■張秀江 胡 虹 劉 麗 解復紅 馮 菲 馬 煥 郭 恒 向凌云*

(1.河南省科學院生物研究所有限責任公司，河南鄭州 450008；2.河南省工業(yè)酶工程技術研究中心，河南鄭州 450008）

杜仲（Eucommia ulmoides）屬杜仲科、杜仲屬的多年生落葉喬木，是我國特有珍稀的傳統(tǒng)中藥材。《神農(nóng)本草經(jīng)》記載杜仲性溫、味甘、無毒。研究表明，杜仲葉不僅含有豐富的蛋白質(zhì)、微量元素、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)[1-2]，還具備藥理和生理活性功能[3-4]。杜仲葉和杜仲皮有相似的活性成分，在消炎、殺菌、抗氧化、提高機體免疫力等藥理方面具備相似的功效[5]。在日糧中添加杜仲葉，能顯著改善動物機體免疫功能，增強對疾病的抵抗能力，促進動物健康，提高飼料利用率，改善肉質(zhì)及風味。2012 年，農(nóng)業(yè)部已將杜仲葉、杜仲皮列入《飼料原料目錄》。杜仲葉及其提取物作為一類功能型飼料原料，應用于豬、禽、水產(chǎn)動物及部分反芻動物飼料中效果顯著，市場前景廣闊。

木本植物中較高的木質(zhì)纖維素含量往往影響單胃動物對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。單寧易與飼料中的營養(yǎng)成分結(jié)合，造成營養(yǎng)成分利用不充分，降低飼料的營養(yǎng)價值，單寧含量過高還影響飼料的適口性，導致動物采食量下降[6]。杜仲葉中的植酸影響單胃動物蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)代謝以及消化酶的活性。目前關于微生物發(fā)酵杜仲葉、研發(fā)優(yōu)質(zhì)高效杜仲飼料原料、增加其在動物養(yǎng)殖中的添加量和使用效果等方面的研究報道還較少。粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)是子囊菌門（Ascomycoya）、子囊菌綱（Ascomycetes）、糞殼目（Sordariales）、糞殼科（Sordariaceae）、脈孢菌屬（Neurospora）的真菌，其高產(chǎn)纖維素酶、漆酶和多種消化酶的特性為其發(fā)酵含纖維素較高的木本植物飼料奠定了良好的基礎[7-8]。本試驗利用粗糙脈孢菌固體發(fā)酵杜仲葉，探討發(fā)酵過程對杜仲葉飼用價值的影響，以期為杜仲葉在飼料中的應用提供技術支持。

1 材料和方法

1.1 杜仲葉發(fā)酵飼料制備

1.1.1 菌種

試驗用粗糙脈孢菌由河南省工業(yè)酶工程技術研究中心提供。將粗糙脈孢菌接種到PDA 試管斜面培養(yǎng)基上擴繁2次，然后無菌接種到PDA試管斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h，備用。

1.1.2 種子培養(yǎng)基

葡萄糖10.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，酵母浸粉3.0 g/L，麥芽汁3.0 g/L，磷酸二氫鉀2.0 g/L，硫酸鎂0.3 g/L，氯化鈣0.3 g/L，硫酸亞鐵5.0 mg/L，硫酸鋅1.4 mg/L，硫酸錳1.6 mg/L，氯化鈷2.0 mg/L，pH 5.5，121 ℃滅菌20 min，備用。

1.1.3 發(fā)酵種子液培養(yǎng)

500 mL 三角瓶裝入200 mL 種子培養(yǎng)基，接入適量試管斜面種子，30 ℃、180 r/min恒溫搖床培養(yǎng)60 h，備用。

1.1.4 原料

杜仲葉采于7 月中旬河南省羅山縣莽張鎮(zhèn)。葉片選擇3～5 年生的杜仲幼樹，高、中、低部位隨機摘取，自然條件晾曬至含水量10%以下，粉碎過30 目篩，裝袋備用。玉米粉、麩皮、稻糠為市售產(chǎn)品。

1.2 杜仲葉發(fā)酵試驗

稱取杜仲葉粉450 g、玉米粉25 g、麩皮12.5 g、稻糠12.5 g，攪拌均勻后加水使其含水量達到60%，pH自然，制成杜仲葉發(fā)酵培養(yǎng)基。將發(fā)酵培養(yǎng)基裝入1 000 mL 三角瓶中，121 ℃滅菌60 min，冷卻后按培養(yǎng)基總質(zhì)量的8%接入粗糙脈孢菌發(fā)酵種子液，38 ℃恒溫培養(yǎng)15 d，得到杜仲葉發(fā)酵培養(yǎng)物。

1.3 指標測定

將發(fā)酵培養(yǎng)物置于50～60 ℃的烘箱干燥至恒重，粉碎過40 目篩，備用。隨機抽取杜仲葉發(fā)酵前培養(yǎng)基樣品和發(fā)酵后培養(yǎng)物樣品各200 g，分別測定營養(yǎng)成分、抗營養(yǎng)成分和功效成分含量。

1.3.1 杜仲葉營養(yǎng)成分含量測定

粗蛋白、游離氨基酸、粗脂肪、有機物、鈣、總磷含量按GB/T 6432—2018、GB/T 30987—2020、GB/T 6433—2006、GB/T 6438—2007、GB/T 6436—2018、GB/T 6437—2018的方法進行檢測。

1.3.2 發(fā)酵杜仲葉抗營養(yǎng)成分含量測定

粗纖維、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、酸性洗滌木質(zhì)素、植酸、單寧含量按GB/T 6434—2006、GB/T 20806—2006、NY/T 1459—2007、GB/T 20805—2006、GB 5009.153—2016、GB/T 27985—2011 的方法進行檢測。

1.3.3 發(fā)酵杜仲葉功效成分含量測定

綠原酸、總黃酮按GB/T 22250—2008、NY/T 2010—2011 的方法進行檢測；桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸按劉靜等[9]的方法進行檢測；總多酚按張琳杰等[10]的方法進行檢測；番茄紅素按李陳陳等[11]的方法進行檢測。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)采用DPS 9.50 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。結(jié)果以“平均值±標準差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵對杜仲葉營養(yǎng)成分含量的影響

由表1可知，發(fā)酵后杜仲葉營養(yǎng)成分含量發(fā)生了改變。與發(fā)酵前相比，粗蛋白含量提高13.26%，游離氨基酸含量提高1.49 倍，差異顯著（P＜0.05）；粗脂肪含量降低1.79%，有機物含量提高1.51%，鈣含量提高1.80%，差異不顯著（P＞0.05）；總磷含量提高93.75%，差異顯著（P＜0.05）。

表1 發(fā)酵對杜仲葉營養(yǎng)成分含量的影響（風干基礎）

2.2 發(fā)酵對杜仲葉抗營養(yǎng)成分含量的影響

由表2可知，發(fā)酵后杜仲葉抗營養(yǎng)成分含量與發(fā)酵前相比，粗纖維、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、酸性洗滌木質(zhì)素、植酸、單寧含量分別降低20.64%、19.26%、20.36%、23.91%、44.71%、58.86%，差異均顯著（P＜0.05）。

表2 發(fā)酵對杜仲葉抗營養(yǎng)成分含量的影響（風干基礎）

2.3 發(fā)酵對杜仲葉功效成分含量的影響

由表3可以看出，發(fā)酵后杜仲葉中功效成分含量與發(fā)酵前相比，綠原酸含量提高57.68%，總黃酮含量提高39.66%，桃葉珊瑚苷含量降低11.54%，京尼平苷酸含量降低9.30%，差異均顯著（P＜0.05）；總多酚含量降低0.34%，差異不顯著（P＞0.05）；番茄紅素發(fā)酵前無檢出，發(fā)酵后含量達到1.86 mg/g，差異顯著（P＜0.05）。

表3 發(fā)酵對杜仲葉功效成分含量的影響（風干基礎）

3 討論

3.1 發(fā)酵對杜仲葉營養(yǎng)成分含量的影響

杜仲葉經(jīng)粗糙脈孢菌發(fā)酵，被纖維素、半纖維素和木質(zhì)素緊密包裹的蛋白質(zhì)充分釋放出來并被降解成小肽、游離氨基酸等，其中非蛋白氮經(jīng)微生物作用轉(zhuǎn)化為菌體蛋白，提高粗蛋白含量。梅德洪[12]應用酵母菌和乳酸菌發(fā)酵杜仲葉，發(fā)酵后杜仲葉粗蛋白和水解氨基酸含量增加。賈金如[13]研究粗糙脈孢菌固體發(fā)酵稻草，獲得稻草發(fā)酵飼料真蛋白含量達到4.78%～7.23%；與產(chǎn)朊假絲酵母混菌發(fā)酵，稻草發(fā)酵飼料中真蛋白含量提高147.24%，粗蛋白含量提高67.83%；與產(chǎn)朊假絲酵母、黃孢原毛平革菌混菌發(fā)酵，稻草發(fā)酵飼料中真蛋白含量提高123.37%，粗蛋白含量提高70.31%。吳邦國[14]通過粗糙脈孢菌發(fā)酵處理玉米秸稈，真蛋白含量提高2.73倍。葉俊等[15]、黃文利等[16]研究應用粗糙脈孢菌固體發(fā)酵豆渣，發(fā)酵培養(yǎng)物中粗蛋白含量由12.16%提高到23.80%。張軍民等[17]、董娟娥等[18]以乳酸菌發(fā)酵杜仲葉，發(fā)酵后蛋白質(zhì)含量稍有降低。王翔等[19]研究發(fā)現(xiàn)，杜仲葉中必需氨基酸與總氨基酸含量之比大于40%，必需氨基酸與非必需氨基酸含量之比大于60%，表明杜仲葉的蛋白屬于優(yōu)質(zhì)植物蛋白質(zhì)。本試驗杜仲葉經(jīng)粗糙脈孢菌發(fā)酵后粗蛋白含量由12.90%提高到14.61%，游離氨基酸含量由1.16 mg/g 提高到1.89 mg/g，蛋白質(zhì)的含量和質(zhì)量都得到顯著提升，高于大多數(shù)禾谷類植物飼料，因此，發(fā)酵杜仲葉可以作為一定比例蛋白質(zhì)來源，補充動物對蛋白質(zhì)的營養(yǎng)需求。梅德洪[12]應用酵母菌和乳酸菌發(fā)酵杜仲葉，葉俊等[15]應用粗糙脈孢菌發(fā)酵豆渣，發(fā)酵后粗脂肪含量都得到提升。本試驗結(jié)果顯示發(fā)酵后粗脂肪含量有所降低，可能與粗糙脈孢菌在發(fā)酵杜仲葉的過程中消耗部分脂肪有關。發(fā)酵對杜仲葉中有機物、鈣和總磷含量影響的研究報道較少，張軍民等[17]、董娟娥等[18]、梅德洪[12]以酵母菌、乳酸菌發(fā)酵杜仲葉可提高杜仲葉中有機物和總磷含量。杜仲葉中的鈣和磷通常以植酸鹽絡合物的形式存在，不但降低了鈣、磷離子濃度，而且動物很難利用。粗糙脈孢菌發(fā)酵過程中分泌的植酸酶能催化植酸鹽降解，增加杜仲葉中鈣和磷的含量[20]。本試驗結(jié)果顯示發(fā)酵后杜仲葉中有機物、鈣含量有所增加，總磷含量顯著提高，與前述學者研究結(jié)果一致。

3.2 發(fā)酵對杜仲葉抗營養(yǎng)成分含量的影響

粗糙脈孢菌具有完整的木質(zhì)纖維素降解酶系，培養(yǎng)簡單且生長迅速，具備降解纖維素、半纖維素、木質(zhì)素等功能。吳邦國[14]通過粗糙脈孢菌發(fā)酵處理玉米秸稈，半纖維素降解率達到39.00%，木質(zhì)素降解率達到21.17%。賈金如[13]研究粗糙脈孢菌與產(chǎn)朊假絲酵母混菌發(fā)酵，稻草中纖維素和半纖維素含量降低15.44%和11.42%。楊風玲等[21]研究報道顯示，粗糙脈孢菌對稻草粗纖維降解率為49.65%。葉俊等[15]應用粗糙脈孢菌發(fā)酵豆渣，粗纖維的降解率達到88.68%。梅德洪[12]、張軍民等[17]、董娟娥等[18]應用酵母菌和乳酸菌發(fā)酵杜仲葉，發(fā)酵后杜仲葉中粗纖維、酸性洗滌纖維含量顯著降低?；┢G等[22]研究猴頭菇、金針菇和平菇固態(tài)發(fā)酵對杜仲葉渣中半纖維素、纖維素和木質(zhì)素降解的影響，結(jié)果表明，三種食用菌固態(tài)發(fā)酵后半纖維素含量下降51.35%～55.29%，纖維素含量下降40.70%～82.53%。任志青等[23]、于新穎[24]以粗糙脈孢菌固體發(fā)酵豆粕和菜粕，發(fā)酵過程中纖維素得到有效降解，植酸等抗營養(yǎng)因子含量顯著降低。周小玲[20]研究發(fā)現(xiàn)，粗糙脈孢菌發(fā)酵過程中分泌的植酸酶能催化植物來源飼料中的植酸分解生成無機磷酸和肌酐，降低植酸含量，減輕其對日糧中蛋白質(zhì)、微量元素和維生素的螯合作用，提高營養(yǎng)成分利用效率。含單寧多的飼料適口性差，動物不愿采食或拒絕采食。單寧具有較強收斂性，易與蛋白質(zhì)結(jié)合，降低消化酶活性，不利于營養(yǎng)物質(zhì)的消化和利用。Liu 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌發(fā)酵可以水解谷物飼料中的單寧和植酸，增強消化酶活性，提高采食量和蛋白質(zhì)利用率。董娟娥等[18]研究發(fā)現(xiàn)，杜仲葉經(jīng)過發(fā)酵處理，含澀味的單寧被氧化，含量顯著降低，適口性增強。本試驗中發(fā)酵后杜仲葉抗營養(yǎng)成分粗纖維、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、酸性洗滌木質(zhì)素、植酸、單寧含量顯著降低，與前述學者研究結(jié)果一致。

3.3 發(fā)酵對杜仲葉功效成分含量的影響

杜仲葉中除含粗蛋白、維生素和微量元素外，還富含自身獨有的天然功效活性成分綠原酸、黃酮類、環(huán)烯醚萜類、多酚類等。這些功效成分的協(xié)同作用，不僅使杜仲葉具有飼用價值，同時又具有藥用和保健價值，這是杜仲葉作為功能型飼料開發(fā)利用的基礎。杜仲葉與杜仲皮、花和果實相比，具有更強的抗氧化活性。杜仲葉中抗氧化成分較多，如環(huán)烯醚萜類化合物、酚類、苯丙素類化合物等。酚類是其最活躍的抗氧化劑，一方面改善機體抗氧化酶活性，另一方面，多酚類金屬螯合電位對鐵和銅誘導的自由基反應起保護作用，酚羥基的氫與自由基結(jié)合等抑制自由基反應而起到抗氧化作用[26-28]。綠原酸作為杜仲葉中廣泛存在的多酚類物質(zhì)，由于含有一定量的R-OH 基，形成了具有抗氧化作用的羥基自由基，是一種有效的酚型抗氧化劑。同時綠原酸對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、停乳鏈球菌、沙門氏菌、乳房鏈球菌等均有一定的抑菌作用，能夠緩解動物腸道氧化應激和炎癥反應，維持腸道平衡和免疫功能，保障動物腸道健康[29]。桃葉珊瑚苷類化合物能夠有效抑制炎癥因子IL-6和白細胞介素-10的釋放，同時抑制γ-干擾素磷酸化而起到抗炎作用[30]。楊志友等[31]研究杜仲葉中京尼平苷酸通過阻攔P38蛋白和P65蛋白的磷酸化，降低脂多糖誘導的促炎細胞因子白細胞介素-1β、白細胞介素-6、腫瘤壞死因子的釋放起到抗炎殺菌的特性。胡金家等[32]研究表明，杜仲葉中總黃酮類和多酚類化合物能增強刀豆素（CONA）對小鼠淋巴細胞的增殖反應，顯著增強巨噬細胞的吞噬能力，增加血清中溶血素等免疫活性物質(zhì)的含量，從而提高機體的免疫力。番茄紅素（LYCOPENE）是一種由11 個共軛及2個非共軛雙鍵組成的非環(huán)狀平面脂溶性不飽和碳氫化合物，它是類胡蘿卜素的一種，作為飼料添加劑，具有極強的抗氧化性、抗菌和消炎等生理活性[33]。彭密軍等[34]研究報道，杜仲葉經(jīng)發(fā)酵，綠原酸的含量由2.67%提高到3.01%，總黃酮的含量由5.67%提高到6.52%。黃文利等[16]以粗糙脈孢菌發(fā)酵豆渣，發(fā)酵后豆渣中總黃酮含量由0.18%提高到0.73%，總酚含量由0.05%提高到0.33%。麻嘯濤[35]將杜仲微生物發(fā)酵和酶制劑聯(lián)合應用，前期發(fā)酵利用菌的生長，后期利用酶制劑來酶解杜仲葉中的木質(zhì)素和纖維素，有效釋放杜仲的有效成分，可使杜仲葉中綠原酸、桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、杜仲黃酮等有效成分利用率提高4～28倍。張軍民等[17]、董娟娥等[18]以乳酸菌發(fā)酵杜仲葉，發(fā)酵后京尼平苷酸、總黃酮、綠原酸、桃葉珊瑚苷等含量稍有降低。本試驗發(fā)酵后杜仲葉中綠原酸和總黃酮含量顯著增加，與前述大多數(shù)學者研究結(jié)果一致。桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、總多酚在新鮮杜仲葉中含量較高，發(fā)酵后含量降低，可能與三者穩(wěn)定性較差，在粗糙脈孢菌發(fā)酵過程中容易被降解有關。李陳陳等[11]應用粗糙脈孢菌進行固體發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物中番茄紅素含量達到2.45 mg/g。本試驗發(fā)酵后杜仲葉中番茄紅素含量達到1.86 mg/g，表明發(fā)酵過程增加了杜仲葉中具備抗氧化性、抗菌和消炎等功效成分的種類和含量，有助于提高杜仲飼料產(chǎn)品的應用效果。

4 結(jié)論

粗糙脈孢菌固體發(fā)酵杜仲葉對其抗營養(yǎng)成分進行了降解，改變了營養(yǎng)成分和功效成分組成和含量，有助于增強飼用價值和保健功能。未來在杜仲葉發(fā)酵領域應加強菌、酶融合等新技術的研究與推廣應用，共同實現(xiàn)產(chǎn)品開發(fā)系列化、質(zhì)量控制標準化、應用添加微量化，讓杜仲這一古老的中國特有植物在養(yǎng)殖生產(chǎn)中應用起到提高飼料利用率、增強機體免疫力、平衡腸道菌群、改善畜產(chǎn)品品質(zhì)的功效。