張學(xué)長(zhǎng)，湯杰云，王鵬程

(黃淮學(xué)院直屬附屬駐馬店市中心醫(yī)院麻醉科，河南 駐馬店 463000)

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(POCD)是指手術(shù)麻醉后出現(xiàn)的認(rèn)知、學(xué)習(xí)、記憶及精神運(yùn)動(dòng)等方面障礙。目前研究認(rèn)為，POCD發(fā)病機(jī)制與神經(jīng)炎癥、氧化應(yīng)激及神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)[1-2]。因此，抑制神經(jīng)炎癥已成為POCD研究的重點(diǎn)機(jī)制。盤狀結(jié)構(gòu)域受體1(DDR1)是與炎性反應(yīng)相關(guān)，且參與了腦損傷誘發(fā)的神經(jīng)功能障礙[3-4]。因此，以DDR1為研究靶標(biāo)可能是POCD神經(jīng)炎性反應(yīng)的新機(jī)制。七氟烷(Sevo)是臨床上常用的吸入性麻醉劑，已被證實(shí)能夠引起海馬神經(jīng)炎性反應(yīng)和神經(jīng)元凋亡誘發(fā)POCD的發(fā)生[5]。為此，本研究擬通過(guò)七氟烷吸入麻醉構(gòu)建POCD大鼠模型，探究DDR1在海馬神經(jīng)元炎性反應(yīng)中的作用，以期為POCD的機(jī)制研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠，月齡20～22個(gè)月，體重500～600 g，購(gòu)自湖南斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司[SCXK(湘)2019-0006]。

1.1.2主要試劑 七氟烷(江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司)，DDR1抑制劑(DDR1-IN-5，美國(guó)MedchemExpress公司，貨號(hào)：HY-133669)，白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定試劑盒(北京中杉金橋公司，貨號(hào)：TA504958、TA500065、TA500062)，蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)，貨號(hào)：C0105S),免疫組織化學(xué)(免疫組化)檢測(cè)試劑盒(北京中杉金橋公司，貨號(hào)：SP-9001)，DDR1單克隆抗體(Cell Signaling Technology公司，貨號(hào)：#5583)，β-actin單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗大鼠、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(碧云天生物技術(shù)，貨號(hào)：AF5001、A0192、A0208)。

1.1.3主要儀器 多功能酶標(biāo)儀(長(zhǎng)春樂鏷科技有限公司，型號(hào)：LP-5117)，熒光倒置顯微鏡(日本奧林巴斯Olympus，型號(hào)：CKX53)，高速冷凍離心機(jī)(湖南可成儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)：H3-18KR)，凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad伯樂公司，型號(hào)：Gel Doc XR+)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物造模與分組 將實(shí)驗(yàn)SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、DDR1抑制劑組、七氟烷麻醉組、DDR1 抑制處理組，每組各10只。對(duì)照組大鼠常規(guī)培養(yǎng)，定量吸入空氣；DDR1抑制劑組大鼠以DDR1抑制劑5 μg側(cè)腦室注射，30 min后定量吸入空氣；七氟烷麻醉組大鼠經(jīng)持續(xù)性吸入3%七氟烷6 h構(gòu)建認(rèn)知功能障礙模型；DDR1抑制劑處理組大鼠以DDR1抑制劑5 μg側(cè)腦室注射，30 min后吸入3%七氟烷6 h。

1.2.2Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)[1]七氟烷麻醉術(shù)后1 d，行Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，將水迷宮劃分為4個(gè)象限，并隨機(jī)選取一個(gè)象限放置隱蔽平臺(tái)，將大鼠從4個(gè)象限隨機(jī)放入水中，記錄大鼠尋找到平臺(tái)的時(shí)間，即為逃避潛伏期。大鼠經(jīng)過(guò)5 d平臺(tái)尋找訓(xùn)練：4個(gè)象限入水點(diǎn)，每天訓(xùn)練1次，每次間隔20 min，第5天記錄各組大鼠逃避潛伏期時(shí)間。空間探索實(shí)驗(yàn)：第6 天撤去隱蔽平臺(tái)，將大鼠從4個(gè)象限中任一象限隨機(jī)入水，記錄大鼠60 s內(nèi)穿越平臺(tái)的次數(shù)及目標(biāo)象限停留時(shí)間的占比。

1.2.3ELISA檢測(cè)海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平 海馬組織碾磨后經(jīng)細(xì)胞裂解液裂解，于4 ℃下12 000 r/min(離心半徑=6 cm)離心10 min，取上清液，蛋白定量后采用ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平。

1.2.4HE染色觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)變化 麻醉后將大鼠頸椎脫臼處死，摘取腦片(視交叉至漏斗柄)，組織固定、石蠟包埋、切片，行HE染色，并于200倍鏡下觀察海馬CA1區(qū)域形態(tài)變化。半定量評(píng)估海馬CA1區(qū)域神經(jīng)元損傷。1級(jí)：海馬CA1區(qū)域分散零散損傷神經(jīng)元(<20%)；2級(jí)：海馬CA1區(qū)域存在少量損傷神經(jīng)元(20%～40%)；3級(jí)：海馬CA1區(qū)域有中等數(shù)量損傷神經(jīng)元(>40%～60%)；4級(jí)：海馬CA1區(qū)域有大量損傷神經(jīng)元(>60%～80%)；5級(jí)：海馬CA1區(qū)域神經(jīng)元存在廣泛性損傷(>80%～100%)。

1.2.5免疫組化檢測(cè)海馬組織DDR1表達(dá) 海馬組織切片經(jīng)內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑阻斷、抗原修復(fù)、組織封閉后，滴加DDR1單克隆抗體(1∶500)，孵育過(guò)夜，對(duì)應(yīng)二抗孵育2 h，滴加DAB顯色液，于400倍顯微鏡下觀察DDR1相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6Western blotting檢測(cè)海馬組織DDR1蛋白表達(dá) 按照每孔30 μg上樣，經(jīng)過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，DDR1蛋白經(jīng)濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上，孵育DDR1單克隆抗體，4 ℃過(guò)夜，對(duì)應(yīng)二抗孵育2 h。PVDF洗膜，滴加顯影液顯影，并予Gel Doc XR+系統(tǒng)拍照，最后進(jìn)行定量檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠認(rèn)知功能障礙情況比較 與對(duì)照組比較，七氟烷麻醉組大鼠逃避潛伏期時(shí)間延長(zhǎng)，目標(biāo)象限停留時(shí)間占比降低，穿越平臺(tái)次數(shù)減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.89、8.21、6.46，P<0.001、<0.001、<0.001)。與七氟烷麻醉組比較，DDR1抑制劑處理組大鼠逃避潛伏期時(shí)間降低，目標(biāo)象限停留時(shí)間占比升高，穿越平臺(tái)次數(shù)增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.77、5.61、3.67，P<0.001、<0.001、=0.002)。見表1。

表1 各組大鼠認(rèn)知功能障礙情況比較

2.2各組大鼠海馬組織炎癥因子水平比較 與對(duì)照組比較，七氟烷麻醉組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=20.67、13.73、35.15，P<0.001、<0.001、<0.001)。與七氟烷麻醉組比較，DDR1抑制劑處理組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=10.84、7.22、16.38，P<0.001、<0.001、<0.001)。見表2。

表2 各組大鼠海馬組織炎癥因子水平比較

2.3各組大鼠海馬CA1區(qū)域神經(jīng)元損傷情況比較 對(duì)照組和DDR1抑制劑組大鼠海馬CA1區(qū)域神經(jīng)元排列整齊，結(jié)構(gòu)完整。七氟烷麻醉組大鼠海馬CA1區(qū)域神經(jīng)元排列紊亂，部分神經(jīng)元細(xì)胞核固縮，嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目明顯增多，海馬神經(jīng)元損傷評(píng)分較對(duì)照組增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.91，P<0.001)。與七氟烷麻醉組比較，DDR1抑制劑處理組大鼠海馬CA1區(qū)域神經(jīng)元損傷減輕，評(píng)分降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.92，P<0.001)，大部分神經(jīng)元結(jié)構(gòu)正常，酸性粒細(xì)胞數(shù)目明顯減少。見圖1、表3。

表3 各組大鼠海馬CA1區(qū)域神經(jīng)元損傷評(píng)分比較

注：A.對(duì)照組；B.DDR1抑制劑組；C.七氟烷麻醉組；D.DDR1抑制劑處理組。圖1 各組大鼠海馬CA1區(qū)域形態(tài)學(xué)變化(HE染色，200×)

2.4各組大鼠海馬組織DDR1蛋白相對(duì)表達(dá)比較 免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，七氟烷麻醉組大鼠海馬組織DDR1表達(dá)明顯增加；與七氟烷麻醉組比較，DDR1抑制劑處理組大鼠海馬組織DDR1表達(dá)明顯降低。Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，七氟烷麻醉組大鼠海馬組織DDR1蛋白表達(dá)水平明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=24.86，P<0.001)。與七氟烷麻醉組相比，DDR1抑制劑處理組大鼠海馬組織DDR1蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.04，P<0.001)。見圖2、表4。

注：A.免疫組化檢測(cè)DDR1蛋白表達(dá)(HE染色，400×)；B.Western blotting檢測(cè)DDR1表達(dá)。圖2 各組大鼠海馬組織DDR1蛋白表達(dá)

表4 各組大鼠海馬組織DDR1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

3 討 論

七氟烷是臨床全身麻醉的首選藥物，其具有誘導(dǎo)迅速、蘇醒快、對(duì)呼吸及循環(huán)抑制輕等優(yōu)勢(shì)[6]。眾多研究均已證實(shí)七氟烷吸入性麻醉能夠誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元損傷及老年認(rèn)知功能障礙，但是有關(guān)其機(jī)制尚不完全清楚。

本研究首先通過(guò)老年大鼠七氟烷吸入性麻醉構(gòu)建POCD模型，結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，七氟烷吸入麻醉組大鼠出現(xiàn)典型的認(rèn)知功能障礙，主要表現(xiàn)為逃避潛伏期時(shí)間延長(zhǎng)，目標(biāo)象限停留時(shí)間占比降低和穿越平臺(tái)次數(shù)減少。海馬CA1區(qū)域神經(jīng)元損傷評(píng)分增加表明模型構(gòu)建成功。既往研究已證實(shí)，七氟烷能夠誘導(dǎo)大鼠認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制與海馬神經(jīng)元炎性細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)釋放增加，從而導(dǎo)致海馬神經(jīng)元凋亡增加相關(guān)[7-8]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，七氟烷麻醉組大鼠海馬組織IL-1β、IL-6、TNF-α水平顯著升高，與黃運(yùn)伯等[1]研究結(jié)果一致。本研究與以往文獻(xiàn)報(bào)道共同表明，七氟烷誘導(dǎo)POCD與促進(jìn)海馬神經(jīng)炎癥，誘發(fā)細(xì)胞凋亡相關(guān)。因此，在七氟烷誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙中對(duì)海馬神經(jīng)元炎性反應(yīng)的機(jī)制進(jìn)行研究具有重要意義。DDR1是受體酪氨酸蛋白激酶家族成員之一，廣泛參與細(xì)胞增殖、凋亡、纖維化及炎癥等病理生理過(guò)程[9-10]。有研究發(fā)現(xiàn)，DDR1表達(dá)在大鼠局灶性缺血后升高，抑制DDR1能夠顯著減少大鼠腦缺血損傷發(fā)生[11]。另外，在氧剝奪損傷的神經(jīng)元細(xì)胞中DDR1蛋白表達(dá)顯著增加，抑制DDR1表達(dá)能夠促進(jìn)皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞存活，改善缺氧、缺糖誘導(dǎo)的大鼠皮質(zhì)神經(jīng)細(xì)胞損傷[12-13]。上述研究表明，DDR1在多種誘因下的神經(jīng)損傷中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，七氟烷麻醉組大鼠海馬組織DDR1蛋白表達(dá)明顯增加，提示DDR1在海馬神經(jīng)元損傷中扮演損傷因子角色。為明確DDR1在七氟烷誘導(dǎo)海馬神經(jīng)損傷中的作用，本研究通過(guò)大鼠側(cè)腦室注射DDR1抑制劑觀察七氟烷對(duì)老年大鼠海馬神經(jīng)元損傷的影響，結(jié)果顯示，與七氟烷麻醉組比較，DDR1抑制劑處理組能夠改善老年大鼠認(rèn)知功能障礙，其機(jī)制與降低DDR1蛋白表達(dá)，抑制IL-1β、IL-6、TNF-α釋放，減輕海馬CA1區(qū)域神經(jīng)元損傷有關(guān)。

綜上所述，七氟烷麻醉誘導(dǎo)的老年大鼠認(rèn)知功能障礙與海馬組織DDR1蛋白表達(dá)增加，促進(jìn)海馬神經(jīng)元炎性反應(yīng)相關(guān)。