袁燕平，肖漢偉，汪亮亮△

(1.九江學(xué)院附屬醫(yī)院病理科，江西 九江 332000；2.九江市濂溪區(qū)人民醫(yī)院病理科，江西 九江 332000)

在日常病理工作中，快速冷凍切片技術(shù)是眾多病理學(xué)方法中極其重要而又特殊的一種方法，其是輔助臨床外科醫(yī)生進(jìn)行手術(shù)操作的重要手段。在實(shí)際工作中，對(duì)于快速冷凍切片的質(zhì)量要求是非常嚴(yán)格的，既要求短時(shí)間完成病理制片和診斷，又要求確保最終診斷結(jié)論的準(zhǔn)確性[1-2]。在整個(gè)快速病理診斷工作過程中，影響最后診斷結(jié)果的因素很多，包括取材位置、切片質(zhì)量、染色和診斷醫(yī)生的水平等，而制片過程中使用的組織冷凍包埋劑也是非常重要的影響因素之一[3-5]。冷凍切片包埋劑也稱最佳切削溫度(OCT)包埋膠，是一種聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，廣泛用于病理冷凍切片工作中，其用途是在冰凍切片時(shí)支撐組織，以增加組織的連續(xù)性，常溫時(shí)候呈液態(tài)，-20 ℃時(shí)則為固態(tài)，其能夠在低溫條件下包裹組織，以便進(jìn)行連續(xù)的組織切片，減少皺折及碎裂。因?yàn)镺CT包埋膠混合物為水溶性物質(zhì)，故在組織沖水時(shí)可溶于水，所以在以后的染色過程中不會(huì)增加背景染色。OCT包埋膠具有支持性好、凝固快、不易形成結(jié)晶等優(yōu)點(diǎn)，但是其價(jià)格偏高，工作中如大量使用會(huì)導(dǎo)致成本顯著提高，因此，有眾多病理工作者嘗試用普通膠水代替進(jìn)口OCT包埋膠，最終也獲得了非常理想的結(jié)果，這些普通膠水在使用時(shí)也能制作出染色合格、對(duì)比良好的蘇木精-伊紅(HE)染色切片[6-9]。多年來，九江學(xué)院附屬醫(yī)院病理科在冷凍切片工作中已使用過多款國產(chǎn)普通膠水，觀察到不同膠水之間的性能表現(xiàn)差異巨大。為了找出一種最接近OCT包埋膠性能的膠水，本研究選取了多款市面常見的膠水，橫向?qū)Ρ攘似湓诶鋬銮衅械氖褂眯Ч?，最終找到了其中性能最優(yōu)、最接近專用OCT包埋膠的替代品，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1標(biāo)本來源 九江學(xué)院附屬醫(yī)院手術(shù)室送檢的新鮮外科手術(shù)標(biāo)本30例，包括胃黏膜、甲狀腺、子宮肌瘤、皮膚、卵巢等5種標(biāo)本，各6例。

1.2材料及設(shè)備 進(jìn)口LeicaCM3050S冷凍切片機(jī)，Leica公司生產(chǎn)的OCT包埋膠，北京雪奧文化用品制造有限責(zé)任公司生產(chǎn)的雪奧牌膠水，得力集團(tuán)有限公司生產(chǎn)的得力牌膠水，汕頭市源盛文化用品實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)的博寶牌膠水，南昌天鵝文教用品廠生產(chǎn)的天鵝飛騰合成膠水；酒精、二甲苯和染色試劑等。

1.3方法 (1)切片機(jī)預(yù)冷：先將冷凍切片機(jī)預(yù)冷降至-20 ℃，在實(shí)際切片過程中根據(jù)不同組織的需求調(diào)節(jié)樣本夾頭的溫度。(2)取材：將進(jìn)口OCT包埋膠、各種普通膠水分別滴加到組織樣品托上，將每例新鮮標(biāo)本切取大小相似組織5塊，組織厚度約3 mm。將組織分別放置于滴有包埋膠的樣品托上，再次滴加包埋劑將組織全部覆蓋。(3)冷凍：將樣品托立即放入冷凍切片機(jī)內(nèi)的樣本卡槽內(nèi)，再根據(jù)組織類型調(diào)節(jié)切片機(jī)溫度至所需溫度。(4)切片：當(dāng)包埋劑與組織均凍結(jié)成白色或者透明體后，開始切片，所有組織切片厚度均設(shè)定為5 μm，切好后立即將組織直接貼附在干凈載玻片上，隨后切片放入甲醇固定液中固定1 min。(5)染色：切片經(jīng)過自來水沖洗30 s后，所有切片按照相同的實(shí)驗(yàn)流程，進(jìn)行HE染色。(6)每例冰凍標(biāo)本染色結(jié)束后，接著進(jìn)行組織脫水透明浸蠟，制作石蠟標(biāo)本并進(jìn)行常規(guī)HE染色。(7)將冷凍切片與石蠟切片進(jìn)行對(duì)照，觀察切片質(zhì)量，包括組織結(jié)構(gòu)完整性、細(xì)胞收縮和變形程度，同時(shí)要對(duì)冷凍切片和相對(duì)應(yīng)的石蠟切片結(jié)果之間進(jìn)行比較，染色完成的切片交給2名診斷醫(yī)生進(jìn)行鏡下觀察，給出診斷，并且給每張切片進(jìn)行評(píng)分。

1.4染色結(jié)果評(píng)判 (1)不同膠水切片間比較：由2名病理診斷醫(yī)生采用雙盲法進(jìn)行打分，對(duì)5種不同包埋膠制作的冷凍切片HE染色質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估。切片HE染色質(zhì)量的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照《臨床技術(shù)操作規(guī)范：病理學(xué)分冊(cè)》中關(guān)于HE染色切片質(zhì)量基本標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分，總分為100分，共分四級(jí)，≥90分評(píng)為甲級(jí)，75～<90分評(píng)為乙級(jí)，60～<75分評(píng)為丙級(jí)，<60分評(píng)為丁級(jí)。診斷醫(yī)生首先評(píng)判染色質(zhì)量是否符合診斷要求，如果不符則直接評(píng)為0分，不再進(jìn)行后續(xù)評(píng)分，只有染色質(zhì)量符合診斷要求時(shí)，才根據(jù)細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)染色強(qiáng)度、核漿對(duì)比度，以及與石蠟切片染色情況比較，再對(duì)切片進(jìn)行判讀評(píng)分，每種標(biāo)本得分取平均值，保留小數(shù)點(diǎn)后兩位。(2)各組冷凍切片與對(duì)應(yīng)石蠟切片間比較：診斷醫(yī)生對(duì)各組切片進(jìn)行診斷后統(tǒng)計(jì)結(jié)論，分析各組標(biāo)本的冰凍常規(guī)診斷符合率。

2 結(jié) 果

2.1不同膠水間表現(xiàn)及各組冷凍切片質(zhì)量評(píng)分比較 本實(shí)驗(yàn)中5種不同膠水之間的冷凍切片質(zhì)量評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.141,P<0.001)；其中OCT包埋膠和雪奧膠水之間的冷凍切片質(zhì)量評(píng)分基本相同，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P= 0.452)；而OCT包埋膠或雪奧膠水與其他3個(gè)品牌膠水之間比較，其冷凍切片質(zhì)量評(píng)分均相對(duì)優(yōu)異，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，得力、飛騰、博寶膠水三者之間的冷凍切片質(zhì)量評(píng)分相同，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。不同膠水間在制作冷凍切片中的使用效果見圖1。OCT包埋膠和雪奧膠水制作冷凍切片病理圖見圖2。不同膠水制作胃黏膜冷凍切片檢查中的使用效果及病理圖見圖3。

表1 5種不同膠水在不同組織中的制片質(zhì)量評(píng)分分)

2.2各組診斷結(jié)果 在5組標(biāo)本之間，冷凍切片的診斷結(jié)論和對(duì)應(yīng)的石蠟切片之間的診斷結(jié)論均一致，符合率達(dá)到100.0%。

注：A、B示5種不同膠水在冷凍切片中的使用，1為OCT包埋膠，2為雪奧，3為博寶，4為得力，5為飛騰；C示專用的OCT包埋膠和普通膠水在低溫冷凍后的外形，可以看到普通膠水呈現(xiàn)透明樣外觀，而OCT包埋膠呈現(xiàn)乳白色的外觀，二者不同；D示普通膠水由于本身比較稀薄，滴加后出現(xiàn)流淌現(xiàn)象，其對(duì)組織的包裹覆蓋性略差。圖1 不同膠水在制作冷凍切片中的使用效果

注：A1、A2為OCT包埋膠，A2為放大后效果；B1、B2為雪奧膠水，B2為放大后效果；2種膠水在甲狀腺組織的冷凍切片中的表現(xiàn)幾乎一致，組織細(xì)胞著色鮮明，胞核胞漿分界清楚。圖2 OCT包埋膠和雪奧膠水制作冷凍切片的病理圖(HE染色，A1、B1：4×，A2、B2：20×)

注：A中示1為OCT包埋膠，2為雪奧，3為博寶，4為得力，5為飛騰；肉眼觀察各組膠水表現(xiàn)差異不大，OCT包埋膠(B)相對(duì)比較黏稠一些；而顯微鏡下結(jié)果顯示OCT包埋膠(B)和雪奧膠水(C)2種膠水的表現(xiàn)總體較好，切片的細(xì)胞染色鮮艷，紅藍(lán)色對(duì)比度好，而其余3種膠水(D為博寶，E為得力，F(xiàn)為飛騰)表現(xiàn)相對(duì)較差，細(xì)胞核著色不均勻，部分細(xì)胞核發(fā)灰發(fā)空。圖3 不同膠水在制作胃黏膜冷凍切片檢查中的使用效果及病理圖(B～F：HE染色，20×)

3 討 論

對(duì)于臨床病理工作而言，術(shù)中快速冷凍切片與診斷技術(shù)已成為一項(xiàng)不可或缺的技術(shù)手段，其是借助冷凍切片機(jī)的低溫來迅速冷凍組織，接著再對(duì)冷凍組織進(jìn)行切片、固定、染色及封片等一系列操作，最后由診斷醫(yī)生借助顯微鏡對(duì)切片良惡性進(jìn)行診斷的一種方法[2-3,10]。一般來說，術(shù)中冷凍切片診斷必須在較短的時(shí)間內(nèi)(一般為30 min)對(duì)送檢組織的良惡性、腫瘤的邊緣組織是否存在浸潤或淋巴結(jié)內(nèi)是否存在癌轉(zhuǎn)移等情況進(jìn)行快速而又準(zhǔn)確的判斷，從而幫助外科醫(yī)生確定手術(shù)的范圍及方式[11]。快速冷凍切片技術(shù)省略了組織的前處理過程，直接在低溫條件下進(jìn)行切片，而想要實(shí)現(xiàn)低溫條件下切片依靠的就是組織冷凍包埋劑，即OCT包埋膠。以往使用的OCT包埋膠均為進(jìn)口產(chǎn)品，價(jià)格昂貴，近年來也有國產(chǎn)OCT包埋膠出現(xiàn)，其性能已經(jīng)接近進(jìn)口產(chǎn)品，但是價(jià)格依然在每150毫升200～300元，總體上看使用成本比較高。一直以來，許多病理工作者都在嘗試尋找一種便宜而又實(shí)用的OCT包埋膠替代品，許多實(shí)驗(yàn)證實(shí)普通的文具膠水就具有和OCT包埋膠相類似的作用，兩者都是無色透明液體，冷凍后都有著與組織塊相近的韌度，能起到良好的支撐、填塞和凝固作用。市面上文具膠水的主要成分多為聚乙烯醇、白乳膠、硬脂酸鈉、滑石粉、乙二醇、蔗糖等，這些物質(zhì)的水溶性均較好[12]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，普通膠水制作的切片，沒有出現(xiàn)脫片，而且染色效果穩(wěn)定，透亮度好，玻片上也無膠水殘留，最終的切片質(zhì)量完全合格，與進(jìn)口OCT包埋膠相比毫不遜色。不同標(biāo)本先進(jìn)行冷凍切片后再進(jìn)行石蠟切片，兩者的診斷均符合，一致性較好，表明這5種不同膠水制作的切片其實(shí)均能滿足快速病理診斷的要求，唯一不同的是不同膠水制作的冷凍切片之間存在著質(zhì)量的差別，盡管這些差別是微小的，但是對(duì)于診斷醫(yī)生，更優(yōu)良的切片意味著診斷時(shí)更準(zhǔn)確和更快速地診斷[13]。

快速冷凍切片時(shí)，當(dāng)切片機(jī)冷凍室、組織樣本、包埋劑和刀片之間的溫度達(dá)到平衡時(shí)，此時(shí)即可獲得高質(zhì)量的冷凍切片。由于不同組織的構(gòu)成成分不同，脂質(zhì)構(gòu)成比存在差異，導(dǎo)致各個(gè)樣本的OCT包埋膠實(shí)際上各不相同，正常工作中需要不斷調(diào)整切片溫度。OCT包埋膠是由高分子聚合物構(gòu)成的黏稠無色透明液體，其冷凍速度和軟硬度與絕大部分組織細(xì)胞相近，冷凍組織在接觸冷凍切片機(jī)刀刃的一瞬間，局部溫度快速升高并且發(fā)生局部融化，緊接著切開的組織薄片暴露于冷凍機(jī)室中而又被再次冷凍，這一過程不斷重復(fù)，周而復(fù)始就實(shí)現(xiàn)了冷凍情況下的連續(xù)切片[4]。一般來說，普通膠水中通常含有較多水分，這會(huì)造成冷凍組織過程中形成大量的細(xì)小晶體，這些晶體會(huì)擠壓組織，甚至?xí)?dǎo)致細(xì)胞發(fā)生破裂，最終會(huì)影響到組織HE染色的形態(tài)結(jié)構(gòu)，讓原本該有的組織細(xì)胞發(fā)生變異，給診斷醫(yī)生造成相當(dāng)程度的診斷障礙，進(jìn)而導(dǎo)致診斷出現(xiàn)差錯(cuò)[14-16]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，普通膠水多為透明樣液體，外觀呈水樣，滴加到組織上后很快就流淌開來，無法完全包裹住組織塊，導(dǎo)致切片時(shí)非常容易出現(xiàn)卷曲現(xiàn)象，其可能的原因是組織自身的張力過大，而組織周圍又缺乏膠水的牽拉，最終導(dǎo)致卷曲。而雪奧牌膠水則表現(xiàn)良好，其性狀黏稠，含水量較少，滴加到組織周圍后能完全包裹住組織。其冷凍變硬的速度和OCT包埋膠幾乎相當(dāng)，在切片時(shí)也不會(huì)出現(xiàn)卷曲現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)已經(jīng)初步證明了雪奧牌膠水在冷凍速度和冷凍切片質(zhì)量上均優(yōu)于其他普通膠水，達(dá)到或者接近進(jìn)口OCT包埋膠性能，下一步將繼續(xù)研究普通膠水和OCT包埋膠包埋后的組織內(nèi)蛋白質(zhì)及核酸的保存情況，進(jìn)一步明確普通膠水在病理工作中的應(yīng)用價(jià)值。