■殷海成 楊智翔 陳 瑩 馬源青 李岳燕

（河南工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院，河南鄭州 450001）

食物的致敏“元兇”是抗原蛋白的抗原決定簇，也稱抗原表位[1]?？乖砦坏慕M成、結(jié)構(gòu)及空間構(gòu)象決定抗原蛋白的致敏性[2]。大豆是公認(rèn)的過敏原，其高致敏性嚴(yán)重影響嬰幼兒或幼齡動(dòng)物（仔豬[3]、犢牛[4]等）的食用安全，其中大豆11S 球蛋白（主成分是大豆球蛋白，glycinin）和大豆7S 球蛋白（主成分是β-伴大豆球蛋白，β-conglycinin）是含量最多、致敏性最強(qiáng)的抗原蛋白[5]。近年，隨著人們對(duì)食品安全要求的提高，大豆蛋白過敏問題成為世界性的公認(rèn)問題，而如何消除抗原蛋白致敏性成為普遍關(guān)注的熱點(diǎn)。

Glycinin 是分子量為300～370 ku 的六聚體蛋白，由酸性亞基A（A1a、A1b、A2、A3、A4、A5）和堿性亞基B（B1a、B1b、B2、B3、B4）通過二硫鍵和疏水鍵結(jié)合而成[6]。β-conglycinin是由3亞基（α′、α、β）通過氫鍵與疏水作用形成的分子量為140～180 ku的糖蛋白[含糖約5%，其糖基與天冬氨酸（Asp）的N-端相結(jié)合][7]。由于α′、α、β亞基均含糖基，因此其空間結(jié)構(gòu)的柔性、親水性均較強(qiáng)[8]；而glycinin 含二硫鍵較多，其剛性結(jié)構(gòu)使親水性變?nèi)鮗9]。截止到目前，大豆抗原蛋白的結(jié)構(gòu)、抗?fàn)I養(yǎng)性[10]、致敏機(jī)制[11]、滅活技術(shù)[12]、美拉德反應(yīng)（Maillard reaction）[13]等都有很多研究。其中美拉德反應(yīng)是指含游離氨基的蛋白質(zhì)/肽/氨基酸等與含羰基的還原糖/醛/酮之間進(jìn)行的脫水縮合反應(yīng)，是食品加工和儲(chǔ)存中普遍發(fā)生的非酶褐變反應(yīng)，對(duì)食品的色、香、味等形成具有至關(guān)重要的作用[14]。蛋白質(zhì)糖基化的本質(zhì)是美拉德反應(yīng)，不僅能改善蛋白質(zhì)的功能特性[15]，還賦予了糖基化產(chǎn)物易消化、低致敏性、抗氧化、抑菌以及抗炎等潛在的促進(jìn)腸道健康的特性[16]，引起普遍關(guān)注。文章基于現(xiàn)有的大豆抗原蛋白糖基化研究現(xiàn)狀，綜述了糖基化大豆主要抗原蛋白的致敏性及對(duì)腸道健康的影響，為糖基化改性抗原蛋白及應(yīng)用提供參考。

1 美拉德反應(yīng)與大豆抗原蛋白糖基化

1.1 美拉德反應(yīng)過程

美拉德反應(yīng)是1912 年由法國科學(xué)家Louis Camille Maillard 提出，1953 年被John 等命名，又被稱為非酶褐變（Non-enzymatic browning）反應(yīng)[17]。美拉德反應(yīng)是復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)過程，普遍發(fā)生在食品加熱或儲(chǔ)存中[18]，至今其反應(yīng)途徑和產(chǎn)物尚未完全清楚。依據(jù)現(xiàn)有研究成果將其反應(yīng)過程分為初期、中期和末期3個(gè)階段。初期階段是蛋白質(zhì)的氨基與糖分子的醛基進(jìn)行縮合反應(yīng)，生成糖基化產(chǎn)物（亞胺衍生物——Schiff 堿）。由于Schiff 堿性質(zhì)不穩(wěn)定，隨即環(huán)化形成取代醛糖基胺并在酸催化下經(jīng)Amadori 重排和Heys重排生成穩(wěn)定的1-氨基-1-脫氧-2-酮糖或2-氨基-2-脫氧-1-酮糖的蛋白質(zhì)綴合物[19]。中期階段是(Amadori重排和Heys重排生成中間產(chǎn)物階段，受反應(yīng)體系pH的影響。在pH≤7.0時(shí)，主要發(fā)生1，2-烯醇化反應(yīng)產(chǎn)生糠醛或羥甲基糠醛；而當(dāng)pH＞7.0時(shí)，主要發(fā)生2，3-烯醇化反應(yīng)產(chǎn)生還原酮和裂解物[20]。末期階段是反應(yīng)生成物中各活性中間體發(fā)生脫水、成環(huán)、異構(gòu)、重排等一系列反應(yīng)，生成褐色和香氣味物質(zhì)階段[21]。值得注意，該反應(yīng)也導(dǎo)致部分氨基酸損失或生成丙烯酰胺等物質(zhì)而造成不安全問題[22]。

1.2 大豆抗原蛋白糖基化及方法

蛋白質(zhì)糖基化通常被認(rèn)為是美拉德反應(yīng)的初期階段。大豆抗原蛋白中的氨基尤其是賴氨酸的ε-氨基通過共價(jià)鍵與糖中的還原性碳基發(fā)生脫水縮合反應(yīng)，生成N-糖基胺。N-糖基胺不穩(wěn)定，易發(fā)生不可逆的Amadori 重排和Heys 重排，生成穩(wěn)定的1-氨基-1-脫氧-2-酮糖或2-氨基-2-脫氧-1-酮糖的蛋白質(zhì)綴合物[19]。這個(gè)糖基化反應(yīng)不改變大豆抗原蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)，并保持蛋白質(zhì)原有的功能屬性，且在多糖的作用下改善蛋白質(zhì)的功能特性。

目前，蛋白質(zhì)糖基化主要采用干熱法和濕熱法。干熱法糖基化由日本的Kato 等[23]在1988 年首先提出。是將糖與蛋白質(zhì)按一定的比例溶解在已確認(rèn)pH的緩沖液（多用磷酸鹽）中，均勻溶解后制備冷凍干燥樣本，樣本在50～60 ℃和65%～79%環(huán)境濕度[用飽和碘化鉀（KI）或溴化鉀（KBr）維持]下進(jìn)行美拉德反應(yīng)，降溫可抑制該反應(yīng)。干熱法糖基化大豆抗原蛋白其致敏性顯著降低，但反應(yīng)的時(shí)間相對(duì)較長，同時(shí)反應(yīng)過程中控制反應(yīng)條件較難[24]。濕熱法糖基化是蛋白質(zhì)與單糖或多糖溶解在溶液中經(jīng)加熱進(jìn)行的一種接枝反應(yīng)[25]。濕熱法與干熱法的基本步驟相同，也是將蛋白質(zhì)和糖依比例溶解到選定pH 的緩沖液中，接著在密閉的容器中利用水浴或油浴加熱進(jìn)行反應(yīng)，利用冰浴降溫結(jié)束反應(yīng)。在≤90 ℃下，濕法糖基化反應(yīng)速度一般較慢，而在＞90 ℃下反應(yīng)較快（24 h內(nèi)）。目前糖基化法多被用于小分子糖與蛋白質(zhì)間的反應(yīng)[26]。值得關(guān)注的是Martins 等[27]通過構(gòu)建動(dòng)力學(xué)模型來預(yù)測(cè)和控制濕熱法美拉德反應(yīng)，這為美拉德反應(yīng)過程化控制的實(shí)現(xiàn)提供了新思路。

2 大豆抗原蛋白對(duì)腸道的致敏損傷

大豆蛋白過敏是大豆抗原蛋白介導(dǎo)的機(jī)體異常免疫反應(yīng)，也是嬰幼兒或幼齡動(dòng)物最常見的過敏類型，通常表現(xiàn)皮膚、胃、腸、呼吸道癥狀，嚴(yán)重者或引起休克甚至死亡，其中，腸道是受危害最為嚴(yán)重的器官之一[28]。由于幼齡動(dòng)物的腸管尚未發(fā)育完全，消化酶分泌能力不足，腸道微生態(tài)系統(tǒng)不穩(wěn)定等。在攝入含大豆抗原蛋白的食物后，未被降解的大豆抗原蛋白易通過跨細(xì)胞或旁細(xì)胞途徑進(jìn)入血液或淋巴循環(huán)，誘導(dǎo)機(jī)體過敏。其主要過敏類型有3 種：①Ⅰ型過敏反應(yīng)：由免疫球蛋白E（IgE）介導(dǎo)。表現(xiàn)為速發(fā)型，其中肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，組胺與白三烯等為效應(yīng)因子，是造成腸上皮細(xì)胞通透性增加和黏膜水腫的主要因子。②Ⅲ型過敏反應(yīng)：由免疫球蛋白G（IgG）和免疫球蛋白M（IgM）共同介導(dǎo)。由免疫復(fù)合物通過激活補(bǔ)體系統(tǒng)和某些效應(yīng)細(xì)胞引起充血性水腫和組織損傷。③Ⅳ型過敏反應(yīng)：是由特異性淋巴T細(xì)胞介導(dǎo)的遲發(fā)型過敏反應(yīng)。其中IgE介導(dǎo)的速發(fā)型過敏反應(yīng)最為常見[29]。

大豆抗原過敏的嬰幼兒或幼齡動(dòng)物，腸黏膜上皮細(xì)胞的通透性增加，造成腸黏膜發(fā)生水腫，并破壞腸黏膜形態(tài)結(jié)構(gòu)與完整性，致使腸黏膜上皮、腸絨毛萎縮縮短、隱窩加深[30]。如過敏仔豬腸上皮細(xì)胞的緊密連接蛋白ZO-1、claudin-3和occludin基因表達(dá)水平降低，通透性增加，造成腸黏膜屏障機(jī)械性損傷[31]。腸黏膜損傷募集粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，造成腸道的組胺釋放增加，激活NF-κB信號(hào)通路，使致炎因子白細(xì)胞介素IL-1、IL-4、IL-6等表達(dá)水平升高，打破了原本的Th1/Th2和Treg/Th17細(xì)胞間的平衡，失衡的Th2細(xì)胞分泌過多的白細(xì)胞介素4（IL-4），促進(jìn)IgE 的合成與分泌，使腸免疫屏障受損[32]。過敏的發(fā)生也與腸道微生物相關(guān)。兒童大豆抗原蛋白過敏時(shí)，腸道的梭菌屬（Clostridium）和疣微菌科（Verrucomicrobiaceae）的豐度顯著增加[33]。大豆抗原蛋白過敏的斷奶仔豬腸管中雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)量減少，大腸桿菌豐度增加等[34]。過敏使腸道微生態(tài)屏障被破壞，引起益生菌和病原菌間的穩(wěn)態(tài)失衡，進(jìn)一步增加腸黏膜通透性、引發(fā)炎癥反應(yīng)及腸黏膜功能紊亂等不良現(xiàn)象，導(dǎo)致腹瀉，生長遲緩，甚至死亡。

3 糖基化大豆抗原蛋白對(duì)腸道健康的影響

3.1 糖基化大豆抗原蛋白的低致敏性

大豆球蛋白或大豆β-伴球蛋白的致敏性和其他抗原一樣都是由其抗原表位決定[1]?？乖砦话磁c之結(jié)合的細(xì)胞不同分為B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位；或按表位結(jié)構(gòu)中氨基酸的連續(xù)性或不連續(xù)性分為線性表位和構(gòu)象表位[35]。為了消減抗原的致敏性，必須破壞或修飾抗原表位。糖基化在大豆蛋白制品中常常發(fā)生美拉德反應(yīng)，通過美拉德反應(yīng)改變大豆抗原蛋白的分子結(jié)構(gòu)，接入的糖鏈會(huì)修飾或改變抗原表位結(jié)構(gòu)，從而降低蛋白質(zhì)復(fù)合物的致敏性。陳曉旭等[13]將大豆β-伴球蛋白利用低溫法、蒸煮法、高壓滅菌法三種糖基化方法處理，通過構(gòu)建的大豆β-伴球蛋白致敏小鼠模型評(píng)價(jià)了糖基化蛋白產(chǎn)物的致敏性，并解析了大豆β-伴球蛋白的結(jié)構(gòu)變化與致敏性的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)三種糖基化蛋白產(chǎn)物的致敏性顯著降低，與低溫和蒸煮糖基化蛋白產(chǎn)物對(duì)比，高壓高熱糖基化大豆β-伴球蛋白的表位結(jié)構(gòu)破壞最顯著，引起小鼠致敏反應(yīng)最弱。Jürgen 等[36]采用同樣的方法用果寡糖對(duì)大豆7S與11S蛋白進(jìn)行糖基化修飾，證明糖基化可使其結(jié)構(gòu)改變，致敏性降低了90%。布冠好等[37]利用葡聚糖分別與大豆球蛋白和大豆β-伴蛋白進(jìn)行糖基化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大豆球蛋白的致敏性僅降低18.12%，大豆β-伴球蛋白降低36.90%。通過對(duì)大豆主要抗原蛋白的序列和表位模擬分析，推測(cè)出大豆β-伴球蛋白α-亞基的線性表位集中在序列的前段，而β-轉(zhuǎn)角多分布于該蛋白表面，因此β-轉(zhuǎn)角更容易構(gòu)建抗原表位[38]。研究也表明，大豆抗原蛋白糖基化可使分子間氫鍵遭到破壞、作用力降低，蛋白質(zhì)分子展開，使β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲數(shù)量減少，表位空間構(gòu)象消失，致敏性降低[37]。

以上結(jié)果說明，大豆抗原蛋白糖基化并不能完全消除其致敏性。其主要原因在于糖基化不能破壞大豆抗原蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)，因此線性表位仍存在[39]；而蛋白質(zhì)內(nèi)部二硫鍵和糖基的引入也增強(qiáng)了抗原蛋白的熱穩(wěn)定性，也對(duì)表位產(chǎn)生保護(hù)作用；同時(shí)糖基化使大豆抗原蛋白熱集聚，包埋了部分抗原表位[13]，另外，大豆球蛋白或大豆β-伴球蛋白所含的N-糖鏈可以誘導(dǎo)特定的免疫反應(yīng)，對(duì)過敏發(fā)生起著重要作用[3]。如Kuhne 等[40]于2015 年發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)上的N-糖鏈?zhǔn)墙Y(jié)合IgE的表位；除此之外，糖基化降低大豆抗原蛋白的致敏性程度還會(huì)受到糖的種類、糖基化條件（處理時(shí)間、溫度、抗原蛋白/多糖值以及pH等的影響）。因此，糖基化并不能完全消除抗原蛋白的致敏性。

3.2 糖基化大豆抗原蛋白的易消化性

糖基化的蛋白質(zhì)易被消化道消化和吸收。劉靜媛等[41]研究表明，在模擬胃消化中，大豆蛋白-葡萄糖糖基化產(chǎn)物與大豆蛋白對(duì)比發(fā)現(xiàn)小分子量肽更多；經(jīng)Caco-2單層細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)試驗(yàn)，糖基化大豆蛋白的氨基酸損失下降，吸收增加。任方林等[42]研究模擬胃腸消化大豆乳清蛋白糖基化產(chǎn)物時(shí)也證實(shí)，糖基化大豆蛋白的消化率提高。通常糖基化修飾提高其溶解性，且不改變大豆抗原蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，但改變?nèi)?jí)結(jié)構(gòu)，使其呈“熔融”態(tài)，有利于蛋白酶的酶解消化[43]。另有試驗(yàn)表明，腸道菌群能夠利用美拉德反應(yīng)復(fù)合物作為自身合成所需的C源和N源（例如β-乳球蛋白-半乳糖/乳糖復(fù)合物）[44]，促進(jìn)消化。然而，研究也表明，糖基化使大豆球蛋白或β-伴球蛋白聚集，且結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，具有抵抗蛋白質(zhì)水解酶的作用[45]。

3.3 糖基化大豆抗原蛋白酶解物的抑菌特性

研究證明，酶解制備的大豆β-伴球蛋白糖肽可抑制細(xì)菌黏附并具有調(diào)節(jié)腸道屏障功能的活性。任建華[46]以大豆糖肽為試驗(yàn)材料研究其對(duì)病原菌黏附腸道細(xì)胞的抑制效果發(fā)現(xiàn)，對(duì)試驗(yàn)所用的大腸桿菌026（Escherichia coli026）、大腸桿菌0114（Escherichia coli0114）、腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis）、鼠傷寒沙門氏菌LT2（S. typhimuriumLT2）等腸道病原菌有一定的抑制黏附作用。進(jìn)一步利用高碘酸鹽氧化破壞大豆糖肽中的糖鏈后，發(fā)現(xiàn)對(duì)E. coli026、E. coli0114的黏附效果明顯下降，且高碘酸鈉氧化大豆糖肽在增加細(xì)菌細(xì)胞膜流動(dòng)性方面小于完整的大豆糖肽。這表明糖鏈在抑制大腸桿菌黏附中發(fā)揮了重要作用。蛋白質(zhì)糖基化可產(chǎn)生類黑素，類黑素具有抗菌活性。同樣，美拉德反應(yīng)發(fā)現(xiàn)水溶性氨基酸-糖體系也有類黑素產(chǎn)生，通過抑菌試驗(yàn)表明，類黑素抑制大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，但抑制金黃色葡萄球菌能力更強(qiáng)[47]。另外，蛋白質(zhì)糖基化產(chǎn)生的某些副產(chǎn)物也具有抗菌效果，通過影響細(xì)菌胞壁、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)或核酸等干預(yù)細(xì)菌繁殖[48]。因此，將糖基化蛋白質(zhì)產(chǎn)物用作添加劑用到食品或飼料中，可以延長保質(zhì)期。例如，殼聚糖糖基化蛋白作為一種抗菌復(fù)合物已成功用于食品的保鮮中[49]。研究也表明糖基化大豆β-伴球蛋白酶解產(chǎn)物具有抑制病原菌-特別是大腸桿菌對(duì)腸上皮細(xì)胞的黏附與感染，具有明顯地改善腸道微環(huán)境、預(yù)防腸炎和調(diào)節(jié)腸黏膜屏障功能的活性。另外，基于美拉德反應(yīng)的糖基化蛋白復(fù)合物由于有較好的溶解性、乳化性和抗離子強(qiáng)度、極端pH以及熱穩(wěn)定性的特性，目前作為微膠囊已被廣泛應(yīng)于生物活性物質(zhì)、藥物的遞送[15]。如將葡萄糖-精氨酸糖基化復(fù)合物和聚己內(nèi)酯作用制備納米纖維薄膜，該膜具有濕潤度和孔隙度，在臨床上可用于傷口愈合的敷料以抑制金黃色葡萄球菌等病原菌的生長，預(yù)防腸道感染或防止腸道炎癥惡化。但相對(duì)于食品工業(yè)，美拉德反應(yīng)復(fù)合物在醫(yī)藥方面的應(yīng)用還較少。

4 糖基化修飾大豆抗原蛋白的挑戰(zhàn)與展望

糖基化修飾通過影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)使其具備優(yōu)良的功能特性和理想的生物學(xué)活性，但其在食品或保健品中的應(yīng)用仍面臨挑戰(zhàn)。第一，糖基化蛋白的褐變不可避免；第二，糖基化造成部分氨基酸損失，導(dǎo)致營養(yǎng)價(jià)值降低；第三，糖基化過程可能產(chǎn)生一些（如5-羥甲基糠醛、丙烯酰胺、雜環(huán)胺等）有毒副作用物質(zhì)，或許存在健康風(fēng)險(xiǎn)；第四，糖基化的大豆抗原蛋白對(duì)線性表位影響較小，終產(chǎn)物仍具有致敏性；第五，糖基化蛋白的反應(yīng)機(jī)制尚不完全清楚，反應(yīng)產(chǎn)物組成復(fù)雜，反應(yīng)條件較難控制，且與機(jī)體代謝、腸黏膜微生態(tài)平衡的關(guān)系也不完全清楚等，對(duì)其實(shí)際應(yīng)用產(chǎn)生限制。

面對(duì)上述挑戰(zhàn)，今后研究應(yīng)重點(diǎn)考慮一下幾個(gè)方面：第一，控制大豆抗原蛋白糖基化中的毒副反應(yīng)；第二，構(gòu)建糖基化反應(yīng)穩(wěn)態(tài)動(dòng)力學(xué)模型，實(shí)現(xiàn)糖基化的可控；第三，開發(fā)各種精準(zhǔn)分析與檢測(cè)糖基化產(chǎn)物的方法；第四，探索糖基化機(jī)制，構(gòu)建其構(gòu)效關(guān)系；第五，深入研究糖基化產(chǎn)物的功能特性與生物活性以及對(duì)機(jī)體的影響，拓寬其在食品或飼料、醫(yī)學(xué)、工程材料等領(lǐng)域的應(yīng)用。另外，研究已證實(shí)，蛋白質(zhì)的糖基化反應(yīng)也發(fā)生在RNA上，這為其研究打開了新的領(lǐng)域。