李健 王鑫 杜忠偉 王旭 王斌 胡志強(qiáng)

DOI：10.20023/j.cnki.2095-5774.2023.05.008

收稿日期：2023-06-26

基金項(xiàng)目：財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助項(xiàng)目（CARS—20）；延邊州科技成果轉(zhuǎn)化計(jì)劃項(xiàng)目（2021NS12）

作者簡(jiǎn)介：*為通訊作者，胡志強(qiáng)（1981-），男，研究員，主要從事食藥用真菌研究工作，E-mail：ybnkysyj@163.com。

李健（1990-），男，助理研究員，碩士，主要從事食藥用真菌研究工作，E-mail：245824369@qq.com

摘要要：【目的】為篩選出伴栽天麻蜜環(huán)菌最佳原種培養(yǎng)基，以提高天麻產(chǎn)量?！痉椒ā客ㄟ^對(duì)4種伴栽天麻蜜環(huán)菌原種培養(yǎng)基進(jìn)行比較試驗(yàn)。【結(jié)果】發(fā)現(xiàn)以枝條培養(yǎng)基接種后菌絲復(fù)活時(shí)間最短，平均為4.33 d，菌索生長速度為9.00 mm/d，菌索長勢(shì)最好，菌索長滿袋時(shí)間最短，為26.33 d，雜菌污染率最低為8%，培養(yǎng)效果優(yōu)于其他3種培養(yǎng)基；木屑培養(yǎng)基、黃豆培養(yǎng)基和玉米粒培養(yǎng)基在接種后菌絲和菌索生長情況、雜菌污染率等差異均較小?！窘Y(jié)論】綜合各種因素，伴栽天麻蜜環(huán)菌最佳原種培養(yǎng)基為枝條培養(yǎng)基。

關(guān)鍵詞：天麻；蜜環(huán)菌；原種培養(yǎng)基

中圖分類號(hào)：S567.239? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文章編號(hào)：2095-5774（2023）05-0358-05

Screening of the Best Original Strain Culture Medium of Armillaria mellea

with Gastrodia elata as Companion

Li Jian1，Wang Xin1，Du Zhongwei1，Wang Xu1，Wang Bin2，Hu Zhiqiang1*

（1 Yanbian Academy of Agricultural Sciences，Yanji Experimental Station，CARS，Yanji，Jilin 133000，China;

2 Wangqing County Agriculture and Rural Affaris Bureau，Wangqing，Jilin 133200，China）

Abstract：【Objective】 To screen out the best original strain culture medium of Armillaria mellea with Gastrodia elata as Companion in order to increase the yield of Gastrodia elata. 【Method】The comparative test of four kinds of culture media of Armillaria mellea with? Gastrodia elata were conducted.【Result】It was found that the shortest time of hypha revivification time was 4.33 days after inoculation on branch culture medium，the growth rate of rhizomorph was 9.00 mm/d，rhizomorph growth vigor was the best，and the shortest time of rhizomorph to fulfill bag was 26.33 days，and the lowest contamination rate of miscellaneous bacteria was 8%. Culture effect on branch culture medium was better than that on three other media. Sawdust culture medium，soybean culture medium and corn kernel culture medium had little difference on hypha and rhizomorph growth status and contamination rate of miscellaneous bacteria after inoculation.【Conclusion】Branch culture medium was the best culture medium of Armillaria mellea with Gastrodia elata based on comprehensive comparison of various factors.

Key words：Gastrodia elata；Armillaria mellea；Original strain culture medium

蜜環(huán)菌（Armillaria mellea），又稱為蜜環(huán)蕈、苞谷蕈、青岡蕈，分類學(xué)上隸屬于擔(dān)子菌門Basidiomycota、傘菌目Agaricales、泡頭菌科Physalacriaceae、蜜環(huán)菌屬Armillaria［1］。蜜環(huán)菌在溫帶至熱帶地區(qū)均有分布，是一種兼性寄生真菌，經(jīng)常寄生于腐朽木表皮，其菌絲和菌索能夠分泌多種木質(zhì)纖維素水解酶來降解植物細(xì)胞壁，侵染宿主以獲取自身生長所需營養(yǎng)，是一種常見的森林病害菌［2］。在中國已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了15種蜜環(huán)菌，其中有9個(gè)特有種，云南、臺(tái)灣、河南、青海、山西、黑龍江、吉林、內(nèi)蒙古、西藏等多個(gè)省區(qū)為主要分布地區(qū)［3］。

蜜環(huán)菌子實(shí)體通常叫榛蘑，味道極其鮮美，其子實(shí)體、菌絲和菌索含有多種萜類化合物、食用菌多糖和人體必需的氨基酸及多種微量元素等，因此均可入藥，有提高免疫力、保護(hù)肝臟、抗癌、抗腫瘤、抗衰老等藥理作用，是一種名貴的食藥用真菌［4］。同時(shí)，蜜環(huán)菌又是名貴中藥材天麻（Gastrodia elata）的共生菌，因天麻在地下階段沒有根莖葉，只有開花時(shí)花莖才長出地面，全靠蜜環(huán)菌共生供給天麻生長所需營養(yǎng)，所以蜜環(huán)菌是天麻生長中唯一的外來營養(yǎng)源，是天麻人工栽培中非常重要的材料［5，6］。同樣，蜜環(huán)菌的生長也離不開天麻，蜜環(huán)菌通過分泌多種糖苷水解酶（glycosidehydrolase）降解天麻人工栽培所需木材中木質(zhì)纖維素獲得碳源，為蜜環(huán)菌生長發(fā)育提供必要的能量，分泌糖苷水解酶能力強(qiáng)的蜜環(huán)菌菌株更容易侵染木材獲取營養(yǎng)，使蜜環(huán)菌生長速率加快［7］。另外，蜜環(huán)菌通過分泌糖苷水解酶降解天麻表皮侵染天麻，天麻則依靠消化不斷入侵的菌絲獲取營養(yǎng)，完成自身的生長發(fā)育，提高天麻產(chǎn)量［8］。蜜環(huán)菌菌種在生產(chǎn)中分為三級(jí)，一級(jí)母種用于保存和運(yùn)輸，二級(jí)原種用于擴(kuò)大繁殖，三級(jí)栽培種用于生產(chǎn)栽培［9］。蜜環(huán)菌生長發(fā)育需要多種營養(yǎng)源，主要有碳源、氮源、無機(jī)鹽等［10］，雖然有研究表明蜜環(huán)菌可以利用多種營養(yǎng)源，但對(duì)最有效利用的營養(yǎng)源有選擇［11］，因此，不同配方培養(yǎng)基上蜜環(huán)菌菌種的生長情況不同。在適宜營養(yǎng)源培養(yǎng)基上，蜜環(huán)菌萌發(fā)速度快，污染率低，菌絲和菌索白嫩、粗壯，分枝多，生物量大，不僅可以縮短蜜環(huán)菌培養(yǎng)時(shí)間，降低蜜環(huán)菌生產(chǎn)成本，而且培養(yǎng)的蜜環(huán)菌健壯，在天麻栽培過程中可快速形成菌索侵染菌棒，與天麻建立共生關(guān)系后，盡早為天麻提供營養(yǎng)，提高天麻產(chǎn)量和質(zhì)量［12，13］。本試驗(yàn)通過篩選伴栽天麻蜜環(huán)菌最佳原種培養(yǎng)基，為提高蜜環(huán)菌菌種活力、天麻人工栽培產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試菌株

供試蜜環(huán)菌菌株為于海茹等［14］在吉林省和龍市八家子鎮(zhèn)林場(chǎng)野生蜜環(huán)菌菌材上分離獲得，篩選后獲得伴栽天麻最佳菌株，編號(hào)為M1，保藏在延邊朝鮮族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所實(shí)驗(yàn)室。

1.2主要試劑和儀器

試驗(yàn)用的試劑中，磷酸二氫鉀、硫酸鎂、葡萄糖、瓊脂、75%酒精、95%酒精等均為國產(chǎn)分析純。試驗(yàn)用的儀器有上海博迅YXQ-100SII立式壓力滅菌器，連云港國鑫GXMQ-EE-9.7JS培養(yǎng)基滅菌器，蘇州安泰SW-CJ-1BU潔凈工作臺(tái)，上海博迅HPX-9082MEB電熱恒溫培養(yǎng)箱，濟(jì)南普朗特PLT-G50全自動(dòng)定量灌裝機(jī)，天津泰斯特DZ-10LⅢ蒸餾水器，上海雷磁PHS-3C pH計(jì)，常熟雙杰JJ223BC分析天平，北京福意聯(lián)FYL-YS-1028L恒溫凍箱。

1.3制作母種

母種培養(yǎng)基采用亢學(xué)平等［15］篩選的配方。將馬鈴薯洗凈去皮切塊，稱取馬鈴薯塊200 g、麥麩20 g、木屑50 g，在鍋中加蒸餾水1 000 mL，將馬鈴薯塊、麥麩、木屑煮爛，用紗布過濾留取濾液在鍋中繼續(xù)加熱，加入瓊脂粉15 g，待瓊脂完全溶解后再加入葡萄糖20 g、磷酸二氫鉀2 g、硫酸鎂1 g，補(bǔ)蒸餾水至1 000 mL，分裝于22 mm×200 mm試管中，分裝高度12 cm，塞好棉塞，121℃高溫高壓滅菌30 min，滅菌結(jié)束將試管豎直放置冷卻，潔凈工作臺(tái)上接種蜜環(huán)菌，置于25 ℃電熱恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)，定期觀察記錄菌絲復(fù)活時(shí)間，菌索長勢(shì)和菌索長滿試管時(shí)間。

1.4制作原種

原種培養(yǎng)基試驗(yàn)設(shè)置4種材料配方，木屑培養(yǎng)基（雜木屑78%、麥麩20%、白糖1%、石灰1%）、黃豆培養(yǎng)基（黃豆90%、雜木屑7.8%、麥麩2%、白糖0.1%、石膏粉0.1%）、玉米粒培養(yǎng)基（玉米粒90%、雜木屑7.8%、麥麩2%、白糖0.1%、石膏粉0.1%）、枝條培養(yǎng)基（枝條90%、雜木屑7.8%、麥麩2%、白糖0.1%、石膏粉0.1%）。

前3種培養(yǎng)基制作方法是選擇新鮮無霉變的原材料，其中黃豆和玉米粒先清洗除去雜物和破碎粒，放入鍋中煮至熟而不爛、漲而不破，內(nèi)部無白心，煮好后攤薄、翻動(dòng)晾干表面水分，直至內(nèi)濕外干、相互無粘結(jié)。裝袋前，3種培養(yǎng)基按照各原材料比例加水?dāng)嚢杈鶆颍梁?0％左右，用手緊握栽培料有水溢出無滴落為宜。用裝袋機(jī)裝入17 cm × 36 cm × 0.004 cm聚乙烯栽培袋中，每袋裝干料0.80 kg，121℃高溫高壓滅菌2 h后取出，冷卻后在潔凈工作臺(tái)上接入蜜環(huán)菌母種。

枝條培養(yǎng)基的制作方法是將黑木耳二級(jí)菌專用枝條用石灰水浸泡24 h，使枝條吸足水，并且要調(diào)節(jié)pH值至8。因其枝條容易扎破菌袋，所以選擇培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，每瓶裝干料0.80 kg。在進(jìn)行裝瓶操作時(shí)，將原材料按比例加水?dāng)嚢杈鶆?，先在培養(yǎng)瓶底部裝入1 cm左右輔料，放入雪糕棒后用輔料填補(bǔ)縫隙，最后在上層裝入1 cm左右輔料，蓋好瓶蓋，121℃高溫高壓滅菌2 h后取出，冷卻后在潔凈工作臺(tái)上接入蜜環(huán)菌母種。

1.5培養(yǎng)方法

發(fā)菌過程中，初期溫度28～30℃，使菌絲快速復(fù)活，培養(yǎng)時(shí)須避光培養(yǎng)，注意溫度和氧氣的供給，空氣濕度65%以下。第6～8 d檢查菌袋的污染情況，隔離污染的菌袋，對(duì)發(fā)菌室進(jìn)行潔凈化管理，第8 d后保持溫度25～30℃，注意將CO2濃度控制在400 mg/g以下，勤通風(fēng)，約培養(yǎng)30～40 d，菌絲長滿菌袋。

1.6記錄分析

制作4種原種培養(yǎng)基各30袋，詳細(xì)記錄每種培養(yǎng)基處理中菌絲復(fù)活時(shí)間、菌索生長速度、菌索長勢(shì)、菌索長滿菌袋時(shí)間和雜菌污染率等數(shù)據(jù)，觀察菌株生長情況。采用Excel 2017進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，SPSS 25采用鄧肯分析法進(jìn)行差異顯著性分析。

2結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基中蜜環(huán)菌原種生長情況比較

比較4種原種培養(yǎng)基中的蜜環(huán)菌原種生長情況見表1。菌絲復(fù)活時(shí)間以枝條培養(yǎng)基的4.33 d為最短，其次是木屑、黃豆培養(yǎng)基，此三者間無顯著差異；而玉米粒培養(yǎng)基需時(shí)7.00 d為最長，與其他3種的差異顯著。菌索日均生長速度以枝條培養(yǎng)基最快為9.00 mm，顯著快于其他3種培養(yǎng)基；其次是木屑、黃豆培養(yǎng)基，玉米粒培養(yǎng)基最慢為5.83 mm，后3種原種培養(yǎng)基菌索生長速度無顯著差異。枝條培養(yǎng)基菌索長滿袋時(shí)間平均為26.33 d，較木屑培養(yǎng)基菌索長滿菌袋的41.33 d早了15 d，與玉米粒培養(yǎng)基差異不顯著，但與木屑、黃豆培養(yǎng)基形成顯著差異。4種培養(yǎng)基中，以枝條培養(yǎng)基的菌絲復(fù)活時(shí)間最短，菌索生長速度最快、長滿菌袋時(shí)間最短，而菌索長勢(shì)最好，表現(xiàn)為極粗壯、潔白、濃密、分枝多，不易核化，且雜菌污染率最低為8%，低于其他3種培養(yǎng)基。

2.2 蜜環(huán)菌菌株在不同原種培養(yǎng)基中的生長情況

接種40 d后4種配方原種培養(yǎng)基蜜環(huán)菌的長勢(shì)差異很大（封三? 圖1）。枝條培養(yǎng)基菌索長勢(shì)最好，菌索極粗壯，分枝多。玉米粒培養(yǎng)基菌索長勢(shì)較好，菌索也較粗壯，分枝較多，但其玉米粒培養(yǎng)基容易受雜菌污染，污染率高。木屑培養(yǎng)基和黃豆培養(yǎng)基菌索的長勢(shì)不好，菌索纖弱，分枝較少。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)通過對(duì)4種伴栽天麻蜜環(huán)菌原種培養(yǎng)基進(jìn)行比較試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)枝條培養(yǎng)基的菌絲復(fù)活時(shí)間最短，平均為4.33 d，雜菌污染率最低為8%，菌索日均生長速度最快為9.00 mm，菌索長勢(shì)最好，菌索粗壯，潔白，濃密，分枝多，不易核化，長滿菌袋時(shí)間平均為26.33 d。玉米粒培養(yǎng)基菌絲復(fù)活時(shí)間最長，平均為7.00 d，菌索長勢(shì)較好，菌索也較粗壯，分枝較多，但此培養(yǎng)基容易受雜菌污染，污染率太高，為17%，不適宜作為伴栽天麻蜜環(huán)菌原種培養(yǎng)基。木屑培養(yǎng)基和黃豆培養(yǎng)基則菌索長勢(shì)不好，菌索纖弱，分枝較少。王鑫等［16］篩選出蜜環(huán)菌最佳原種培養(yǎng)基為木屑培養(yǎng)基，王守現(xiàn)等［17］篩選出蜜環(huán)菌最佳原種培養(yǎng)基為木屑+玉米粒培養(yǎng)基，但本試驗(yàn)通過比較發(fā)現(xiàn)枝條培養(yǎng)基要優(yōu)于木屑培養(yǎng)基和木屑+玉米粒培養(yǎng)基，且接種方便快捷。蜜環(huán)菌的原種對(duì)天麻的質(zhì)量和產(chǎn)量影響很大，蜜環(huán)菌活力強(qiáng)則長勢(shì)好，菌索粗壯，分枝多，菌絲潔白。因此，在天麻栽培過程中選擇菌索活力強(qiáng)的蜜環(huán)菌原種，利用適合蜜環(huán)菌原種生長的培養(yǎng)基培養(yǎng)縮短生長時(shí)間，可解決蜜環(huán)菌生產(chǎn)過程中菌種老化導(dǎo)致天麻減產(chǎn)等問題。

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（責(zé)任編輯：黃雄峰）