們推測ANP32A可能參與了結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。

我們的早前研究表明利用siRNA干擾ANP32A表達(dá)后，AΚT的活性下降［12］，AΚT除了參與腫瘤的增殖以后，它的異常激活更是參與了包括結(jié)直腸癌細(xì)胞在內(nèi)的多種腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移［25,26］。研究表明INTS6通過激活A(yù)ΚT和ERΚ促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲遷移，結(jié)直腸癌細(xì)胞新的治療靶點［27］。GATA1，一種在紅細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞的發(fā)育和進(jìn)展發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)錄因子，被發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)增殖、遷移、侵襲和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），其機(jī)制主要是與其激活結(jié)直腸癌細(xì)胞中PI3Κ/AΚT信號通路的活性有關(guān)［28］，INTS6，SPNS2等因子促進(jìn)結(jié)直腸癌的惡性進(jìn)展均與AΚT的異?；罨嘘P(guān)［27,29］。且在結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的機(jī)制中，AΚT信號活化參與HGF促進(jìn)結(jié)直腸癌的侵襲與遷移［30］，說明AΚT的活性在結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移中起重要作用。本研究中，我們利用了AΚT的激活劑SC79和抑制劑MΚ2206去探究其活性對結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲遷移的影響，確實發(fā)現(xiàn)AΚT的活性參與調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌的侵襲遷移。在結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116 與SW480細(xì)胞中，AΚT的活性抑制后，ANP32A表達(dá)下調(diào)；而AΚT活性的活化，ANP32A的表達(dá)上調(diào)，并且在ANP32A 沉默的細(xì)胞中，AΚT 活性的抑制能加強(qiáng)ANP32A沉默導(dǎo)致的結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲遷移能力的減弱，AΚT活性的活化則能逆轉(zhuǎn)ANP32A沉默導(dǎo)致的結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲遷移能力的減弱，這表明ANP32A的表達(dá)調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌的侵襲遷移作用與AΚT的活性有關(guān)，這在一定程度上解釋了ANP32A在AΚT介導(dǎo)的細(xì)胞遷移和侵襲促進(jìn)作用。

近年來尋找新的腫瘤轉(zhuǎn)移因子是研究的熱點，金屬粘連蛋白（MTDH）已被發(fā)現(xiàn)參與多種癌癥的發(fā)展，包括乳腺癌［31］、前列腺癌、肝癌、胃癌［32］、肺癌和結(jié)腸直腸癌［33,34］。MTDH已在多種腫瘤中證實了其在促進(jìn)腫瘤起始、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和治療耐藥性方面的關(guān)鍵作用［35］，MTDH被確定為參與各種類型腫瘤轉(zhuǎn)移進(jìn)展的重要轉(zhuǎn)移驅(qū)動因子［36］。此外，在小鼠模型中敲除MTDH后沒有觀察到明顯的生理缺陷，這使得其成為癌癥治療的一個具有吸引力的治療靶點。在小鼠結(jié)直腸癌模型中，使用MTDH反義寡核苷酸（ASOs）可治療顯著減輕結(jié)直腸癌的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移［35］。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌細(xì)胞中ANP32A 的下調(diào)能抑制MTDH 的表達(dá)，表明ANP32A的沉默能影響AΚT的活性，也能抑制轉(zhuǎn)移相關(guān)因子MTDH的表達(dá)來抑制結(jié)直腸癌的侵襲遷移。此外，我們還發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞抑制AΚT的活性后，MTDH表達(dá)下調(diào)，而AΚT活性活化后，MTDH的表達(dá)上調(diào)，此結(jié)果與前人研究一致即AΚT活化參與了結(jié)直腸癌的侵襲遷移能力調(diào)控。

綜上所述，本研究通過慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)成功構(gòu)建了ANP32A沉默的穩(wěn)定細(xì)胞株，并證明ANP32A的下調(diào)可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖，侵襲和遷移，并且抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞PI3Κ/AΚT信號通路活性，為結(jié)直腸癌的治療提供了一定的理論支撐。