■楊乾龍 王金銘 陳麗紅 張鐵濤 吳 炎 王曉旭 鮑 坤 王凱英

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，特種經(jīng)濟動物分子生物學(xué)國家重點實驗室，吉林長春 130112）

梅花鹿仔鹿是梅花鹿產(chǎn)業(yè)發(fā)展的未來，其生長狀況能夠影響鹿茸的品質(zhì)及產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟效益。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)和氨基酸的合理利用，能夠保護環(huán)境，降低成本，促進仔鹿的健康生長發(fā)育[1-3]。為了更好的研究蛋白質(zhì)和氨基酸，前人提出總代謝氨基酸的概念，分別是前胃和腸道內(nèi)的蛋白質(zhì)的分解以及氨基酸的代謝[4]。瘤胃游離氨基酸以及血清游離基酸能夠在一定程度上反映出氨基酸的代謝狀況。合理的氨基酸組成，能夠提高蛋白質(zhì)的利用效率，并且有利于動物的生長。半胱氨酸是重要的含硫氨基酸，是日糧中的主要氨基酸之一。直接參與氨基酸代謝，與動物生長和腸道健康密切相關(guān)[5-6]。適宜的半胱氨酸水平是滿足身體含硫氨基酸需求的關(guān)鍵因素。半胱氨酸能夠代謝產(chǎn)生?；撬?、谷胱甘肽和硫化氫等[7]，具有抗應(yīng)激、緩解損傷和促生長等多種生理功能[7-8]，對于不同健康狀況和生長時期的動物均具有良好的作用[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，半胱氨酸可以增加大鼠腸道內(nèi)乳酸菌和雙歧桿菌水平，降低大腸桿菌水平[11]；增加仔豬腸道菌群中的細菌數(shù)量[12]。半胱氨酸可能對于瘤胃發(fā)酵和氨基酸代謝同樣具有重要的作用。因此，本試驗主要研究飼糧半胱氨酸水平對梅花鹿仔鹿瘤胃發(fā)育過程中發(fā)酵狀況及氨基酸代謝的影響，以期能夠?qū)Π被嵩趧游矬w內(nèi)代謝提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

L-半胱氨酸購自安徽洪昌生物科技有限公司；梅花鹿選自農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長白山野生生物資源重點野外科學(xué)觀測試驗站。

1.2 試驗設(shè)計和試驗動物

采用單因素試驗設(shè)計，將16只3月齡健康雄性梅花鹿（24.42±3.86）kg 分為4 組，每組4 個重復(fù)，每個重復(fù)1 只，組間體重差異不顯著（P＜0.05）。其中對照組半胱氨酸水平為2.8 g/kg（Ⅰ組，基礎(chǔ)飼糧），試驗組飼喂半胱氨酸水平為4.8 g/kg（Ⅱ組，基礎(chǔ)日糧+2.0 g/kg半胱氨酸）、6.8 g/kg（Ⅲ組，基礎(chǔ)日糧+4.0 g/kg 半胱氨酸）和10.8 g/kg（Ⅳ組，基礎(chǔ)日糧+8.0 g/kg 半胱氨酸）的試驗飼糧。

1.3 試驗飼料與飼養(yǎng)管理

本試驗基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗地點：農(nóng)業(yè)農(nóng)村部長白山野生生物資源重點野外科學(xué)觀測試驗站。試驗時間：2020年9月20日～2020年11月5 日，其中試驗預(yù)試期15 d，正試期30 d。每天7：30和15：30定量飼喂，自由飲水。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平（風(fēng)干基礎(chǔ)）

1.4 測定指標與方法

1.4.1 瘤胃液發(fā)酵參數(shù)及游離氨基酸測定

試驗最后1 天晨飼前對梅花鹿麻醉并參考崔學(xué)哲[13]方法收集瘤胃液。

瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸測定：瘤胃5 400 r/min 4 ℃離心10 min，取上清液按5∶1（上清液∶內(nèi)標液）加入含有內(nèi)標物2-乙基丁酸（2EB）的25%偏磷酸溶液，混合均勻后-20 ℃低溫冷凍過夜；10 000 r/min 4 ℃離心10 min，取上清液用氣相色譜儀（GC-6800 氣相色譜儀，北京北分天普儀器技術(shù)有限公司），配置Φ6 mm×2 m石英玻璃填充柱（固定相15% FFAP，擔(dān)體80～100目Chromosorb）測定。

瘤胃液氨態(tài)氮濃度：采用堿性次氯酸鈉-苯酚分光光度測定方法并參考T/TAIA 0004—2020標準。

微生物蛋白測定：采用考馬斯亮藍法，測定試劑盒購自南京建成科技有限公司，嚴格按照說明書進行操作。

瘤胃液氨基酸：將瘤胃液12 000 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液與三氯乙酸（10%）1∶1 混合，12 000 r/min、4 ℃離心15 min 沉淀瘤胃蛋白，再取上清液過濾（濾膜，0.22 μm）至2 mL自動進樣瓶中,使用日立氨基酸分析儀[L-8900（鋰柱），天美(中國)科學(xué)儀器有限公司]生理體液分析方法進行測定。

1.4.2 氨基酸表觀消化率的測定

試驗結(jié)束前連續(xù)3 d 晨飼前收集部分糞樣，每個組別收集4袋新鮮糞樣，每袋大約收集100 g。去除鹿毛和沙礫，將收集的糞樣噴灑10%稀硫酸固氮，先85 ℃滅菌2 h，再65 ℃烘干至恒重，粉碎后過40 目篩。半胱氨酸和蛋氨酸采用氧化酸水解法參照GB/T 15399—2018測定；賴氨酸、蘇氨酸等采用酸水解法參照GB 5009.124—2016 測定。將處理的樣品，使用日立氨基酸分析儀[L-8900（鈉柱），天美（中國）科學(xué)儀器有限公司]固體樣本分析方法進行測定。

某氨基酸表觀消化率（%）=100-（100×A/A1×B1/B）

式中：A——飼糧中2 moL/L鹽酸不溶灰分百分含量；

A1——糞中2 moL/L鹽酸不溶灰分百分含量；

B1——糞中氨基酸百分含量；

B——飼糧中氨基酸百分含量，參照《動物營養(yǎng)學(xué)（第2版）》。

1.4.3 血清游離氨基酸測定

試驗最后1 天晨飼前對梅花鹿麻醉并進行頸靜脈采血，采集的血樣在帶有分離膠的促凝管中靜置至血清析出，3 500 r/min離心10 min出血清。將血清與三氯乙酸（10%）1∶1 混合，12 000 r/min、4 ℃離心15 min沉淀血清蛋白，取上清液過濾至2 mL自動進樣瓶，使用日立氨基酸分析儀[L-8900（鋰柱），天美（中國）科學(xué)儀器有限公司]生理體液分析方法進行測定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)先通過Excel 2016軟件進行整理，然后采用統(tǒng)計軟件SAS 9.4 進行one-way ANOVA 方差分析，并且采用Duncan’s法多重比較，所得到的結(jié)果采用“平均值±標準誤差”表示，并且以P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧半胱氨酸水平對離乳期梅花鹿瘤胃發(fā)酵的影響

由表2可知，飼料半胱氨酸水平顯著影響瘤胃液總揮發(fā)性脂肪酸和乙酸濃度（P＜0.05），Ⅲ組和Ⅳ組顯著低于Ⅰ組和Ⅱ組（P＜0.05）；飼料半胱氨酸水平顯著影響異丁酸、異戊酸和戊酸的濃度（P＜0.05），Ⅱ組顯著高于Ⅰ組（P＜0.05）；各組之間丙酸、丁酸、微生物蛋白和氨態(tài)氮濃度未達到顯著影響（P＞0.05）；各組間乙丙比影響未達到顯著水平（P＞0.05）。

表2 飼糧半胱氨酸水平對離乳期梅花鹿瘤胃發(fā)酵的影響

2.2 飼糧半胱氨酸水平對離乳期梅花鹿瘤胃液游離氨基酸及代謝物的影響

由表3可知，飼料半胱氨酸水平顯著影響瘤胃液半胱氨酸濃度（P＜0.05），Ⅳ組顯著高于Ⅱ組和Ⅲ組（P＜0.05）；飼料半胱氨酸水平顯著影響瘤胃液游離蛋氨酸、絲氨酸和鳥氨酸濃度（P＜0.05），Ⅱ組和Ⅳ組顯著低于Ⅰ組和Ⅲ組（P＜0.05）；飼料半胱氨酸水平顯著影響瘤胃液游離甘氨酸、脯氨酸和胱硫醚濃度（P＜0.05），Ⅱ組和Ⅳ組顯著低于Ⅲ組（P＜0.05）；飼料半胱氨酸水平顯著影響瘤胃液游離谷氨酸濃度（P＜0.05），Ⅳ組顯著低于Ⅰ組和Ⅲ組（P＜0.05）；飼料半胱氨酸水平顯著影響瘤胃液游離賴氨酸和丙氨酸濃度（P＜0.05），Ⅱ組和Ⅳ組顯著低于Ⅲ組（P＜0.05），Ⅳ組顯著低于Ⅰ組（P＜0.05）；飼料半胱氨酸水平顯著影響瘤胃液游離蘇氨酸濃度（P＜0.05），Ⅲ組顯著高于其他各組（P＜0.05）；飼料半胱氨酸水平顯著影響瘤胃液游離纈氨酸濃度（P＜0.05），Ⅱ組顯著低于Ⅲ組和Ⅳ組（P＜0.05）；飼料半胱氨酸水平顯著影響瘤胃液游離異亮氨酸、亮氨酸和酪氨酸濃度（P＜0.05），Ⅳ組顯著低于Ⅲ組（P＜0.05）；飼料半胱氨酸水平顯著影響瘤胃液游離苯丙氨酸濃度（P＜0.05），Ⅳ組顯著低于其他各組（P＜0.05）；飼料半胱氨酸水平顯著影響瘤胃液游離天冬氨酸濃度（P＜0.05），Ⅲ組顯著高于其他各組（P＜0.05），Ⅰ組顯著高于Ⅳ組（P＜0.05）；飼料半胱氨酸水平顯著影響瘤胃液游離組氨酸和α-氨基正丁酸濃度（P＜0.05），Ⅰ組顯著高于其他各組（P＜0.05）；各組間瘤胃液游離α-氨基乙二酸、β-丙氨酸、β-氨基異丁酸、γ-氨基正丁酸和磷酸絲氨酸濃度影響未達到顯著水平（P＞0.05）。

表3 飼糧半胱氨酸水平對離乳期梅花鹿瘤胃游離氨基酸及代謝產(chǎn)物的影響（nmoL/mL）

2.3 飼糧半胱氨酸水平對離乳期梅花鹿氨基酸表觀消化率的影響

由表4可知，飼料半胱氨酸水平顯著影響半胱氨酸和脯氨酸表觀消化率（P＜0.05），Ⅳ組顯著高于其他各組（P＜0.05）；飼料半胱氨酸水平顯著影響蛋氨酸表觀消化率（P＜0.05），Ⅲ組顯著低于其他各組（P＜0.05）；飼料半胱氨酸水平顯著影響絲氨酸表觀消化率（P＜0.05），Ⅱ組顯著高于Ⅲ組（P＜0.05）；飼料半胱氨酸水平顯著影響甘氨酸、精氨酸、賴氨酸、天冬氨酸和谷氨酸表觀消化率（P＜0.05），Ⅱ組顯著高于Ⅲ組和Ⅳ組（P＜0.05）；飼料半胱氨酸水平顯著影響異亮氨酸、亮氨酸和丙氨酸表觀消化率（P＜0.05），Ⅰ組和Ⅱ組顯著高于Ⅲ組和Ⅳ組（P＜0.05）；各組之間纈氨酸、組氨酸、酪氨酸、脯氨酸和絲氨酸表觀消化率影響未達到顯著水平（P＞0.05）。

表4 飼糧半胱氨酸水平對離乳期梅花鹿氨基酸表觀消化率的影響（%）

2.4 飼糧半胱氨酸水平對離乳期梅花鹿血清游離氨基酸及代謝物的影響（見表5）

由表5可知，飼料半胱氨酸水平顯著影響血清蛋氨酸、α-氨基乙二酸、鳥氨酸、3-甲基組氨酸和肌肽濃度（P＜0.05），Ⅳ組顯著高于其他各組（P＜0.05）；飼料半胱氨酸水平顯著影響血清絲氨酸濃度（P＜0.05），Ⅳ組顯著低于Ⅲ組（P＜0.05）；飼料半胱氨酸水平顯著影響血清?；撬釢舛龋≒＜0.05），Ⅲ組顯著高于其他各組（P＜0.05）；飼料半胱氨酸水平顯著影響血清賴氨酸、蘇氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸和亮氨酸濃度（P＜0.05），Ⅲ組和Ⅳ組顯著高于Ⅰ組和Ⅱ組（P＜0.05）；飼料半胱氨酸水平顯著影響血清精氨酸、天冬氨酸（P＜0.05），Ⅱ組顯著低于Ⅲ組（P＜0.05）；飼料半胱氨酸水平顯著影響血清氨和羥賴氨酸濃度（P＜0.05），Ⅰ組顯著高于其他各組；各組之間血清半胱氨酸、甘氨酸、組氨酸、酪氨酸、丙氨酸、脯氨酸、磷酸乙醇胺、α-氨基正丁酸、γ-氨基正丁酸、乙醇胺、1-甲基組氨酸、羥脯氨酸和磷酸絲氨酸未產(chǎn)生顯著差異（P＞0.05）。

表5 飼糧半胱氨酸水平對離乳期梅花鹿血清游離氨基酸及代謝產(chǎn)物含量的影響（nmoL/mL）

3 討論

3.1 飼糧半胱氨酸水平對離乳期梅花鹿瘤胃發(fā)酵的影響

氨態(tài)氮、微生物蛋白和揮發(fā)性脂肪酸濃度是研究瘤胃發(fā)酵的重要參數(shù)[3]。氨態(tài)氮濃度能夠反映瘤胃微生物蛋白的合成效率，瘤胃微生物適合的氨態(tài)氮濃度大約為6～30 mg/mL,在合理的范圍內(nèi)微生物蛋白合成效率隨氨態(tài)氮濃度的升高而加快[14-15]。微生物蛋白反映瘤胃微生物對含氮物質(zhì)（氨基酸、蛋白質(zhì)和非蛋白氮等）的有效利用，合成的微生物蛋白能夠隨食糜進入腸道被動物體消化吸收。研究發(fā)現(xiàn)，羔羊瘤胃內(nèi)氨態(tài)氮和菌體蛋白濃度呈現(xiàn)正相關(guān)變化[16]，本試驗結(jié)果與之相同，氨態(tài)氮處于合理的范圍內(nèi)，Ⅱ組氨態(tài)氮以及微生物蛋白濃度分別比Ⅰ組提高24.45%和14.02%，兩指標之間相互驗證。仔鹿瘤胃內(nèi)氨態(tài)氮濃度在合理的范圍內(nèi)提高，對機體的生長發(fā)育是有益的，同時也有利于仔鹿瘤胃發(fā)育和菌群結(jié)構(gòu)的建立[3]。

揮發(fā)性脂肪酸主要包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸等短鏈脂肪酸，主要由碳水化合物（淀粉和纖維素等）發(fā)酵產(chǎn)生，其揮發(fā)性脂肪酸的高低表示瘤胃內(nèi)能量的供應(yīng)方式和代謝速率[17]。本試驗中Ⅱ組異丁酸、戊酸和異戊酸的含量顯著高于Ⅰ組，總揮發(fā)性脂肪酸和乙酸含量顯著高于Ⅲ組和Ⅳ組，可能是過量的半胱氨酸導(dǎo)致采食量降低[18-19]，無法為瘤胃微生物提供同等的發(fā)酵底物，從而導(dǎo)致?lián)]發(fā)性脂肪酸的降低[20-21]。乙酸、丙酸和丁酸占總揮發(fā)性脂肪酸含量的95%以上，是主要的供能物質(zhì)，其供能大小為丙酸＞丁酸＞乙酸[22]。因此，丙酸發(fā)酵能為動物提供更多的能量。Ren Shabat 等[23]研究表明，由乙酸型發(fā)酵向丙酸型發(fā)酵轉(zhuǎn)變，能夠提高能量及飼料的轉(zhuǎn)化率。本試驗結(jié)果中Ⅱ組乙丙比相對于Ⅰ組降低16.52%。可能是適宜的半胱氨酸水平比較有利于仔鹿瘤胃發(fā)酵模式向丙酸型發(fā)酵轉(zhuǎn)變，為仔鹿提供更多的能量。

3.2 飼糧半胱氨酸水平對離乳期梅花鹿瘤胃液游離氨基酸及代謝物的影響

瘤胃液游離氨基酸能夠在一定程度表示蛋白質(zhì)或含氮化合物的分解和利用狀況[24]。李仁德[2]認為在仔鹿中添加外源氨基酸能夠?qū)α鑫赴被岙a(chǎn)生顯著影響。本試驗，外源添加半胱氨酸后導(dǎo)致仔鹿多種游離氨基酸呈現(xiàn)先下降再升高最后下降的趨勢。蛋白質(zhì)在反芻動物瘤胃內(nèi)，首先被瘤胃微生物分解產(chǎn)生多肽，再進一步分解為游離氨基酸。多肽和游離氨基酸均能夠被瘤胃微生物利用，合成微生物蛋白。微生物蛋白、游離氨基酸以及多肽還能隨食糜進入腸道，被動物腸道消化吸收利用。除主要的微生物蛋白外，動物腸道更容易吸收多肽，有利于動物的生長發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)，氨基酸平衡性和瘤胃內(nèi)游離氨基酸呈現(xiàn)負相關(guān)關(guān)系[24]，本試驗中與Ⅰ組相比，Ⅱ組瘤胃液游離氨基酸整體水平降低。第一，可能是在蛋白質(zhì)降解過程中，主要以多肽的形式存在，減少游離氨基酸的產(chǎn)生。研究表明，瘤胃微生物蛋白的氨基酸組成穩(wěn)定，且與多肽氨基酸組成類似，多肽可直接合成微生物蛋白，并且肽還能縮短細胞分裂周期，加速細菌的繁殖速度，促進瘤胃微生物達到最大生長效率[14]；第二，可能是產(chǎn)生的游離氨基酸被加速利用，合成微生物蛋白。研究表明，半胱氨酸可以增加大鼠腸道內(nèi)乳酸菌和雙歧桿菌水平，降低大腸桿菌水平[11]，增加仔豬腸道菌群中的細菌數(shù)量[12]。間接表明半胱氨酸可能對瘤胃內(nèi)復(fù)雜菌群同樣具有作用，且通過消耗游離的氨基酸促進瘤胃內(nèi)有益菌的繁殖，需要我們進一步對瘤胃菌群進行研究；第三，可能是半胱氨酸脫羧后合成半胱胺，通過內(nèi)分泌腺和消化腺的分泌，直接或間接作用于微生物從而促進瘤胃的代謝[25]。總之，無論以上何種途徑發(fā)揮作用均有利于飼糧中蛋白質(zhì)和氨基酸的利用。半胱氨酸是否影響瘤胃內(nèi)復(fù)雜微生物的組成，以及通過影響哪些微生物發(fā)揮作用，需要進一步研究。

3.3 飼糧半胱氨酸水平對離乳期梅花鹿氨基酸表觀消化率的影響

氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位，氨基酸表觀消化率在一定程度上能反映出飼糧蛋白質(zhì)的利用以及氨基酸的平衡狀況。氨基酸平衡時能達到最大的利用效率，黃健等[26]研究表明梅花鹿仔鹿飼糧中加入含硫氨基酸能夠提高蛋氨酸的表觀消化率，本試驗中，加入含硫氨基酸，能夠顯著提高半胱氨酸的表觀消化率?？赡苁蔷w氨基酸減少蛋白質(zhì)降解過程，有利于瘤胃微生物和腸道的利用。本試驗中Ⅲ組蛋氨酸表觀消化率低于對照組，可能是補充半胱氨酸替代部分蛋氨酸。除含硫氨基酸外，其余氨基酸表觀消化率多呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，可能是半胱氨酸能夠通過谷胱甘肽促進腸道上皮細胞的完整性[27]；或改善空腸黏膜緊密連接蛋白的表達，促進黏膜的屏障功能，影響腸道黏膜對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收[28]。前人發(fā)現(xiàn)，2月齡梅花鹿仔鹿添加半胱胺能夠促進粗蛋白的表觀消化率[29]，也可能是適量半胱氨酸脫羧后通過半胱胺促進消化酶的分泌，提高氨基酸表觀消化率[30]。

3.4 飼糧半胱氨酸水平對離乳期梅花鹿血清游離氨基酸及代謝產(chǎn)物的影響

血清游離氨基酸及代謝產(chǎn)物能夠反映蛋白質(zhì)和氨基酸的吸收代謝狀況，與動物的生長性能和健康狀況密切相關(guān)[31]。研究發(fā)現(xiàn)，仔豬血清蛋氨酸和半胱氨酸水平會隨著飼糧含硫氨基酸的增加而上升[32]。本試驗結(jié)果與之不同，飼糧添加半胱氨酸后血清半胱氨酸水平各組間差異不顯著，可能是飼糧半胱氨酸水平過高，導(dǎo)致采食量的降低，進而影響半胱氨酸總攝入量。本試驗中血清蛋氨酸水平升高的主要原因，可能是添加半胱氨酸后，半胱氨酸會導(dǎo)致組織中胱硫醚β-合成酶活力降低，降低了蛋氨酸代謝[33]。谷胱甘肽和牛磺酸是半胱氨酸代謝產(chǎn)物[7]。研究表明，半胱氨酸水平達到一定水平向其產(chǎn)物生成[34]。谷胱甘肽由甘氨酸、谷氨酸和半胱氨酸合成。?；撬釋τg動物的生長發(fā)育至關(guān)重要[35]，Ⅲ組?；撬崴斤@著高于Ⅰ組，可能是半胱氨酸主要向牛磺酸方向代謝，但需要我們進一步研究。研究表明，仔豬中外源含硫氨基酸導(dǎo)致各必需氨基酸變化趨勢不同[32]。而本試驗中除血清蛋氨酸和精氨酸外的其他必需氨基酸大多呈先降低后升高趨勢，可能是Ⅱ組飼糧半胱氨酸水平最為適宜，有利于機體各部位對必需氨基酸的利用，降低血清氨基酸濃度。支鏈氨基酸（纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸）與腸道細胞的快增殖密切相關(guān)，高水平半胱氨酸可能會致使腸道受損，阻礙對支鏈氨基酸的消耗，進一步導(dǎo)致支鏈氨基酸含量升高[32，36]。氨基酸代謝極其復(fù)雜，各氨基酸之間彼此聯(lián)系又相互獨立，仍需要深入探究。

4 結(jié)論

本試驗條件下，飼糧半胱氨酸水平為4.8 g/kg時，能夠提高瘤胃異丁酸、異戊酸和戊酸氨基酸的濃度，降低瘤胃液和血清游離氨基酸濃度。