劉潔茹，馮 露，林啟芳，周 楊，池秀鳳，蔡 明，程堂仁，王 佳，張啟翔，潘會堂

(北京林業(yè)大學 園林學院，花卉種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種北京市重點實驗室，國家花卉工程技術研究中心，城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實驗室，北京 100083)

紫薇(Lagerstroemiaindica)抗逆性強，夏季開花，花期長、花量大，廣泛應用于園林綠化建設中。人們通過傳統(tǒng)的育種方法培育出一系列紫薇品種，使其花色、株型更加豐富[1-5]。近年來，人們致力于紫薇的分子育種探索，從紫微中克隆出一批基因，包括細胞分裂相關的CYCDs基因[6]、調(diào)控赤霉素通路的相關基因[7]、影響枝條發(fā)育的LfiDAD2基因[8]、生長素相關的基因[9]等，并利用病毒誘導的基因沉默技術(virus-induced gene silencing，VIGS)和模式植物過表達對這些基因進行了驗證，但這些研究并不能充分證明基因在紫薇中的功能，基因組功能分析仍然是紫薇分子生物學研究的一大難題。穩(wěn)定的遺傳轉化體系是解決這一問題的根本途徑，但紫薇遺傳轉化體系的建立比較困難，目前尚未獲得轉基因植株，故基因組功能研究工作受到很大影響。

原生質(zhì)體是去除細胞壁后由質(zhì)膜包圍的具有生活力的植物細胞，其制備相對容易，具有活細胞的一切特征。由于沒有細胞壁，原生質(zhì)體可以攝入細胞核、細胞器基因組或外源 DNA 片段等遺傳物質(zhì)，是非常好的基因轉化系統(tǒng)，已在蛋白質(zhì)互作[10]、基因亞細胞定位[11]、細胞融合[12-13]、基因功能分析[14]、基因組編輯[15]等方面進行了應用。目前已成功分離出原生質(zhì)體的植物有近400種，分布于40余科160余屬，主要為茄科、豆科、禾本科、菊科和薔薇科植物[16]。有學者利用鷹嘴豆(Cicerarietinum)幼嫩葉片分離出原生質(zhì)體，用聚乙二醇(PEG)介導的方法將外源DNA導入其中，成功地進行了鷹嘴豆基因的亞細胞定位[17]。王義強等[18]采用銀杏(Ginkgobiloba)成熟胚離體培養(yǎng)得到無菌苗和愈傷組織，制備出原生質(zhì)體，并誘導其融合，融合率達到67%。姜倩倩[19]建立了多年生黑麥草(Loliumperenne)原生質(zhì)體高效制備及瞬時表達體系，并利用該體系對CRISPR/Cas9編輯載體活性進行了檢測。高思丹[20]分離得到了枸杞(Lyciumchinense)的原生質(zhì)體，對其進行再生細胞壁培養(yǎng)，獲得愈傷組織并得到完整的再生植株。由以上研究可知，原生質(zhì)體途徑是驗證基因在本源植物中功能的一種有效手段。

高效的原生質(zhì)體分離是進行遺傳轉化、細胞融合等研究的重要前提，對紫薇分子生物學研究具有重要意義。目前關于紫薇原生質(zhì)體制備和瞬時轉化的研究尚未見報道。為此，本研究分離了紫薇幼嫩葉片的原生質(zhì)體，并進行瞬時轉化，以期為紫薇基因功能分析提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

以屋久島紫薇(L.fauriei)為母本、紫薇品種‘Pocomoke’為父本雜交獲得的F1株系S047[6]、紫薇品種‘Ebony Embers’和‘Pocomoke’，均由本課題組收集，在北京林業(yè)大學林業(yè)科技股份有限公司溫室內(nèi)培養(yǎng)，定期澆水、施肥和修剪，促其萌發(fā)新枝。采集修剪后萌發(fā)出的幼嫩枝條上的葉片作為原生質(zhì)體分離的材料。

纖維素酶R-10(10 U/mg，貨號為S10043-25g)、離析酶R-10(3 000 U/g，貨號為S10082-10g)、果膠酶(500 U/mg，貨號為S10007-25g)，均購于上海源葉生物科技有限公司。D-甘露醇(純度≥99%)，購于北京百瑞極生物科技有限公司，貨號為BN20023-500g。

1.2 品種選擇

參考已發(fā)表的其他物種的原生質(zhì)體制備方法，設計3組酶解液，第1組為：10 g/L纖維素酶，3 g/L離析酶，0.5 mol/L甘露醇；第2組為：15 g/L纖維素酶，4 g/L離析酶，0.8 mol/L甘露醇；第3組為：20 g/L纖維素酶，20 g/L離析酶，0.4 mol/L甘露醇。用3組酶解液分別酶解株系S047、紫薇品種‘Ebony Embers’和‘Pocomoke’ 2，4，6，8 h，分析酶解效果，選擇適合的分離材料。

為進一步確定最適品種，在上述試驗的基礎上，對未分離出原生質(zhì)體的紫薇品種將酶解液中纖維素酶和離析酶質(zhì)量濃度分別提高為25，50，75 g/L，甘露醇濃度為0.6 mol/L，進行3，5，7 h酶解，分析酶解效果。

1.3 原生質(zhì)體分離條件的確定

根據(jù)1.2節(jié)中選定品種原生質(zhì)體的初步分離情況，確定酶解液中纖維素酶、離析酶質(zhì)量濃度及甘露醇濃度。

1.3.1 單因素試驗 (1)纖維素酶質(zhì)量濃度對原生質(zhì)體分離的影響。設置酶解液中纖維素酶質(zhì)量濃度分別為5，10，15，20，25，30 g/L，離析酶質(zhì)量濃度為6 g/L，甘露醇濃度為0.6 mol/L，酶解4 h后測算原生質(zhì)體產(chǎn)量和破損率。

(2)離析酶質(zhì)量濃度對原生質(zhì)體分離的影響。設置酶解液中離析酶質(zhì)量濃度分別為5，10，15，20，25，30 g/L，纖維素酶質(zhì)量濃度為20 g/L，甘露醇濃度為0.6 mol/L，酶解4 h后測算原生質(zhì)體產(chǎn)量和破損率。

(3)甘露醇濃度對原生質(zhì)體分離的影響。設置酶解液中纖維素酶質(zhì)量濃度為20 g/L，離析酶質(zhì)量濃度為5 g/L，甘露醇濃度分別為0.4，0.6，0.8 mol/L，酶解4 h后測算原生質(zhì)體產(chǎn)量和破損率。

1.3.2 正交試驗 單因素試驗確定了紫薇原生質(zhì)體的最適甘露醇濃度及纖維素酶、離析酶的質(zhì)量濃度范圍，但原生質(zhì)體產(chǎn)量較小，不能滿足轉化試驗的要求。為提高分離效率，參考其他物種的分離條件[16,21-23]，本試驗在原有酶解液中添加果膠酶，進行正交試驗。在甘露醇濃度為0.6 mol/L的條件下，以纖維素酶、離析酶、果膠酶質(zhì)量濃度為影響因子，設計3因素3水平正交試驗，將紫薇酶解處理后在黑暗條件下培養(yǎng)5 h，測算原生質(zhì)體產(chǎn)量和破損率，確定分離紫薇葉片原生質(zhì)體的最優(yōu)組合。試驗因素與水平見表1。

表1 紫薇葉片原生質(zhì)體分離條件篩選正交試驗設計的因素與水平

1.4 原生質(zhì)體的制備

原生質(zhì)體的制備參考包菲等[24]的方法進行，并作部分修改。取葉片0.1 g，用刀片去掉葉片的尖部、尾部和中脈，把葉片切成0.1～0.3 mm寬的長條，浸入酶解液中，放入真空泵中遮光抽真空30 min，然后置于50 r/min的搖床上室溫遮光酶解。酶解完成后，在酶解液中加入等體積W5溶液(154 mmol/L NaCl，125 mmol/L CaCl2，5 mmol/L KCl，2 mmol/L MES，pH 5.7)終止反應，將混合物用75 μm的細胞篩過濾至50 mL離心管中，水平冷凍離心機(4 ℃)500 r/min離心5 min，去除上清液，收集管底的原生質(zhì)體，洗滌2次。向清洗后的原生質(zhì)體中加入10 mL W5溶液冰上靜置30 min，500 r/min離心5 min后，去除上清液，以0.5 mL 轉化懸浮液(0.6 mol/L甘露醇，15 mmol/L MgCl2，4 mmol/L MES)重懸原生質(zhì)體。

吸取原生質(zhì)體20 μL，用血球計數(shù)板計測原生質(zhì)體產(chǎn)量(g-1)，每樣品計數(shù)3次，計算公式[25]為：原生質(zhì)體產(chǎn)量=(16個中方格內(nèi)的原生質(zhì)體數(shù)/0.1×500)/葉片質(zhì)量。16個方格的總體積為 0.1 mm3。原生質(zhì)體破損率=視野內(nèi)破裂原生質(zhì)體數(shù)/原生質(zhì)體總數(shù)×100%。

1.5 原生質(zhì)體轉化

吸取200 μL純化的原生質(zhì)體放入2 mL的圓底離心管，加入10～20 μg pSuper1300::GFP質(zhì)粒，輕輕混勻后，加入等體積的PEG溶液(4 g PEG-4000，2.5 mL 0.8 mol/L的甘露醇，1 mL 1 mol/L的CaCl2，3 mL ddH2O)，混勻后室溫靜置15 min，加入800 μL W5溶液混勻漂洗，以100 r/min離心3 min，去除上清液后，再次加入1 mL W5溶液漂洗，100 r/min離心3 min，去除上清液，并加入1 mL W5溶液重懸原生質(zhì)體，轉移至細胞培養(yǎng)皿中，在22 ℃避光條件下培養(yǎng)14 h后，在激光共聚焦熒光顯微鏡下進行觀察[26]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 26軟件中的一般線性模型對試驗數(shù)據(jù)進行顯著性分析和多重比較，使用Excel軟件對試驗數(shù)據(jù)進行極差分析，使用Origin 2021軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同紫薇品種的原生質(zhì)體分離效果

在3種酶解液條件下，‘Ebony Embers’和‘Pocomoke’均未分離出完整的原生質(zhì)體；S047株系除第1，5，6組合外，其他處理均可正常分離出完整的原生質(zhì)體，產(chǎn)量為(0.03×105)～(1.01×105) g-1(表2)。

表2 3種酶解液下紫薇S047的原生質(zhì)體數(shù)量

在‘Ebony Embers’酶解過程中產(chǎn)生大量黏稠物質(zhì)，對黏稠物質(zhì)鏡檢發(fā)現(xiàn)，其中有少部分完整的原生質(zhì)體，但過濾后溶液中沒有游離的原生質(zhì)體(圖1-a、b和c)；‘Pocomoke’葉片在酶解10～30 min時出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，并在后續(xù)酶解過程中持續(xù)褐化(圖1-d)；S047株系分離溶液呈明亮綠色(圖1-e)。

a，b，c.紫薇品種‘Ebony Embers’；d.紫薇品種‘Pocomoke’；e.S047株系

鑒于‘Ebony Embers’和‘Pocomoke’在上述3種酶解液條件下未分離出原生質(zhì)體，故繼續(xù)提高酶解液中纖維素酶和離析酶質(zhì)量濃度，使其質(zhì)量濃度分別為25，50，75 g/L，甘露醇濃度為0.6 mol/L，分別酶解3，5，7 h，結果仍未分離出完整的原生質(zhì)體。綜上可知，分離原生質(zhì)體的最適紫薇品種為S047株系。

2.2 紫薇葉片原生質(zhì)體分離條件的初步篩選

纖維素酶質(zhì)量濃度對紫薇葉片原生質(zhì)體分離的影響結果見圖2。由圖2可知，以S047葉片為材料，不同纖維素酶質(zhì)量濃度處理的原生質(zhì)體產(chǎn)量有較大差異，為(0.13×105)～(2.90×105) g-1，當纖維素酶質(zhì)量濃度為20 g/L時，原生質(zhì)體產(chǎn)量最高；當纖維素酶質(zhì)量濃度為15 g/L時，原生質(zhì)體破損率最低。綜合分析表明，S047較合適的纖維素酶質(zhì)量濃度為15～20 g/L。

圖2 纖維素酶質(zhì)量濃度對紫薇葉片原生質(zhì)體分離的影響

離析酶質(zhì)量濃度對紫薇葉片原生質(zhì)體分離的影響結果見圖3。由圖3可知，離析酶質(zhì)量濃度也影響了紫薇葉片原生質(zhì)體產(chǎn)量，為0～(3.11×105) g-1，當離析酶質(zhì)量濃度為5～15 g/L時原生質(zhì)體產(chǎn)量較高。當離析酶質(zhì)量濃度為5 g/L時原生質(zhì)體破損率最低，僅為20%；當離析酶質(zhì)量濃度大于5 g/L時，原生質(zhì)體破損率總體呈增大的趨勢，在其質(zhì)量濃度為30 g/L時，破損率達到100%。綜合分析發(fā)現(xiàn)，S047適宜的離析酶質(zhì)量濃度為5～10 g/L。

甘露醇對紫薇葉片原生質(zhì)體分離的影響結果見圖4。由圖4可知，當甘露醇濃度為0.6 mol/L時，原生質(zhì)體產(chǎn)量最高，為5.5×105g-1，破損率最低。綜合分析發(fā)現(xiàn)，0.6 mol/L為甘露醇最適濃度。

圖4 甘露醇濃度對紫薇葉片原生質(zhì)體分離的影響

2.3 紫薇葉片原生質(zhì)體分離最優(yōu)條件的確定

紫薇葉片原生質(zhì)體分離條件篩選正交試驗結果如表3所示。由表3可知，處理2(10 g/L纖維素酶、5 g/L離析酶、4 g/L果膠酶)的原生質(zhì)體分離效果最好，產(chǎn)量為28×105g-1，破損率為 14%。極差分析結果(R值)顯示，3種酶對原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響由大到小表現(xiàn)為離析酶>纖維素酶>果膠酶。方差分析及多重比較結果表明，3種酶對試驗結果均有顯著或極顯著影響(表4)。因此確定，分離紫薇葉片原生質(zhì)體的最適酶解液成分為：10 g/L纖維素酶，5 g/L離析酶，4 g/L果膠酶。

表3 紫薇葉片原生質(zhì)體分離條件篩選正交試驗結果

表4 紫薇葉片原生質(zhì)體分離條件篩選正交試驗方差分析結果

2.4 紫薇葉片原生質(zhì)體的瞬時轉化

利用獲得的紫薇葉片原生質(zhì)體，將連有綠色熒光蛋白GFP的pSuper1300::GFP載體通過PEG介導法進行轉化，在熒光共聚焦顯微鏡下觀察到明顯的綠色熒光信號(圖5)，表明分離得到的葉片原生質(zhì)體可應用于基因的瞬時轉化。

A．明場；B．葉綠體自發(fā)熒光；C．綠色熒光蛋白(GFP)；D．融合場

3 討 論

影響原生質(zhì)體分離效果的因素很多，包括植物材料、酶的組成和質(zhì)量濃度、滲透壓、酶解時間等。本研究以3種紫薇的嫩葉作為材料分離原生質(zhì)體，發(fā)現(xiàn)‘Ebony Embers’在酶解過程中出現(xiàn)黏稠物質(zhì)，阻礙了原生質(zhì)體的釋放。陳彥[27]發(fā)現(xiàn)，部分紫薇品種葉片中含有多糖類物質(zhì)，據(jù)此筆者推測本研究‘Ebony Embers’酶解過程中黏稠物質(zhì)可能為多糖類物質(zhì)，其會將原生質(zhì)體裹挾，導致原生質(zhì)體無法釋放至酶解液中。本研究發(fā)現(xiàn)，紫薇‘Pocomoke’酶解時會逐漸褐化。陳林等[28]研究表明，紫薇中有大量的多酚類物質(zhì)。劉艷麗等[29]發(fā)現(xiàn)，茶樹(Camelliasinensis)原生質(zhì)體分離過程中會出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，利用交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP)可以有效緩解茶樹葉片中酚類物質(zhì)的氧化。后續(xù)在紫薇原生質(zhì)體分離中，也可使用PVPP，探究其對褐化的影響。S047株系原生質(zhì)體分離過程中沒有出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，分離溶液呈明亮綠色，可以得到完整的原生質(zhì)體?？梢姡煌限逼贩N原生質(zhì)體分離需要的條件各異，應針對不同的品種建立不同的分離體系。

在原生質(zhì)體提取過程中，酶的組成及質(zhì)量濃度是影響分離效果的關鍵，不同物種所需要的酶的種類和質(zhì)量濃度不同。如在分離茶樹[29]、毛果楊(Populustrichocarpa)[26]、穿心蓮(Andrographispaniculata)[30]、甘藍(Brassicaoleracea)[31]等原生質(zhì)體時所需酶的種類為纖維素酶和離析酶，而水曲柳(Fraxinusmandshurica)葉片原生質(zhì)體的分離則要用到纖維素酶、離析酶和半纖維素酶[32]，三七(Panaxnotoginseng)原生質(zhì)體的制備則需要纖維素酶和果膠酶[33]。由以上研究可知，纖維素酶是分離原生質(zhì)體不可或缺的條件，相對于果膠酶、半纖維素酶和離析酶,其應用更加廣泛。本研究單因素試驗確定，甘露醇0.6 mol/L、纖維素酶10～20 g/L、離析酶5～10 g/L為紫薇葉片原生質(zhì)體分離的適宜條件。為提高酶解效率，本研究后續(xù)試驗在酶解液中引入果膠酶，在甘露醇為0.6 mol/L條件下，設計正交試驗篩選酶解液組成，最終得出10 g/L纖維素酶、5 g/L離析酶、4 g/L果膠酶為最適酶解液組成，此條件下原生質(zhì)體產(chǎn)量為28×105g-1，破損率為14%。

去除細胞壁后的原生質(zhì)體更易轉入外源DNA序列，是進行瞬時轉化的良好材料，現(xiàn)在較常用的轉化方法有PEG介導法、電穿孔和顯微注射法等[34]。本研究采用PEG介導的方法成功地將外源質(zhì)粒pSuper1300::GFP轉入紫薇原生質(zhì)體，表明分離得到的原生質(zhì)體可以應用于紫薇外源DNA的瞬時轉化，為后續(xù)研究提供了基礎。本研究對紫薇原生質(zhì)體轉化進行了初步探究，在培養(yǎng)過程中出現(xiàn)原生質(zhì)體破損現(xiàn)象，導致轉化細胞直徑僅約有10 μm，影響轉化效率，這可能與轉化培養(yǎng)過程中的滲透壓有關。有研究發(fā)現(xiàn)，在棉花葉片原生質(zhì)體轉化過程中，等滲溶液的轉化效率高于低滲溶液[35]，這對紫薇原生質(zhì)體轉化效率的提高提供了參考。

綜上所述，本研究篩選出分離紫薇葉片原生質(zhì)體的酶解體系為：以10 g/L纖維素酶、5 g/L離析酶、4 g/L果膠酶和0.6 mol/L甘露醇配制酶解液，在黑暗條件下酶解5 h，在此條件下原生質(zhì)體的產(chǎn)量為28×105g-1。分離的紫薇葉片原生質(zhì)體可進行瞬時轉化，這為紫薇分子生物學研究提供了技術支持。