石洪超 商雪瑩 陳明權(quán) 羅卓雅 覃仁安 何風(fēng)雷 孫 東

1.廣州白云山陳李濟(jì)藥廠有限公司，廣東廣州 510288；2.廣東省藥品檢驗所，廣東廣州 510663

中藥材次生代謝物的含量和各成分間的比例，會因栽培環(huán)境條件的變化而變化[1-2]，黃璐琦等[3-4]提出道地藥材形成的逆境效應(yīng)理論，也有其他學(xué)者[5-6]認(rèn)為合成和積累次生代謝產(chǎn)物是藥用植物適應(yīng)環(huán)境脅迫的策略，常見的環(huán)境脅迫包括溫度[7]、光照[8]、水分[9]、土壤因子等[10]。

不同產(chǎn)地的陳皮價格存在巨大差異，史料記載[11-12]橘皮以廣中來者勝，稱為廣陳皮，其中以廣東新會種植茶枝柑所產(chǎn)的廣陳皮質(zhì)量最優(yōu)，業(yè)內(nèi)稱為“新會陳皮”。隨著2020 版《中華人民共和國藥典》[13]對“廣陳皮”項的修訂，廣陳皮產(chǎn)業(yè)得到了極大的發(fā)展。2021 年新會陳皮全行業(yè)產(chǎn)值已達(dá)145 億[14]，廣東省江門市地方標(biāo)準(zhǔn)《DB4407/T70-2021 地理標(biāo)志產(chǎn)品新會陳皮》[15]中規(guī)定，在新會地理標(biāo)志產(chǎn)品保護(hù)范圍內(nèi)栽培并儲存陳化3 年以上的稱為“新會陳皮”。鑒于新會地區(qū)獨特的水土環(huán)境[16]，“廣陳皮”與其他產(chǎn)地的“陳皮”中次生代謝產(chǎn)物有所差別。目前研究已證實，新會陳皮中橙皮苷含量低于其他陳皮，但川陳皮素和橘皮素較高，且多氧基黃酮的含量較多[17-18]。因此，本研究從次生代謝產(chǎn)物的角度出發(fā)，探索通過比較黃酮類成分間的比值區(qū)分不同產(chǎn)地陳皮的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

Thermo QE plus 液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜儀（賽默飛世爾科技有限公司）；Waters H-Class UPLC-PDA Detector 超高效液相色譜（美國沃特世公司）；Waters XSelect CSH C18色譜柱（2.5 μm，3.0 mm×100 mm，美國沃特世公司）；Waters XSelect HSS T3 色譜柱（2.5 μm，3.0 mm×150 mm，美國沃特世公司）；Waters CORTECS C18色譜柱（2.7 μm，3.0 mm×150 mm，美國沃特世公司）；XPR 26/A 百萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Sartorius BS420S 萬分之一電子天平；Milli-Q Reference 純水機(jī)（法國Millipore）；SB-5200 DT超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；WXJ型粉碎機(jī)（上海凱旋中藥機(jī)械制造有限公司）。

1.1.2 試劑與試藥

維采寧-2（純度：99.57%，批號：19121201，成都格利普生物科技有限公司）；橙皮苷（純度：96.1%，批號：110721-201617，中國食品藥品檢定研究院）；川陳皮素（純度：98.0%，批號：AF7122105，成都萊寶科技有限公司）；橘皮素（純度：98.0%，批號：AF8012603，成都萊寶科技有限公司）；甜橙黃酮（純度＞98.0%，批號：PS011272，成都普思生物科技股份有限公司）；6-去甲氧基橘皮素（純度＞98.0%，批號：PS011274，成都普思生物科技股份有限公司）；5-去甲基川陳皮素（純度＞98.0%，批號：PS020360，成都普思生物科技股份有限公司）；色譜級甲醇（德國Merck）、超純水、甲醇（廣州化學(xué)試劑廠）、磷酸、甲酸（廣州化學(xué)試劑廠）。

1.1.3 試驗樣品信息

樣品分別編號為S1～S18，樣品S1～S14 經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室主任黃海波副教授鑒定為蕓香科植物茶枝柑Citrus reticulate‘Chachi’的果皮，即廣陳皮，其中包括種植于新會地區(qū)的新會陳皮（S1～S8，以下簡稱“新會陳皮”）及同屬茶枝柑種植于兩廣其他地區(qū)的廣陳皮（S9～S14，以下簡稱“非新會廣陳皮”）；樣品S15～S18 經(jīng)鑒定為蕓香科植物橘Citrus reticulata Blanco 及除茶枝柑以外的其他栽培變種的果皮，即陳皮，樣品信息見表1。

表1 不同產(chǎn)地陳皮樣品信息表

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品溶液的制備

取維采寧-2、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素、甜橙黃酮、6-去甲氧基橘皮素、5-去甲基川陳皮素標(biāo)準(zhǔn)品，精密稱定，分別用甲醇配置成濃度為0.552、0.523、0.542、0.604、0.426、0.513、0.419 mg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，置于4℃冰箱中保存。

取維采寧-2、橙皮苷、川陳皮素、橘皮素標(biāo)準(zhǔn)品儲備液1 ml，加入甲醇配置為10 ml 的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用于不同產(chǎn)地陳皮的UPLC 圖譜研究。取橙皮苷、川陳皮素、橘皮素、甜橙黃酮、6-去甲氧基橘皮素、5-去甲基川陳皮素標(biāo)準(zhǔn)品儲備液1 ml，加入甲醇配置為10 ml 的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用于黃酮類成分分析研究。

1.2.2 供試品溶液的制備

取陳皮樣品0.5 g（過45 目篩），精密稱定，置于150 ml 具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，超聲處理30 min（功率300 W，頻率40 kHz），放置至室溫，稱重補重，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾即得。

1.2.3 UPLC 色譜條件

采用Waters H-Class UPLC-PDA Detector 超高效液相采集色譜圖；色譜柱：Waters XSelect CSH C18色譜柱；柱溫：30℃；流速：0.5 ml/min；進(jìn)樣量：2 μl；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）；洗脫程序為0～2 min 10%A，2～12 min 10%→15%A，12～17 min 15%→30%A，17～18 min 30%A，18～22 min 30%→45%A，22～23 min 45%→50%A，23～25 min 50%A；檢測波長：283 nm。

1.2.4 方法學(xué)考察

1.2.4.1 精密度試驗 精密吸取混合對照品溶液2 μl，按“1.2.3”項下色譜條件進(jìn)樣6 次，分別積分并記錄橙皮苷、川陳皮素、橘皮素、甜橙黃酮、6-去甲氧基橘皮素、5-去甲基川陳皮素的峰面積值，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.4.2 重復(fù)性試驗 精密稱取同一供試樣品（S4）6 份，按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液并按“1.2.3”項下色譜條件進(jìn)行檢測，記錄峰面積，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取S4 供試品溶液，分別在0、4、8、12、24、48 h 按“1.2.3”項下色譜條件進(jìn)行測定，記錄峰面積，計算得橙皮苷、川陳皮素、橘皮素、甜橙黃酮、6-去甲氧基橘皮素、5-去甲基川陳皮素的峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.4.4 方法的耐用性考察 取S4 供試品溶液，分別在3 根不同色譜柱上進(jìn)行耐用性考察。記錄在同一檢測波長下（283 nm）6 個成分峰的保留時間及峰面積，計算橙皮苷與其他5 個成分峰之間的相對保留時間比值和相對峰面積百分比，計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.5 質(zhì)譜條件

采用Q Exactive Orbitrap 高分辨質(zhì)譜進(jìn)行質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集，檢測模式為Full MS-ddMS2，正離子模式掃描，掃描范圍為m/z 100～1 200，MS1分辨率設(shè)置為70000，MS2分辨率設(shè)置為17 500，離子源電壓為3.2 kV，毛細(xì)管離子傳輸管溫度為320℃，輔助氣加熱溫度為350℃，鞘氣流速為40 L/min，輔助氣流速為15 L/min，AGC Target 設(shè)置為1e6，Top N 設(shè)置為5，觸發(fā)MS2掃描的碰撞能量采用階梯式碎裂電壓NCE，設(shè)置為30、40、50。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

1.2.6.1 質(zhì)譜數(shù)據(jù) 采用Compound discover 3.2 軟件進(jìn)行原始Raw 質(zhì)譜數(shù)據(jù)特征峰提取，特征峰元素匹配、分子式預(yù)測及同位素分布匹配的質(zhì)量偏差均設(shè)置為＜5 ppm。采用mz cloud 在線數(shù)據(jù)庫和本地自建mz Vault 中藥天然產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行特征峰鑒定，指認(rèn)結(jié)果篩選標(biāo)準(zhǔn)為質(zhì)量偏差＜5 ppm、符合同位素分布及mz Vault best match 數(shù)據(jù)庫匹配得分＞70 分。通過與對照品對照、譜庫檢索、裂解碎片及文獻(xiàn)檢索，對樣品中的化合物進(jìn)行指認(rèn)和確認(rèn)。

1.2.6.2 液相數(shù)據(jù) 取“1.1.3”項下樣品，每個樣品平行2 份，按“1.2.2”項下方法制備供試品溶液并按“1.2.3”項下色譜條件進(jìn)行檢測，記錄6 個成分的峰面積，將6 個成分的峰面積，一個作為分子，另一個作為分母進(jìn)行兩兩組合，形成比值。

2 結(jié)果

2.1 不同產(chǎn)地陳皮的UPLC 圖譜

不同產(chǎn)地陳皮的光譜吸收有差異，初步選擇8 個差別峰進(jìn)行產(chǎn)地鑒別研究，其中采用對照品比對3 個已知峰（橙皮苷、川陳皮素和橘皮素），還有5 個未知峰需進(jìn)行鑒別指認(rèn)。見圖1。

圖1 S4、S12、S16 樣品UPLC 色譜圖

2.2 黃酮類成分定性分析

通過與對照品對照、譜庫檢索、裂解碎片及相關(guān)文獻(xiàn)，對樣品中的5 個未知峰進(jìn)行化合物指認(rèn)，且其均為黃酮類成分，化合物3 為甜橙黃酮，化合物4 為6-去甲氧基橘皮素，化合物5 為5-去甲基川陳皮素；同時初步指認(rèn)化合物1 為柚皮素查爾酮，化合物2 為異櫻花素，但未采用對照品確認(rèn)，總離子流圖及對照品對照圖譜見圖2。

圖2 正離子模式下總離子流圖

鑒于后續(xù)的研究需采用差異性黃酮類成分峰面積的比值分析，因此選擇6 個已用對照品確認(rèn)的化合物，即化合物3（甜橙黃酮）、化合物4（6-去甲氧基橘皮素）、化合物5（5-去甲基川陳皮素），以及橙皮苷、川陳皮素、橘皮素進(jìn)行峰面積比值分析。

2.3 不同產(chǎn)地陳皮樣品中黃酮類成分的比值分析

2.3.1 方法學(xué)考察

2.3.1.1 精密度試驗 橙皮苷（RSD=0.57%）、川陳皮素（RSD=0.52%）、橘皮素（RSD=0.61%）、甜橙黃酮（RSD=0.71%）、6-去甲氧基橘皮素（RSD=1.21%）、5-去甲基川陳皮素（RSD=1.45%）的RSD 值均＜2%，提示儀器的精密度良好。

2.3.1.2 重復(fù)性試驗6 個成分的峰面積RSD 值分別為1.27%、1.52%、1.33%、3.15%、4.03%、2.10%，提示方法重復(fù)性良好。

2.3.1.3 穩(wěn)定性試驗6 個成分的峰面積RSD 值分別為1.03%、1.11%、0.76%、3.62%、2.57%、1.85%，提示供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.1.4 方法的耐用性考察 經(jīng)3 根不同的色譜柱的測定結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)，在色譜柱1、色譜柱2 上，6 個成分峰均能有效分離，且各差異峰的峰面積、保留時間與原方法建立時使用的色譜柱3 測定結(jié)果接近（RSD＜5%），結(jié)果見表2，提示該方法具有良好的耐用性。

表2 方法耐用性考察表

2.3.2 樣品測定

各成分峰面積經(jīng)排列組合得到15 組比值，結(jié)合表1 中的樣品信息分析發(fā)現(xiàn)，能區(qū)分不同產(chǎn)地陳皮的比值有2 組，見表3。由比值數(shù)據(jù)可知，當(dāng)陳皮峰面積比值甜橙黃酮/6-去甲氧基橘皮素＞0.60 時，可將其判斷為廣陳皮（包括新會陳皮、非新會產(chǎn)廣陳皮）；≤0.60 可將其判斷為陳皮。且當(dāng)峰面積比值橘皮素/5-去甲川陳皮素＞7.00 時，可將其判斷為新會陳皮、非新會產(chǎn)廣陳皮；≤7.00 可將其判斷為陳皮。

表3 樣品中可用于區(qū)分的峰面積比值（n=2）

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)6 個潛在的黃酮類成分[19-20]可用于區(qū)分廣陳皮與陳皮，分別為橙皮苷、甜橙黃酮、6-去甲氧基橘皮素、川陳皮素、橘皮素、5-去甲基川陳皮素，經(jīng)過峰面積比值分析后發(fā)現(xiàn)，有2 組峰面積比值（283 nm 下）可用于判斷廣陳皮與陳皮，即甜橙黃酮/6-去甲氧基橘皮素＞0.60 或橘皮素/5-去甲基川陳皮素＞7.00，可將其判斷為廣陳皮。該比值可用于陳皮品種的快速分析，且不受陳化年份、陳化方式等因素的影響。

目前關(guān)于陳皮產(chǎn)地的鑒別研究中有HPLC 指紋圖譜[21]、紅外光譜[22]、礦質(zhì)元素[23]、基因組DNA[24]等方法，在陳皮物質(zhì)基礎(chǔ)方面主要有指紋圖譜及成分含量方面的研究，但指紋圖譜及含量測定[25]多存在檢測過程較冗繁或需復(fù)雜的化學(xué)計量法等問題。本研究基于中藥材次生代謝產(chǎn)物含量和各成分間的比例因環(huán)境條件的變化而變化，利用差異指標(biāo)成分間的比例差異作為區(qū)分陳皮產(chǎn)地區(qū)分的指標(biāo)具有一定的科學(xué)性，并且通過計算在同一檢測波長下差異成分之間的峰面積比值，可提高產(chǎn)地區(qū)分指標(biāo)的便捷性和普適性。但對于新會陳皮和非新會廣陳皮而言，黃酮類成分比值無法對兩者進(jìn)行區(qū)分，后續(xù)還需增加其他指標(biāo)探索兩者區(qū)分的可能性。